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方法文章

磷-31磁共振波谱法用于温度控制下心脏保存期间心肌能量代谢的连续测量

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DOI：

10.3791/70070

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2026年3月17日

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1Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Division of MR Research, Russell H. Morgan Department of Radiology and Radiological Science, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Krieger School of Arts and Sciences, Johns Hopkins University, 4Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pediatric Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文中，我们描述了一种可重复的、温度可控的实验方案 离体 磷-31 磁共振波谱法，可实现器官保存期间心肌能量学的连续定量评估。

摘要

可靠的器官保存对于增加供体可用性和改善移植预后至关重要。尽管静态保存仍是供心的常规标准，但仍需要精确的方法来监测保存过程中心肌的能量代谢状态。

磷-31磁共振波谱学（31磷磁共振波谱（P MRS）能够直接、动态地测量关键能量代谢物，包括磷酸肌酸（PCr）、三磷酸腺苷（ATP）、无机磷酸盐（Pi）以及细胞内pH值。该技术可实现对心肌代谢状态进行纵向、定量且精确的评估。 离体 储存。MRS 的优势包括对能量状态进行动态评估以及对心室能量进行整体评估。

该方案首先进行猪供体的获取、施用心脏停搏液以及心脏切除。在头臂干近端切断主动脉弓，以最大限度延长升主动脉的长度。将一根带肋的导管固定于升主动脉远端，标记左心房后，将心脏置于一个预先充满特定温度心脏停搏液的圆柱形隔热容器中。容器盖与导管相连，使心脏悬置于容器内，随后密封容器，保持温度在1 °C范围内持续1小时。

将容器放入定制的泡沫塑料盒中，盒上设有用于磷调谐线圈的开口，使线圈中心与左心室（LV）中心对齐。定位图像确认左心室位于31P线圈附近。进行B0匀场以确保激发均匀，随后采集非局部化的31P磁共振波谱。通过后处理识别谱峰，用于计算PCr/ATP、PCr/Pi比值以及细胞内pH。

在本方案中，31P 磁共振波谱（MRS）在 0 至 8 小时的连续时间点进行。在各时间点之间，心脏保存在标准储存装置中，并维持在目标温度。

31P 磁共振波谱（MRS）使我们能够研究能量耗竭随时间变化的动态过程，以及储存温度在减缓随时间推移的能量耗竭中所起的作用。

引言

对于部分终末期心力衰竭患者而言，心脏移植仍是确定的治疗手段1。然而，合适的供体器官持续短缺以及现有保存策略的局限性，严重制约了移植效果的优化和供体器官的可及性2,3。传统上，供体心脏采用冷静态保存法，该方法操作简便且成本较低，但在长时间运输过程中易导致亚临床水平的能量耗竭2,4。随着越来越多的移植项目接受风险较高或地理距离较远的供体器官，临床迫切需要客观的工具来评估心脏在保存期间的心肌代谢状态，而不仅仅依赖缺血时间和肉眼检查5,6,7。此外，心肌代谢和缺血耐受能力受温度影响显著，保存过程中冷却不足或过度低温均可能加剧能量耗竭和细胞损伤。因此，在多个具有临床相关性的保存温度下评估供体心脏，有助于识别随时间推移最有利于维持心肌活力的保存条件3。

在器官保存期间对心肌生物能量学进行准确、动态的评估，对于改进保存技术并最大限度提高器官利用率至关重要。目前的标准做法是将器官置于约4-8 °C的静态低温保存环境中8。尽管该方案在短期保存中已显示出良好的效果，但在此温度下长时间保存可能损害心肌完整性。因此，必须在不同温度和保存时间条件下连续监测代谢活性，以明确实现成功器官移植所需的最优保存条件。传统对保存损伤的评估通常依赖于心肌活检组织的组织学检查或生化检测，这些方法具有侵入性和破坏性，且仅能提供间歇性、局部性的组织状态快照9。相比之下，磷-31磁共振波谱法（31P MRS）是一种强大且非破坏性的检测手段，能够在完整的心脏组织内直接、连续地测量关键能量代谢物，包括磷酸肌酸（PCr）、三磷酸腺苷（ATP）、无机磷酸盐（Pi）以及细胞内pH值6,10,11,12。由于可在同一器官中进行多次测量而无需额外处理组织，31P MRS能够提供关于心肌能量状态的全局性和纵向性信息，相较于基于活检或血清替代指标的方法，显著提高了实验的精确性和可重复性6,13。

