毛细管电泳在高分辨率血清单克隆蛋白检测中的高级应用

摘要

本文介绍了一种利用毛细管电泳进行高分辨率血清蛋白分析的实验方案。在高压电场作用下，血清蛋白根据其电荷和电泳迁移率在毛细管中迁移。所得电泳图可用于检测、定位和定量单克隆蛋白峰。

摘要

单克隆免疫球蛋白，也称为M蛋白或副蛋白，由浆细胞或B淋巴细胞的克隆性增殖产生，是单克隆丙种球蛋白病的关键生物标志物。准确检测和定量血清M蛋白对于疾病的早期诊断、临床分型及治疗监测至关重要。本方案描述了一种利用毛细管电泳（CE）对血清蛋白进行高分辨率分离的方法。在碱性缓冲液中，蛋白质在高压电场下发生电泳分离，并通过紫外吸收进行检测，生成电泳图谱，从而清晰显示并定量异常的单克隆蛋白峰。与传统方法相比，毛细管电泳可显著提高β区的分辨率，并实现自动化、快速分析，且对样本处理要求极低。五份代表性电泳图谱显示M蛋白迁移至β1、β2和γ区，M蛋白水平分别为0、44.1%（45.8 g/L）、10.5%（8.6 g/L）、35.5%（28.4 g/L），以及双峰41.3%（46.0 g/L）和12.4%（13.8 g/L）。在一项包含700份临床血清样本的回顾性研究中，毛细管电泳的阳性检出率为51.86%，而免疫固定电泳（IFE）为52.86%。以免疫固定电泳作为参考方法，毛细管电泳的敏感性为92.70%，特异性为93.94%。上述结果证实，毛细管电泳是一种适用于常规临床实验室快速、自动化筛查和定量血清M蛋白的有效方法。

引言

M蛋白相关疾病的特点是血清和/或尿液中存在单克隆免疫球蛋白（M蛋白）。这些蛋白通常由克隆性浆细胞或B淋巴细胞分泌，主要与恶性浆细胞异常增生性疾病或良性单克隆丙种球蛋白病相关^1,2。这些疾病的临床谱包括意义未明的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）、孤立性浆细胞瘤（SPC）、冒烟型多发性骨髓瘤（SMM）、多发性骨髓瘤（MM）、浆细胞白血病（PCL）、华氏巨球蛋白血症（WM）、系统性轻链淀粉样变性（AL）、B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）以及其他B细胞淋巴增殖性疾病（LPD）³。一项在西班牙开展的回顾性研究报道，在这些疾病中，MGUS最为常见，占病例总数的54.1%，其次是MM（31.3%）和其他恶性丙种球蛋白病（14.6%）⁴。还需注意的是，M蛋白也可能在某些非肿瘤性疾病情况下产生，例如肾病综合征⁵。

M蛋白检测在M蛋白相关疾病的诊断和监测中起着关键作用⁶。然而，早期诊断仍然是一个临床挑战，因为多发性骨髓瘤（MM）患者在疾病初期通常无症状，导致诊断延迟至相对晚期。大约1%的MGUS患者每年会进展为恶性疾病，最常见的是MM、华氏巨球蛋白血症（WM）或孤立性浆细胞瘤（SPC）⁷。尽管几乎所有MM病例都被认为是从MGUS演变而来，但不到10%的MM患者有明确记录的既往MGUS诊断史。因此，及时在血清和/或尿液中识别M蛋白可为这些疾病的早期诊断提供重要线索，这对于改善患者的生存率和预后至关重要。研究表明，通过主动筛查发现的MGUS患者比偶然诊断者出现的并发症更少⁸。在治疗监测过程中，了解M蛋白的同种型及其电泳迁移模式对于区分原始单克隆蛋白的复发与寡克隆条带或继发性反应性M蛋白的出现至关重要⁹。在自体干细胞移植后常观察到新M蛋白的出现，这通常被视为大多数患者的有利预后指标¹⁰。与此观察一致，比较性生存数据显示，出现继发性M蛋白的患者中位总生存期为115.3个月，而未出现者仅为31.0个月¹¹。

