本方案描述了一种用于化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的小鼠皮下感染模型，可独立定量细菌负荷和病灶进展。该方法为评估细菌毒力因子、宿主免疫反应或旨在减轻组织损伤的治疗干预措施提供了标准化且可重复的实验平台。
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本方案描述了一种用于化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的小鼠皮下感染模型，可独立定量细菌负荷和病灶进展。该方法为评估细菌毒力因子、宿主免疫反应或旨在减轻组织损伤的治疗干预措施提供了标准化且可重复的实验平台。
Streptococcus pyogenes 是一种人类病原体，可引起严重的坏死性软组织感染，其特征是组织迅速且广泛地破坏。研究这类感染的一个关键挑战在于缺乏能够独立评估细菌复制和宿主介导的组织损伤的实验模型。本文介绍了一种标准化且可重复的小鼠皮下S. pyogenes坏死性皮肤感染模型，旨在克服这一局限性。该方案描述了对数期细菌接种物的制备、小鼠的皮下感染以及病灶发展的纵向监测。关键步骤包括对细菌培养物进行超声处理以标准化链长、对病灶进行数字成像以定量分析溃疡面积，以及通过组织匀浆和涂板测定细菌负荷量。这一多功能模型可轻松用于评估特定细菌基因、宿主因子或治疗干预措施对感染进展和组织病理的影响。通过实现对细菌和宿主参数的可重复且定量的评估，该方法为研究链球菌侵袭性感染的发病机制以及测试减轻组织损伤的策略提供了可靠的平台。
Streptococcus pyogenes （A组 链球菌，GAS）是一种重要的人类病原体，可引起坏死性软组织感染（NSTIs）1，导致皮肤及皮下组织迅速破坏2,3,4研究这些感染的发病机制需要动物模型，既能模拟局部组织损伤，又能独立评估细菌复制和宿主介导的病理变化。5许多传统的感染模型，例如全身接种或 体外 细胞培养系统在区分细菌负荷与组织损伤方面存在局限性，因此难以评估毒力因子或宿主反应的具体作用6.
本方法的总体目标是建立一种标准化且可重复的小鼠皮下S. pyogenes坏死性皮肤感染模型。该技术的设计原理在于构建一个可操作的体内系统，将病原体复制与宿主介导的组织损伤分离开来。该模型适用于常见的实验小鼠品系。尽管SKH1（无毛）品系常因便于病灶监测而被选用7,8，但本方案在脱毛处理后的有毛品系（如C57BL/6J）上同样有效。已发表的研究....
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所有动物实验均按照马歇尔大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）及动物资源设施的规定进行。涉及Streptococcus pyogenes的所有操作均在经公共卫生服务局（PHS）认证、AAALAC认证的动物设施中，依照机构生物安全规程，在生物安全二级（BSL-2）防护条件下进行。实验流程如图1所示。
注意：试剂、材料和设备的具体信息见材料表。
1. 接种物用细菌的制备
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S. pyogenes 的小鼠皮下感染模型可稳定产生局部进行性坏死性溃疡，能够同时定量细菌载量和组织病理学变化。本标准化方案的代表性结果如下。
实验组通常包括6至10只小鼠，以提供足够的统计效能（例如80-90%），用于检测病灶大小和细菌载量的显著差异，该设计依据既往研究8,14,15。数据采用适当的统计学方法进行分析（例如，两组间比较使用非配对t检验，多组间比较使用单因素方差分析结合事后检验）。对照组应包括仅注射载体（例如无菌PBS）的小鼠；在测试突变株时，还应设置平行组感染野生型（WT）亲本菌株。
在皮下接种 1 × 107 CFU 的野生型 S. pyogenes 菌株 HSC5 后，感染后 24 小时（hpi）注射部位即出现明确的硬结区域，并在 48–72 hpi 发展为坏死性.......
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本文所述的小鼠皮下S. pyogenes坏死性皮肤感染模型为研究严重软组织感染的潜在机制提供了一个可靠且可重复的实验体系。该模型的主要价值在于能够将细菌负荷与组织病理分离，从而可对宿主和病原体因素如何独立促进疾病进展进行机制性研究。这一区分在S. pyogenes感染中尤为重要，因为坏死性筋膜炎的严重程度往往反映了宿主对链球菌溶素等毒力因子产生的过度炎症反应，而不仅仅取决于细菌的增殖18。
若干方法学步骤对于获得一致且可解释的结果至关重要。细菌接种物的标准化是必不可少的。培养物应在C培养基中过夜培养，随后转接到Todd-Hewitt（THY）肉汤中进行传代培养，并在对数生长期中期（OD600 ≈ 0.200）收获，以确保毒力因子的表达均匀一致。C培养基（含有酪蛋白水解物、酵母提取物和无机盐）能够支持细菌稳健的过夜生长，同时维持A族链球菌（GAS）的活性。感染前，细菌需进行充分的超声处理，时间约为5分钟，以破坏链球菌典型的链状结构。该步骤可确保接种物均匀，防止形成可能阻塞毛细血管.......
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作者声明无竞争利益。
本研究由马歇尔大学启动基金以及西弗吉尼亚州临床与转化科学研究所从实验室到临床（Bench-to-Bedside）资助项目（U54GM104942）资助，资助对象为 WX。美国国立卫生研究院资助项目 R21 AI163825（资助对象为 MGC）。我们感谢马歇尔大学动物资源中心负责人 Jill Khan 博士（文学硕士、兽医学博士、公共卫生硕士、美国实验室动物医学学会认证专家）以及 IACUC 委员会主席 Monica Valentovic 博士（哲学博士）对本文稿的审阅与宝贵意见。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | BD | 309628 | 皮下注射 |
| 28-G 针头 | BD | 305109 | 皮下注射 |
| 细菌血细胞计数板 / 计数室 | 豪泽科学 | 02-671-6 | 接种前细菌计数 |
| BD BBL GasPak EZ 厌氧培养容器系统 | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260001 | 用于厌氧培养 |
| C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 664 | 8-12周龄 |
| 二氧化碳（CO₂）钢瓶 | 本地供应商 | N/A | 用于安乐死 |
| 杯角式超声破碎仪 （例如，Q700） | Qsonica | 431C2 | 用于标准化细菌链长度 |
| 数码相机 | N/A | N/A | 用于病灶成像 |
| 电动剪毛器 | Wahl | 例如，8655-200 | 用于剃除小鼠 flank 部毛发 |
| FastPrep-24 均质器 | MP Biomedicals | 116005500 | 用于组织匀浆 |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| 异氟烷 | Baxter | 1001936060 | 麻醉剂 |
| 异氟烷麻醉系统 （室） &和雾化器） | VetEquip 或类似产品 | N/A | 用于小鼠麻醉 |
| 蛋白胨 | Becton, Dickinson and Company (BD) | 211677 | 用于C培养基的配制 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 10010023 | 无菌，pH 7.4 |
| S. pyogenes 菌株 HSC5 | Caparon 实验室 | M1T1 临床分离株 | |
| SKH1 小鼠 | 查尔斯河实验室 | 477 | 8-12 周龄，无毛 |
| 不锈钢珠，2.8 mm | 通用医疗 | D1133-28 | 无菌的 |
| 无菌手术剪和镊子 | 精细科学工具或类似产品 | N/A | 用于无菌组织采集 |
| Todd Hewitt 肉汤 | Becton, Dickinson and Company (BD) | 249240 | 用于细菌传代培养 |
| 酵母提取物 （用于C培养基） | Becton, Dickinson and Company (BD) | 212750 | 用于C培养基的制备（与肉汤补充剂相同） |
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