心脏移植物存活能力的评估 31Bernard 等人已对磷-31磁共振波谱（P MRS）进行了综述14. 此处提供一个详细的、温度可控的实验方案 离体 3 特斯拉 31猪心脏保存期间的³¹P磁共振波谱分析方法介绍。该方法为监测底物消耗、测试保存条件变量以及验证保存干预措施提供了一个实用框架。本方案特别适用于需要在静态低温保存期间进行连续的全心室测量的实验室，例如温度依赖性保存研究、缺血-再灌注损伤研究，或针对边缘供体及扩展标准供体心脏的保存液优化研究。

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方案

本方案遵循机构动物护理指南，并已获得约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准（方案编号 SW24M319），适用于涉及活体动物直至手术取材的所有操作。所有后续 离体 实验使用安乐死后获取的组织进行。

1. 采前处理步骤

  1. 将培养箱温度设置为目标保存温度以下 2 °C，并让培养箱稳定至少 2 小时。
  2. 将 6–7 个冰袋放入培养箱中进行预冷，确保冰袋数量充足，能够在运输过程中维持所需温度。
  3. 配制改良圣托马斯停搏液：
    1. 在 1 L 乳酸林格氏液袋中加入
      1. 30 mL 8.4% 碳酸氢钠
      2. 5 mL 30 mmol/10 mL 氯化钾
      3. 2.5 mL 20 mmol/10 mL 硫酸镁
      4. 15 mL 50% 葡萄糖
      5. 100 mg 50 mg/10 mL 硝酸甘油
      6. 5000 U 冷冻促红细胞生成素
    2. 共配制 3 L 停搏液，并将其储存在预冷的培养箱中。
  4. 准备带有内置硅胶管的保温箱，以便精确调节心脏的垂直高度。在硅胶管上标记一条黑色参考线，位置应正对保温箱盖开口尖端的正下方。
  5. 准备一根带肋纹的套管，用于固定和悬挂获取的心脏。在套管外表面标记一条黑色参考线，作为可重复对齐的定位点。

2. 收获步骤

  1. 使用替拉唑、氯胺酮和赛拉嗪混合于单支注射器中，通过肌内注射对动物进行镇静，以尽量减少多次注射带来的应激和疼痛。
    1. 替拉唑（每剂含替来他明 50 mg 和唑拉西泮 50 mg），每种成分剂量为 4.4 mg/kg。
    2. 氯胺酮剂量为 2.2 mg/kg。
    3. 赛拉嗪剂量为 2.2 mg/kg。
  2. 对动物进行气管插管并实施麻醉。
    1. 潮气量设定为 5–10 mL/kg。
    2. 呼吸频率设定为 12–15 次/分钟。
    3. 呼气末正压设定为 5 cm H2O。
    4. 吸入异氟烷浓度为 0.5–2%，氧气流速为 1–2 L/min。
  3. 建立外周静脉通路，行胸骨正中切开术并打开心包15。必要时给予抗心律失常药物。
  4. 将停跳液针插入升主动脉，位置应位于主动脉瓣上方、主动脉弓下方。
  5. 将1升停跳液袋穿刺后连接至停跳液针。
  6. 开放左心房、下腔静脉和上腔静脉进行排气。
  7. 在主动脉弓近端施加主动脉阻断钳。
  8. 以约 75–80 mmHg 的压力开始经冠状动脉灌注停跳液。使用管路内压力表监测压力。
  9. 在保持解剖结构完整的前提下取出心脏。
  10. 将预冷的生理盐水倾倒在离体心脏表面，以快速降温。
  11. 将心脏置于盛有冷停跳液的容器中。
  12. 在心脏心尖部插入心肌温度探头，并将温度计插入停跳液容器中以监测温度。
  13. 分离主动脉与肺动脉（PA）。
  14. 使用丝线和扎带将带肋纹的套管固定于主动脉，确保套管上的标记部分对应左心室（LV）的位置。
  15. 向冷藏箱中加入圣托马斯溶液至其容量的 60–70%，然后将心脏及容器中的溶液转移至冷藏箱中直至完全充满，以最大程度浸没组织。
  16. 测量并记录最终溶液和组织的温度。
  17. 将带肋纹的套管通过硅胶管在预设标记处连接至冷藏箱盖。确保带肋纹套管与硅胶管上的标记对齐，使得当冷藏箱关闭时，左心室相对于箱盖保持一致的方向，从而保证每次扫描时左心室位置的可重复性（图 1A）。
  18. 对器官进行排气，以确保磁共振成像过程中磁场均匀性良好，并获得较高的信噪比。
  19. 固定冷藏箱盖，确保左心室对齐。
  20. 将冰袋和冷藏箱放入运输包中。