蛋白质电泳是一种高度复杂的分析技术。目前有多种方法可用于检测血清M蛋白，包括血清蛋白电泳（SPE）、免疫固定电泳（IFE）、毛细管电泳免疫分型（IT）、游离轻链（FLC）检测、重链与轻链（HLC）检测以及质谱分析（MS）。每种方法均具有各自独特的优势，同时也存在固有的局限性。SPE可进一步分为琼脂糖凝胶电泳（AGE）和毛细管电泳（CE）。AGE采用基于琼脂糖的介质，是一种操作简便、成本较低的方法，适用于快速分离与分析。然而，其灵敏度相对较低，通常检测限为0.3–0.5 g/L¹²，可能导致小量或低浓度M蛋白无法被检出。此外，该技术易出现条带弯曲或变形现象，影响结果的可重复性。

免疫固定电泳（IFE）被广泛认为是M蛋白分型的金标准。在初步电泳分离后，加入特异性抗体（抗IgG、抗IgA、抗IgM、κ、λ），形成免疫沉淀条带，从而确定免疫球蛋白类型及轻链亚型。IFE可检测低至0.05–0.15 g/L浓度的M蛋白，其灵敏度是血清蛋白电泳（SPE）的10倍以上。尽管具有这一优势，某些样本（如含有M蛋白多聚体的样本）需进行特殊预处理，以确保在β-巯基乙醇作用下充分解离；处理不当可能导致结果误判。此外，接受新型联合治疗方案（例如包含达雷妥尤单抗、硼替佐米、地塞米松和沙利度胺/来那度胺的方案）的患者可能出现IFE假阳性结果¹³。IFE的一个主要局限性在于仅能提供定性结果，无法定量M蛋白水平，因此不适用于疗效监测¹⁴。在接受治疗的患者中，即使M蛋白浓度在有效治疗过程中已下降，IFE结果仍可能持续呈阳性。 

相比之下，免疫固定电泳（IT）采用毛细管缓冲液作为分离介质，分辨率高于传统的免疫电泳（IFE）。然而，该过程需要繁琐的样品预处理步骤，例如抗血清混合，从而延长了整体检测流程。游离轻链（FLC）是指未与重链结合的免疫球蛋白轻链（κ 和 λ），可通过靶向其"隐匿区"表位的抗体在血清中直接定量，对检测轻链相关疾病具有高灵敏度，检测下限可低至 10–30 mg/L。在多发性骨髓瘤（MM）中，血清 FLC 水平升高与肿瘤负荷相关，且由于其半衰期较完整免疫球蛋白更短，可实现对治疗反应的更早期评估¹⁵。然而，其临床应用应结合其他诊断方法（如电泳）以排除其他疾病，确保全面评估。例如，肾功能受损可能导致轻链水平假性升高。重链/轻链（HLC）测定是另一种定量方法，使用靶向免疫球蛋白恒定区和轻链上表位的抗体。该设计可分别定量同型特异性的免疫球蛋白配对（如 IgGκ 和 IgGλ），所得 HLC 比值可作为克隆性的敏感指标。然而，结果可能受背景多克隆免疫球蛋白水平的影响，在分析复杂的 M 蛋白变异体时，该方法的可靠性可能降低。质谱（MS）具有极高的灵敏度，可对 M 蛋白进行深入的蛋白质组学表征。但其应用受限于高昂的设备成本、冗长的分析流程以及数据解读所需的专业技术。

毛细管电泳（CE）是一种强大的分析分离技术，采用弹性熔融石英毛细管作为分离通道，并以高压直流电场作为驱动力。该技术通过利用目标分析物在电泳迁移率和/或分配行为上的差异，实现高分辨率的分离。自问世以来，该技术已从单毛细管构型发展为高通量毛细管阵列及微型化的微流控装置。其应用现已涵盖药物分析、生物医学与临床诊断、食品安全检测以及生物治疗药物表征等多个领域^16,17。毛细管电泳 increasingly 被视为筛查和定量分析M蛋白的关键工具。该方法可测定M蛋白占总蛋白的百分比，再乘以总蛋白浓度，即可计算出M蛋白的绝对含量。尤为突出的是，该技术对样本用量要求极低，因此特别适用于珍贵或体积有限的样本分析。

