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方法文章

通过网络药理学和蛋白质组学探讨三节通脉方抗动脉粥样硬化的机制

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DOI：

10.3791/70080

⸱

2026年4月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, the Third Affiliated Clinical Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 2Department of Respiratory, The Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 3The Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

本研究证实，三结通脉方通过调控Hsd11b1介导的糖皮质激素代谢，减轻ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化，从而改善血脂异常和血管炎症。整合网络药理学、蛋白质组学和分子对接分析揭示了该方剂抗动脉粥样硬化作用的多成分、多靶点协同机制。

摘要

本研究旨在阐明三节通脉方（SJTMF）对抗动脉粥样硬化（AS）的机制，AS是导致心血管疾病发病的主要原因。利用ApoE-/-小鼠模型，我们证实SJTMF可显著抑制AS斑块的进展。通过整合网络药理学与蛋白质组学策略，鉴定出五种核心生物活性成分：β-谷甾醇、柚皮素、木犀草素、异鼠李素和3β-羟基-24-亚甲基-8-羊毛甾烯-21-酸。同时，蛋白质组学分析揭示了129种与AS相关的差异表达蛋白。分子对接结果证实，这些成分与关键靶点Hsd11b1之间存在高亲和力的结合相互作用，其结合能均低于-5 kcal/mol。机制研究表明，SJTMF可能通过调控Hsd11b1介导的糖皮质激素代谢发挥作用。该调控作用显著改善了血脂异常和血管炎症，从而抑制AS的发展。综上所述，本研究首次揭示了中药复方通过多成分协同调控Hsd11b1靶点发挥抗AS作用的创新机制，为治疗干预提供了新的见解。

引言

动脉粥样硬化（AS）是一种累及全身血管系统的慢性炎症性疾病，是心脑血管事件的主要病理基础1。其发病机制涉及遗传、环境、心理社会因素及多种病理因素之间的复杂相互作用，具有多阶段和多基因特征。尽管目前的治疗策略——特别是他汀类药物和前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）抑制剂等降脂药物——能有效降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，但仍无法完全消除驱动心血管事件复发的残余炎症风险2。此外，治疗相关不良反应（如新发糖尿病、肌毒性、肝肾功能损害）限制了降脂治疗的长期应用和强化使用3,4。这些局限性凸显了需要采用可直接靶向血管炎症的补充性治疗策略（包括抗炎治疗），以在降脂之外进一步降低心血管风险。

在传统中医（TCM）中，动脉粥样硬化（AS）属于“胸痹”和“脉积”的范畴，其中“痰瘀互结”被认为是其核心病机。在“化瘀利水”理论指导下，本研究团队研发了由14味中药组成的“三解通脉方（SJTMF）”，其中包括丹参（Salvia miltiorrhiza）和水蛭（Whitmania pigra Whitman），旨在协同化痰浊、消瘀滞、促利水。初步临床研究表明，三解通脉方（SJTMF）可显著改善老年颈动脉粥样硬化患者血脂水平，并稳定或逆转动脉粥样硬化斑块5。实验研究进一步揭示，该方可通过调控巨噬细胞极化及自噬通路来抑制动脉粥样硬化的进展6,7。然而，中药复方具有多成分、多靶点、多通路的特点，采用传统的还原论方法难以系统阐明其整合调控机制。

为了探究介导SJTMF抗动脉粥样硬化作用的分子机制并应对相关挑战，本研究采用了一种多学科整合的研究策略。网络药理学方法由Hopkins提出8,9，被用于构建多维的“中药成分-靶点-疾病通路”网络，从而预测SJTMF的主要活性化合物及其干预动脉粥样硬化（AS）的潜在治疗靶点，这一方法契合中医整体调控的特点。在此基础上，蛋白质组学技术利用高通量、高精度的蛋白质定性与定量分析能力10，动态监测SJTMF干预动物模型后AS相关蛋白表达谱的变化，进而识别关键效应分子和信号事件，为机制研究提供实验依据。随后，通过高精度分子对接模拟，评估网络药理学预测的核心靶点与关键生物活性成分之间的结合模式和结合能，为潜在的成分-靶点相互作用提供理论支持11。与仅依赖网络药理学预测（易产生高假阳性率且缺乏实验验证）12，或仅结合蛋白质组学与分子对接（可能无法捕捉网络分析所预测的系统层面相互作用）等其他方法相比，该整合策略协同克服了这些固有的局限性13。