3. 光谱分析实验方案

  1. 本方案针对3T磁共振扫描仪进行了优化。该磁共振扫描仪配备多核磁共振波谱选项，包括一个4 kW宽带射频放大器和接收器，以及厂商提供的标准磷-31射频线圈（P140）。 31P线圈是一个直径为14 cm的单环发射/接收线圈，配有用于调谐和匹配的两根调节杆。
  2. 在运输前通知MRI设施工作人员，并确认扫描可用性。
  3. 准备一个聚苯乙烯泡沫箱，其外部尺寸如下：长度 33.5 cm，宽度 28 cm（长边），宽度 23 cm（短边），厚度 4 cm。在箱子的一侧开一条宽 3.3 cm 的切口，以便放置 31心脏附近的P线圈（图1B).
  4. 将装有悬浮心脏的冷却器插入线圈中心轴附近，对准左心室（LV）位置（图1C）。准备一个高25.4 cm、宽11.4 cm的冷却装置。硅胶管固定在盖子内表面距离心脏安装位置7 cm处图1D).
  5. 将冰袋放置于冷藏箱周围的空隙中，注意避免冷藏箱与线圈之间产生间隙，然后用胶带固定箱盖以确保扫描过程中的稳定性（图1E).
  6. 使用激光引导和中心定位标志将冷却器对准磁体等中心，以确保最佳的B0 均一性图1F).
  7. 插入 31将P线圈接入扫描连接器，并将调谐杆和匹配杆连接到线圈上（图1F).
  8. 获取三平面定位像以确认线圈位置及左心室（LV）的最佳邻近性 31P线圈（P coil）图2).
  9. 如果左心室位置不正确，旋转冷却器盖并重新运行定位扫描。
  10. 获取静态磁场 B0用于局部 2 的图谱nd 调节匀场16 以确保在感兴趣区域内具有高光谱质量所需的均匀磁场：
    1. 获取B后0-地图，一种“Shimtool”16 自动启动并加载该地图（图3).
    2. 所有切片中围绕心肌的平滑多边形的点击点图3A).
    3. “Shimtool” 随后执行约束最小二乘拟合，以确定局部共振频率以及一阶（x, y, z）和二阶（xy, xz, yz, x2-y2，z2-(x2+y2)/2) 垫片磁场校正 (图3C）。将这些校正参数上传至扫描仪，并将其应用于后续扫描。
  11. 在此之前 31P MRS 数据采集过程中，转动线圈的调谐杆，以确保射频线圈达到最佳调谐状态，并使其阻抗与磁共振系统匹配，从而最大限度提高信号传输效率，并减少射频系统中的信号反射图4).
  12. 获取初始非定位的 31P核磁共振谱（重复时间[TR]：10 s，翻转角 = 90°，采用绝热B1-不敏感旋转-4（BIR-4）脉冲；回波时间[TE] = 0.1 ms；带宽 = 3000 赫兹（Hz）；1024 个谱点，5 次平均）以确定磷酸肌酸（PCr）与三磷酸腺苷γ峰（γ-ATP）之间中心位置的共振频率。总采集时间：50 秒。
  13. 然后获取完全松弛的非局域化 31基于3.12节计算结果调整偏置频率后的³¹P MR波谱（TR：16 s，翻转角 = 90°，采用绝热BIR-4脉冲；TE = 0.1 ms；带宽 = 3000 Hz；512个谱点，累加20次）。总采集时间：5分20秒。
  14. 扫描后，测量液体和心肌温度，确保与目标值的偏差不超过 ±1 °C。
  15. 将心脏置于培养箱中，在设定温度下保存，直至下一次计划扫描。