毛细管电泳（CE）具有三项关键技术优势。首先，其高分析灵敏度（0.1–0.5 g/L）能够有效检测低浓度M蛋白，从而降低在意义未明单克隆丙种球蛋白病（MGUS）和轻链型疾病等病症中误诊的风险。其次，全自动化的操作流程消除了传统基于凝胶染色方法中固有的主观判读误差。最后，检测时间显著缩短至15–20分钟，远少于常规电泳所需的60–90分钟。作为区带电泳与液相色谱之间的一项关键分析技术，毛细管电泳在自由溶液中进行电泳分离。在施加电场的作用下，蛋白质分子主要依靠在特定pH值的碱性缓冲液中的电渗流实现分离。样本经专用缓冲液稀释后，在高压作用下从毛细管阳极端进样，启动快速而高效的蛋白质分离过程，并在阴极端于200 nm波长处进行检测。每次分析循环结束后，毛细管会自动清洗并补充缓冲液，以处理后续样本。蛋白质的分离顺序依次为：γ-球蛋白、β2-球蛋白、β1-球蛋白、α2-球蛋白、α1-球蛋白和白蛋白，从而可识别一种或多种血清蛋白组分中的异常。值得注意的是，毛细管电泳在β区具有更高的分辨率，可将该区域明确分为β1和β2球蛋白组分，从而提供更为详细的临床信息¹⁸。随着人工智能的整合以及多参数检测技术的持续进步，毛细管电泳有望发展成为M蛋白检测的首选一线筛查方法。因此，本方案描述了利用毛细管电泳对临床样本中的血清单克隆蛋白进行快速检测、定位及定量分析的操作流程。

方案

本研究方案经广东省人民医院伦理审查委员会审核批准（批准号：KY2025-176-01）。所有参与者在样本采集前均签署了书面知情同意书。

1. 材料准备

注意：试剂盒应储存于 2–30 °C，有效期最长可达 3 年。

1. 将运行缓冲液储存在 2–8 °C 环境中，使用前使其恢复至室温。一旦开启，溶液可保持稳定长达 3 个月。在毛细管电泳血清蛋白分离中，使用该溶液作为运行缓冲液。
   注意：运行缓冲液为即用型，pH 值为 9.9 ± 0.5。试剂盒包含三瓶 700 mL 碱性缓冲液，用作血清蛋白分离的运行缓冲液。
2. 使用前将 75 mL 浓缩冲洗液原液用去离子水稀释至 750 mL。稀释后的冲洗液在室温下储存。一旦开启，溶液可保持稳定长达 3 个月。使用该溶液在电泳后清洗毛细管。
   注意：冲洗液含有氢氧化钠，用于毛细管清洗。
   警告：冲洗液含有氢氧化钠，属于腐蚀性物质，可导致严重灼伤。若接触眼睛，应立即用大量清水冲洗并寻求医疗帮助。若皮肤或衣物被污染，应立即脱去受污染的衣物。操作时务必穿戴适当的防护服，并佩戴眼部和面部防护装备。
3. 将试剂杯储存在原始密封包装内，置于清洁干燥处，温度保持在 2–30 °C。在全自动仪器上使用试剂杯进行样本稀释。
4. 将密封的滤膜在室温（15–30 °C）干燥处储存。使用一次性滤器过滤缓冲液和去离子水。
5. 将毛细管清洗液（见材料表）储存在 2–8 °C 环境中，避免沉淀。
   ​注意：每瓶毛细管清洗液浓缩液（25 mL/瓶）含有蛋白水解酶、表面活性剂及其他添加剂。添加剂在应用浓度下无危害，且对最佳性能至关重要。该溶液可防止毛细管堵塞并维持最佳性能。
6. 使用孔径 ≤ 0.45 µm、电导率低于 3 µS/cm、电阻率超过 0.33 MΩ·cm 的过滤去离子水。每日更换水以防止微生物污染。使用该水清洗电泳分析仪的毛细管。
7. 配制含有 2–3% 有效氯的次氯酸钠溶液。使用该溶液清洗样本探针，以去除吸附的蛋白质。将工作用含氯溶液在室温下储存于密闭容器中。溶液可保持稳定长达 3 个月。切勿在阳光、热源、点火源、酸或氨附近储存。