通过整合多维技术，本研究旨在系统阐明三黄汤膜剂的主要药效物质基础、核心靶点网络及多通路协同作用机制，从而为推进中医药现代化及创新药物研发提供基于机制的理论支持。

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方案

所有动物实验均经长春中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理审批号：2023521）。实验纳入无特定病原体（SPF）级雄性C57BL/6J和ApoE⁻/⁻小鼠（5周龄，18–22 g）（实验动物使用许可证号：SCXK（吉）2023-002 和 SCXK（苏）2021-0013）。试剂与仪器信息见材料表。

1. 网络药理学

  1. SJTMF活性成分与靶点的预测
    1. 筛选活性成分 丹参, Panax notoginseng, Artemisia scoparia, 茯苓, Alisma plantago-aquatica L, 砂仁, Santalum album L, Citrus aurantium，以及 柑橘皮 以口服生物利用度（OB）≥ 30 % 和类药性（DL）≥ 0.18 为筛选标准。
    2. 筛选活性成分 Whitmania pigra Whitman, Bombyx batryticatus, 蝉蜕, 竹茹，以及 Ophicalcitum 通过应用Lipinski五规则对药材进行筛选，筛选参数如下：miLogP ≤ 5，nOHNH ≤ 5，nOH ≤ 10。
    3. 将筛选出的化合物与其SMILES码结合，以预测化合物作用靶点。
      注：有关上述两个数据库的详细信息，请参见 材料表.
  2. AS相关靶点的预测及网络构建 "药物-成分-靶点" 网络
    1. 使用 GeneCards 数据库，通过标准化的疾病术语检索动脉粥样硬化相关疾病靶点。
    2. 使用 Venny 2.1 软件鉴定 SJTMF 与 AS 的交集靶点，作为 SJTMF 治疗 AS 的潜在治疗靶点。
    3. 使用 Cytoscape 3.9.1 构建网络 "药物-成分-靶点" 网络图
      注：有关上述数据库的详细信息，请参见 材料表.

2. 适应性驯化

  1. 将所有小鼠饲养于SPF级设施中（24 °C；50-60%湿度；12小时光照/黑暗循环），自由摄取标准饲料和水。实验前给予7天适应期。

3. SJTMF的制备

  1. 制备由14味药材组成的方剂： 丹参 （丹参）30 g， Artemisia scoparia (尹陈) 10 g, Panax notoginseng (三七) 10 g, 茯苓 茯苓 10 g， 砂仁 （砂仁）10 g， 泽泻 泽泻 30 g， Santalum album L （Tan Xiang）10 g 柑橘皮 （陈皮）10 g， Citrus aurantium （Zhi Qiao）10 g Whitmania pigra Whitman （水蛭）10 g， 蝉蜕 （蝉蜕）10 g， Bombyx batryticatus （Jiang Can）10 g 竹茹 （Zhu Ru）10 g，以及 Ophicalcitum （Hua Rui Shi）30 g
  2. 煎煮中药材料（共1,800 g）3次× 用8倍体积的蒸馏水（每次提取1.5小时）
  3. 经纱布和100目尼龙滤网过滤。
  4. 在60℃下浓缩滤液 °C（密度：1.23–1.27）。于70℃减压下干燥浓缩 °C.
  5. 将干燥提取物通过80目筛粉碎（得率：20.6 %）。
    注：依据先前发表的报告7，小鼠接受 3.56 g∙kg⁻¹∙天⁻¹ SJTMF提取物（按体表面积标准化）

4. 模型建立

  1. 采用12周高脂饮食（HFD；20%脂肪，1.25%胆固醇）诱导ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化（AS）模型。每7天测量一次体重，以进行代谢监测。
  2. 将C57BL/6J小鼠分配至对照组（Control，正常饮食+生理盐水）。将成功建模的小鼠随机分为四组：模型组、阿托伐他汀组（0.0026 mg/g阿托伐他汀）、SJTMF-L组（低剂量SJTMF，3.56 g∙kg-1∙day-1）、SJTMF-H组（高剂量SJTMF，7.12 g∙kg-1∙day-1）7。所有干预措施均于早晨通过标准化的0.4 mL灌胃给药，持续4周。
    注：SJTMF储备液的制备依据我们既定的实验方案7。实验干预从第9周开始，早晨给药以维持临床时间节律。当通过大体Oil Red O染色观察到主动脉中出现明显动脉粥样硬化斑块时，定义为建模成功7。