4. 数据分析

  1. 导出完全弛豫的结构 31P MRS 数据以 .SDAT 数据文件格式保存，并加载至图形用户界面进行处理（图5A)17.
  2. 首先，使用15 Hz洛伦兹滤波器对谱图进行加窗处理（图 5B），然后应用 0 和 1st 一级相位校正，并将频率设定为磷酸肌酸（PCr）峰中心处的0 ppm图5C).
  3. 使用 AMARES 函数拟合光谱18 使用所列出的知识值 表1.
  4. 在下一个窗口中检查分析结果，确保拟合充分图6），通过确保每个峰被正确识别（各组分）以及分析后残留信号最小（残留物）。
  5. 根据波谱峰幅值计算心肌代谢物比值 PCr/ATP 和 PCr/Pi图7γ-ATP共振峰被用作ATP的检测指标。
  6. 根据Pi与PCr之间的化学位移，在校正后计算细胞内pH值，以反映温度条件14.
    注意：每次 MRI 扫描后（步骤 3.15）均可暂停本方案。确保全程维持温度控制。

5. 方程

  1. 按照先前所述方法计算细胞内 pH 值（pHi）19：
    pHi 计算的热力学方程；涉及温度、对数函数；公式分析。
    其中 T 为温度（单位：°C），δ0 为 PCr 与 Pi 共振峰之间的实测化学位移差（单位：ppm）。

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结果

局部的 2nd 调节匀场16 导致更均一的 B0 在感兴趣区域内，磁场的均匀性得到改善，表现为每个时间点的标准差降低（0 h：14.0 至 4.0 Hz；4 h：17.5 至 3.2 Hz；8 h：16.0 至 3.2 Hz）。这确保了在每个时间点均获得了优良的谱图质量。图7）。心肌代谢在期间的变化 离体 冷保存表明高能磷酸盐储备迅速耗尽，并随时间推移发生进行性细胞内酸化。在所有检测参数中，包括PCr/ATP、PCr/Pi和细胞内pH值，静态冷保存最初4小时内下降最为显著，反映出此早期保存阶段代谢脆弱性显著升高。此后，损伤以较缓慢的速度持续进展至8小时，此时能量储备接近最低水平，并观察到明显的酸中毒现象。图8).

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讨论

本文描述了一种外科手术准备方法及一种 31用于心脏保存期间心肌能量代谢连续评估的磷-31磁共振波谱（31P MRS）数据采集与分析方案 31P MRS 可在不同低温保存温度下对关键心肌代谢物进行连续、无创的评估，从而为心肌组织的代谢活性提供新的见解。这 31P MRS 检测方案相对较快，所需扫描时间短，可在显著组织温度变化发生前完成心脏能量代谢的评估。该方法可适用于其他大型动物模型，并可拓展至灌注组织 离体 针对移植后能量代谢的平台或干预措施

本方案中的关键步骤包括在收获和扫描后阶段精确监测温度，因为将心肌温度维持在严格限定的范围内，对于保持代谢活性和确保可重复的磁共振（MR）结果至关重要。此外，必须确保心脏已完全排尽空气，以保证最佳的MR磁场均匀性；因此，心脏中任何残留的气泡都会干扰B0场，降低信噪比。左心室（LV）与磷-31线圈的对齐也极为关键；若在两次扫描之间重新定位时出现偏差，可能导致数据丢失或需要额外操作，从而增加组织意外升温的风险...

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披露

我们不存在任何利益冲突。

致谢

我们希望感谢约翰斯·霍普金斯大学心脏外科和放射科团队，他们为成功开展本研究提供了帮助。本研究由美国胸外科协会（AATS）提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养箱Benchmark Scientific H2265-HCMyTemp 65HC 加热制冷培养箱
保温冷藏箱GatoradeUPC 052000047097Gatorade 保温运动饮料冷藏箱
jMRUI 版本 7.0Javawww.jmrui.eu用于数据分析的图形用户界面
心肌温度探针DeRoyal81-030415DeRoyal 400 系列心肌温度探针（15 mm）
磁共振扫描仪Philipshttps://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingAchieva 3T，Philips Healthcare
单环磷线圈Philips Healthcare https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingP140，Philips Healthcare

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