2. 样品采集

1. 确保患者在采血前至少空腹 8–12 小时。
2. 让患者在坐位或仰卧位休息 10–15 分钟，以稳定血流动力学状态。
3. 准备以下用品：一次性静脉采血针、真空采血管（血清管）、止血带、无菌棉签、75% 酒精或碘伏消毒剂、医用胶带和生物危害废物容器。
   ​注意：肘窝处的正中静脉为首选穿刺部位。
4. 在穿刺部位上方 3–5 cm 处绑扎止血带，使静脉充分充盈。
5. 使用 75% 酒精或碘伏以从中心向外呈离心螺旋方式消毒皮肤，消毒区域直径应 ≥5 cm，并让消毒剂自然风干，期间避免再次触碰该区域。
6. 持针时使针斜面向上，与皮肤呈 15–30° 角，平稳穿刺皮肤及静脉壁。
7. 见到回血后，固定针头并连接真空采血管。让血液在负压作用下被动流入管内，避免手动挤压，以防溶血。
8. 采血完成后，先松开止血带，再轻柔拔出针头，并立即用无菌棉签按压穿刺部位 3–5 分钟，确保止血。
9. 将采集的样本直立放置于室温下，使血液自然凝固。

3. 样品质量评估

1. 将血清样本在室温下以 2,095 × g 离心 10 分钟。
2. 在充足的自然光下，以纯白色背景对血清样本进行严格的肉眼质量评估。
3. 通过观察上清液的颜色和透明度来评估溶血情况。若上清液呈清澈黄色，则判为无溶血；若出现粉红色或红色变色，则提示存在轻度至重度溶血。
   注意：溶血可能导致出现双α-2区带。在陈旧或储存不当的血清样本中，β-2组分可能降低。
4. 通过检查上清液中是否存在可见的纤维蛋白丝、凝块或胶状网络，以及是否存在相分离不完全、浑浊或分析信号不一致等现象，来检测纤维蛋白原干扰。
   注意：纤维蛋白原迁移至β-2位置（表现为β-2区带的肩峰或与β-2区带重叠，可能伴有该组分的增加）。在某些样本中（如血浆、未完全去纤维蛋白的血清或接受抗凝治疗患者的样本），纤维蛋白原可能干扰分析，导致错误解释，例如误疑为单克隆区带或β-2组分升高。
5. 一旦发现样本存在溶血、纤维蛋白原干扰或其他分析前异常，应将其排除在分析之外。
6. 按照标准化的静脉采血和处理流程重新采集血液标本，确保适当的凝固时间和标准化的离心参数。仅使用外观合格的样本进行后续检测——即清晰、无溶血、无纤维蛋白、无脂血或无污染的样本。
7. 分离后的血清样本应尽快在室温下进行检测。若无法立即检测，可将样本在 2–8 °C 保存最多 10 天，或在 -20 °C 保存最多 30 天。避免反复冻融样本。
   注意：避免使用血浆样本。若分析陈旧血浆样本（不推荐），不稳定的组分（如补体 C3）会随时间降解，此时β-2区带主要对应于纤维蛋白原。
8. 检测前将样本恢复至室温并充分混匀。确保冷冻样本已完全解冻后方可使用。
   注意：使用未经稀释的血清蛋白样本。某些冷藏血清可能变得黏稠或浑浊，尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶的样本。含多克隆免疫球蛋白的样本可直接使用，无需额外预处理。