5. 样本采集、主动脉获取与保存

注意：经口灌胃给药4周后，禁食所有小鼠12小时（可自由饮水）。测量最终体重，然后在麻醉条件下通过颈椎脱位处死小鼠。

  1. 沿腹部切口至剑突处。
  2. 从主动脉根部至髂总动脉分叉处分离主动脉。
  3. 去除多余脂肪组织，并在主动脉弓远端约1 cm处横断主动脉。
  4. 将主动脉置于多聚甲醛中固定，或在液氮中速冻。
    注意：收集血清，并将主动脉组织储存在-80 °C，以备后续分析。
  5. 苏木精-伊红（HE）染色
    1. 将切片依次浸入二甲苯中，每次20分钟，共两次；然后转移至无水乙醇中，每次10分钟，共两次。通过递减浓度的乙醇系列（95%、90%、80%、70%）进行水化，每个浓度5分钟。
    2. 依次用0.4%苏木精染色3–8分钟，再用0.5%伊红溶液染色1–3分钟。
      注意：每步之间用蒸馏水充分冲洗。
    3. 通过递增浓度的乙醇系列（95%至无水乙醇）脱水，每个浓度5分钟。在二甲苯中透明，每次5分钟，共两次。完全空气干燥后，用中性树胶封片。
    4. 在显微镜下观察并采集图像。

6. 主动脉组织样本总蛋白的制备

注意：蛋白质来自三个实验组（对照组、模型组、SJTMF-H 组）的主动脉组织。

  1. 将主动脉组织在裂解缓冲液（1.5% SDS/100 mM Tris-HCl，pH 8.5）中匀浆，然后于95 °C孵育15分钟以实现蛋白质变性。
  2. 冷却样品后，在4 °C、12,000 × g条件下离心5分钟，收集上清液。采用丙酮沉淀法沉淀上清液中的蛋白质。
  3. 用8 M 尿素/100 mM Tris-HCl（pH 8.5）重新溶解蛋白质沉淀，然后按照试剂盒说明书配制BCA试剂并测定总蛋白浓度 参见材料表）。
    注意：为保证不同样品间蛋白量一致，用重悬溶液将所有样品补至相同体积。
  4. 使用TCEP和CAA在37 °C条件下进行蛋白质还原和烷基化反应，反应时间为1小时。
  5. 向蛋白质样品中加入胰蛋白酶（比例为1:50），于37 °C孵育24小时（参见材料表）。
  6. 使用三氟乙酸（TFA）调节pH至6.0以终止酶解反应。将样品在12,000 × g离心15分钟，然后使用自制SDB-RPS脱盐柱从上清液中纯化肽段（参见材料表）。
    注意：肽段洗脱液经真空干燥后，于-20 °C保存以备后续使用。

7. 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）

  1. 将200 ng肽段消化产物以1 µL进样量注入C18捕获柱（75 µm × 2 cm，3 µm，100 Å）中。随后在反相C18分析柱（75 µm × 15 cm，1.7 µm，100 Å）上以0.3 µL/min的流速进行肽段分离。
  2. 以含0.1%甲酸（FA）的水溶液作为流动相A，含0.1%甲酸的乙腈（ACN）作为流动相B（见材料表）。在0–12分钟内采用12%至30% B的线性梯度，随后在12–15分钟内从30%升至80% B，并在15–18分钟期间维持80% B以清洗色谱柱。在0–15分钟期间设定流速为0.300 µL/min，随后在16–18分钟期间提高至0.400 µL/min。毛细管电压设定为1500 V。
  3. 在100至1700 m/z范围内采集MS和MS/MS谱图。
  4. 在0.6至1.6 Vs/cm²范围内扫描离子淌度。设定累积时间和斜坡时间均为50 ms。

8. 蛋白质功能分析

注意：将蛋白质组学鉴定的差异表达蛋白（DEPs）与网络药理学预测的关键靶点取交集，筛选出共同的靶蛋白，并对其进行基因本体（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。以< 0.05 的 P 值作为判断功能类别和通路具有统计学显著性的标准。

  1. 以无谱库模式分析DIA原始数据。
  2. 将谱图文件与小鼠蛋白质序列数据库进行比对。
  3. 设置主要搜索参数。
    1. 启用前体离子生成选项，用于体外预测谱图库的生成。
    2. 指定酶切方式，并允许最多2个漏切位点（参见材料表）。
    3. 将半胱氨酸（C）的羧甲基化设为固定修饰。
    4. 将甲硫氨酸（M）的氧化和蛋白质N端乙酰化设为可变修饰。
    5. 将前体离子质量精度和MS1质量精度均设为15 ppm。
    6. 启用“跨运行匹配”（Match Between Runs）和启发式蛋白质推断功能。
    7. 将前体离子假发现率（FDR）阈值设为1%，以确保可靠鉴定。
  4. 运行DIA-NN（1.8.2 beta 11）分析。
    注意：使用DIA-NN进行蛋白质水平的定量分析，并使用R语言进行生物信息学分析与可视化。显著差异表达蛋白（DEPs）根据Student's t检验的P值及倍数变化阈值确定。