4. 操作步骤

1. 开启自动毛细管电泳分析仪（见材料表）及其连接的计算机系统。等待仪器完成初始化。
   注意：毛细管长度为 17.5 cm，内径为 25 µm。分离电压范围为 8,000–10,000 V。采用电动力学进样方式，分离温度维持在约 25 °C。每份样品的总运行时间约为 10 分钟。
2. 启动安装在计算机上的 PHORESIS 软件（见材料表），用于数据处理。
3. 在软件界面中选择 PROTEIN (E) 6 程序，然后将运行缓冲液瓶插入仪器。
   注意：该程序是专为血清蛋白分馏设计的出厂校准预设方案。所有参数已在仪器的 PHORESIS 软件中预先配置，无需手动修改。
4. 如有需要，将含有重溶后清洗液的试剂瓶放入仪器内。
5. 将新的试剂杯安装到毛细管电泳分析仪的自动加样平台上。
6. 在毛细管电泳分析仪的标准废液处理位置安装新的废液盒，用于收集使用过的试剂杯。
7. 通过右侧开口将样品架装入分析仪（最大容量：15 个样品架）。
   注意：每个样品架最多可容纳 8 支样品管。每支试管上的条形码必须能通过样品架的开口清晰可见。
8. 使用 0 号样品架放置对照血清。采用基于 20 次检测数据计算得出的累积均值和变异系数的第三方质控品。
9. 从左侧卸载托盘中取出已完成检测的样品架。如有需要，取出并丢弃装有使用过试剂杯的废液盒。
   警告：处理使用过的试剂杯时需谨慎，因其可能含有生物样本。
10. 将毛细管清洗液置于二级试剂仓的 S2 位置。在仪器屏幕上点击 维护与清洗，然后选择 启动 Capiclean。
11. 在二级试剂仓（T1 位置）中加入 2–3% 次氯酸钠溶液。在仪器屏幕上点击 维护与清洗，然后选择 启动去污染。
    ​注意：整个毛细管清洗过程将自动运行 45 分钟。
12. 每周至少启动一次清洗程序。

5. 结果分析

1. 每次分析运行完成后，将仪器的原始数据传输至软件进行处理。软件会生成电泳图，并在计算机屏幕上显示。
2. 分析电泳图，并使用软件在200 nm波长下定量各蛋白质条带的相对吸光强度。
   注：根据全自动生化分析仪测得的总蛋白浓度，软件将计算每个蛋白质条带的浓度。
3. 利用生成的电泳图进行目视评估，并识别异常条带。
   注：系统默认以重绘模式显示电泳图。
4. 如有必要，可使用标准模式展示由原始数据获得的初始电泳图。
   ​注：毛细管电泳分析仪的参考范围是通过对246名健康成年参与者（包括男性和女性）且甘油三酯水平正常者进行统计分析建立的（表1）。建议各实验室建立自身的参考标准。

6. 仪器关闭

1. 每次分析序列结束后，启动毛细管电泳分析仪的关机程序，以在理想条件下保存毛细管。
   1. 要启动关机程序，请从主菜单中选择“关机”，或使用分析仪附带的关机架。
   2. 在主菜单中按下“关机”。在屏幕上显示的窗口中，按下 开始该程序。当当前的分析程序完成后，关机过程将自动开始。
   3. 关机架上标有“EXTINCTION/SHUTDOWN CAPILLARYS 3 & MC”。将此架插入样品架队列的末端，仪器将自动启动关机程序。
      注意：当关机程序完成后，仪器将断电，屏幕会关闭。
2. 使用仪器背面的物理电源开关，将分析仪与主电源断开。
3. 从两个试剂仓中取出所有试剂瓶，并在推荐的储存条件下保存。全自动电泳分析仪的常见故障、可能原因及解决方案见补充表 1。

7. 性能参数

1. 为确定毛细管电泳程序的分析灵敏度，制备并分析一份含有异常蛋白的血清样本系列稀释液，该样本在γ区的异常蛋白浓度为1.198 g/dL。能够观察到明显异常的最高稀释度对应的异常蛋白浓度为19 mg/dL。
   注意：检测限可能因异常蛋白及多克隆背景在γ区的位置不同而有所变化。
2. 准确性评估——内部相关性
   1. 为确保样本完整性，所有血清样本（包括18份正常样本和100份病理样本）均应按照相同的流程处理，并遵循相同的操作规范。
   2. 通过分析仪上的毛细管电泳程序获得的电泳分离结果，以及另一种 commercially available 的蛋白质分析用毛细管电泳技术，分别测定各蛋白组分的含量。
   3. 采用线性回归统计方法对两种方法测得的数值进行分析。所得结果表明，两种方法之间具有完全的相关性。

结果

通过检测血清蛋白质的吸光度，对每条蛋白质条带的迁移位置、峰特征及相对百分比进行定量分析。随后根据电泳图谱中观察到的异常条带的存在及其分布模式进行临床解读。图 1 展示了血清蛋白质组分正常迁移模式的代表性毛细管电泳图谱。峰迁移时间的差异主要归因于患者之间的生理差异，这些差异影响血液基质的性质。具体而言，血液基质离子强度的差异、干扰成分的存在以及蛋白质翻译后修饰均会导致峰迁移时间的变化。

在样本A中，所有蛋白条带比例均正常，各区域均未观察到异常峰，检测结果判定为阴性，提示无M蛋白相关疾病的证据（图2）。在样本B中，总蛋白水平升高至103.8 g/L，白蛋白为34.5 g/L，β1区比例升高至52.2%。在β1区观察到一个单一的异常峰，M蛋白占44.1%（45.8 g/L）（图3）。该样本来自一名被诊断为浆细胞瘤的76岁女性。在样本C中，总蛋白水平为82.0 g/L，属正常范围，白蛋白为37.9 g/L，β2区...

讨论

血清蛋白电泳（SPE）是临床实验室中一种基本的诊断技术，根据血清蛋白的等电点、分子量和构象差异进行分离¹⁹。本研究系统地阐述了一种利用毛细管电泳（CE）快速检测和定量血清M蛋白的实验方案。该方案突出了该方法优异的分析性能，其核心优势在于高灵敏度、高通量和全自动化²⁰。由于M蛋白具有单克隆特性，通常表现出独特的局部迁移模式，在电泳图谱上形成特征性的尖锐、均一峰。高分辨率电泳能够清晰分离β1（转铁蛋白）和β2（C3）球蛋白组分²¹，毛细管电泳即具备这一能力。CE与传统的琼脂糖凝胶电泳（AGE）之间的一个关键区别在于，当凝胶上存在高浓度M蛋白时，蛋白质结合染料会出现饱和效应。因此，AGE检测前需对样本进行更高倍数的稀释，以确保定量的准确性。

毛细管电泳（CE）自动化操作系统将所有关键分析步骤整合为一个连续的过程，包括样本稀释、进样、电泳分离、检测、毛细管清洗以及结果解读。如此高度的集成化显著减少了人工干预，从而大幅提高分析通量，同时消除了传统手工...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CAPI 3 蛋白 (E) 6 缓冲液	SEBIA	2503	毛细管电泳中用于血清蛋白分离的运行缓冲液（文中称为运行缓冲液）。
洗涤液	SEBIA	2062	电泳后用于清洗毛细管的稀释冲洗液。
试剂杯	SEBIA	2582	用于全自动仪器上的样本稀释。
FILTER CAPILLARYS	SEBIA		一次性滤器，用于毛细管清洗过程中过滤缓冲液和去离子水。
CAPICLEAN	SEBIA	2060	用于清洗 CAPILLARYS 3 OCTA 仪器的毛细管（文中称为毛细管清洗液）
次氯酸钠溶液	广州化学试剂厂	1703079	用于样本探针的清洗。
去离子水	屈臣氏	/	用于全自动毛细管电泳分析仪中的毛细管冲洗。
Randox 质控品	Randox	HN1530	用于质量控制。
全自动毛细管电泳分析仪	SEBIA	CAPILLARYS 3 OCTA	用于高分辨率、高通量血清蛋白分析的仪器。
PHORESIS 9.30 软件	SEBIA	/	用于自动采集和分析电泳图谱的软件。