9. 分子对接

  1. 从 RCSB PDB 数据库下载目标蛋白的三维晶体结构，并以 PDB 格式保存；同时从 PubChem 数据库下载 SJTMF 核心活性成分的分子结构，并以 SDF 格式保存。
  2. 使用 PyMOL 2.6.0 对目标蛋白结构进行去水和加氢处理，去除无关的内源性配体，并将处理后的蛋白结构以 PDB 格式保存；通过 PyMOL 的 Getbox 插件获取对接口袋参数，网格盒参数设置如下：center_x = -7.2，center_y = 53.4，center_z = 30.6，size_x = 73.7，size_y = 85.9，size_z = 67.2，对接构象数 num_modes = 10。
  3. 将处理后的目标蛋白文件和 SJTMF 核心化合物文件分别导入 AutoDock Tools 1.5.6，转换为 PDBQT 格式，然后基于上述定义的网格盒参数，使用 AutoDock Vina 1.1.2 进行分子对接。
  4. 使用 PyMOL 可视化分子对接结果。

10. 统计学

  1. 进行统计分析。
  2. 结果以均值 ± 标准差（SD）表示。
  3. 当数据符合正态性和方差齐性时，在单因素方差分析后采用 Tukey's Honest Significant Difference (HSD) 检验进行事后分析；对于方差非齐性数据，则采用 Games-Howell 检验。认为p<0.05 具有统计学显著性。
  4. 使用 GraphPad Prism8.0.2 进行数据可视化。

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结果

SJTMF 抑制 ApoE-/- 小鼠动脉粥样硬化斑块的形成
为研究 SJTMF 对动脉粥样硬化（AS）的抑制作用，采用 ApoE-/- 小鼠模型监测体重变化，并观察主动脉的组织病理学改变。与模型组相比，SJTMF 干预减轻了高脂饮食喂养的 ApoE-/- 小鼠的体重增加（图 1A）。具体而言，不同剂量的 SJTMF 在给药第 2 周时即显示出降低体重的趋势。至第 4 周时，SJTMF 高剂量组和阿托伐他汀组小鼠的体重显著低于模型组（P < 0.05）。

苏木精-伊红（HE）染色（图1B）显示，对照组主动脉内膜光滑，中膜完整；而模型组标本可见明显的动脉粥样硬化斑块（黑箭头）、胆固醇裂隙（蓝箭头）及炎性细胞浸润（红箭头）。与模型组小鼠相比，SJTMF治疗组主动脉炎症反应...

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讨论

尽管先前的研究已表明，SJTMF 在 ApoE 缺陷小鼠中具有抗炎作用并可诱导巨噬细胞极化⁻/⁻ 小鼠模型6,7，其抗动脉粥样硬化的具体分子机制仍不明确。 "不同疾病采用相同治疗方案" 传统中医理论的原理源于多成分、多靶点、多通路协同调控的作用特点。网络药理学因其整体性、系统性和全面性的特征，与这一治疗理念高度契合，为阐释中药的作用机制提供了新的研究策略15,16为此，我们采用网络药理学与蛋白质组学整合分析，以阐明SJTMF抗AS的作用机制。

通过网络药理学分析，我们鉴定了五种关键化合物，可能是SJTMF中具有抗动脉粥样硬化（AS）活性的潜在有效成分：β-谷甾醇、柚皮素、木犀草素、异鼠李素以及3β-羟基-24-亚甲基-8-羊毛甾烷-21-酸。其中，β-谷甾醇是最丰富的植物甾醇，可通过抗氧化和抗炎通路在心血管调节中...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由吉林省自然科学基金（编号：YDZJ202401644ZYTS）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-氯乙酰胺（CAA）Sigma-AldrichC0627-100G
4% 多聚甲醛固定液国药集团化学试剂有限公司80096618
0.5–10 µL 微量移液器eppendorf4924000029
10 – 100 µL 微量移液器eppendorf4924000053
20 – 200 µL 微量移液器eppendorf4924000061
100 – 1,000 µL 微量移液器eppendorf4924000088
1000 µL 移液器吸头NEST生命科学有限公司303216
10 µL 移液器吸头NEST生命科学有限公司301016
20 µL 移液器吸头NEST生命科学有限公司302106
15 mL 离心管NEST生命科学有限公司601052
1.5 mL 离心管NEST生命科学有限公司615601
高通量实验与参考引导的中药数据库（HERB）/http://herb.ac.cn/v2
乙腈（LC-MS级）赛默飞世尔科技A955-4
乙酰丙酮国药集团化学试剂有限公司10000418
氨水国药集团化学试剂有限公司10011028
高压灭菌器上海三申医疗器械有限公司YM75
Acclaim PepMap（75µm*2cm，C18，3µm，100Å）Thermo164535
AURORA ULTIMATE（75µm*25cm，1.6µm，100Å）AURORAAUR3-25075C18-CSI
BCA 蛋白检测试剂盒生工生物工程（上海）股份有限公司C503021-0500
台式高速冷冻离心机湖南科诚仪器设备有限公司H1 - 16KR
溴酚蓝国药集团化学试剂有限公司71008060
干式恒温加热器杭州米欧仪器有限公司DKT-100
氯仿国药集团化学试剂有限公司10006818
化学发光成像系统杭州申华科技有限公司SH - 523
洁净工作台苏州净化设备有限公司SW-CJ-2D
盖玻片江苏世泰实验器材有限公司10212450C
Cytoscape v3.9.1//
DIA-NN (V1.8.1)弗朗西斯·克里克研究所github.com/vdemichev/DiaNN
数显恒温水浴锅常州金南仪器制造有限公司HH - W600
脱色摇床武汉凌仕生物科技有限公司TSY-B
脱水机武汉俊杰电子有限公司JT-12J
伊红武汉凌仕生物科技有限公司E8090
包埋石蜡国药集团化学试剂有限公司69019361
无水乙醇国药集团化学试剂有限公司10009218
包埋机武汉俊杰电子有限公司JB-P5
GraphPad Prism/8.0.2
冰乙酸国药集团化学试剂有限公司10000218
GeneCards/https://www.genecards.org/
甘油国药集团化学试剂有限公司10010618
甘氨酸Biofroxx1275GR500
基因本体数据库（GO）/geneontology.org
苏木精武汉凌仕生物科技有限公司G1140
水平摇床江苏海门麒麟贝尔仪器制造有限公司TS - 1
疏水屏障笔ServicebioWG1066-1
HCl信阳化学试剂厂GB622-89
高效液相色谱仪安捷伦1200
异丙醇国药集团化学试剂有限公司80109218
Image-Pro PlusMedia CyberneticsVersion 6.0
成像系统尼康DS-Fi3
IRIS-Fine 显微解剖剪RWD生命科学有限公司S12004-09
京都基因与基因组百科全书（KEGG）/www.genome.jp/kegg/
载玻片南通美维生命科学有限公司PC2-301
微波炉格兰仕微波炉电器有限公司P70D20TL-P4
迷你离心机Dragon LabD1008E
中性树脂武汉凌仕生物科技有限公司G8590
NaCl国药集团化学试剂有限公司10019318
NCBI/www.ncbi.nlm.nih.gov
非接触式超声波细胞粉碎机SCIENTZ08-III
正丁醇国药集团化学试剂有限公司100052190
烘箱上海惠泰仪器制造有限公司DHG-9140A
PubChem/https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PBS 磷酸盐缓冲液粉末武汉凌仕生物科技有限公司P1010
病理切片机徕卡仪器有限公司（上海）RM2016
便携式离心机武汉凌仕生物科技有限公司D1008
R 4.5.1//
RIPA 裂解缓冲液（1.5 mL）迈伦生物MA0151
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma-AldrichL3771-500G
真空离心浓缩仪GemmyCV200
SPSS 软件IBM SPSS Statisticsversion 22
持针器RWD生命科学有限公司FC11001R-11
体视显微镜RWD生命科学有限公司77001S
离心柱 RMCWBIOCW0597S
timsTOF Pro 质谱仪Bruker DaltonicstimsTOF Pro
中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）/https://tcmspw.com/tcmsp.php
恒温混匀仪杭州米欧仪器有限公司MTC-100
三氟乙酸（TFA）Sigma-Aldrich299537-500G
三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）Sigma-AldrichC4706-10G
胰蛋白酶Sigma-AldrichT575-31N-10
组织匀浆机杭州米欧仪器有限公司MT-30K
三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱）Sigma-AldrichT1503-1KG
UltiMate 3000 RSLCnano 系统Thermo ScientificUltiMate 3000 RSLCnano
UniProt (2023-01-03)弗朗西斯·克里克研究所github.com/vdemichev/DiaNN
尿素Sigma-Aldrich51456-500G
Venny2.1/https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html
涡旋混合器Kylin-BellVORTEX-5
Vannas 弹簧剪RWD生命科学有限公司S11001-08
水（LC-MS级）赛默飞世尔科技W6-4
二甲苯国药集团化学试剂有限公司10023418

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