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方法文章

一种小鼠模型的Streptococcus pyogenes坏死性皮肤感染

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DOI：

10.3791/70159

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2026年3月6日

 , 
1Department of Biomedical Sciences, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University, 2Department of Molecular Microbiology, Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的小鼠皮下感染模型，可独立定量细菌负荷和病灶进展。该方法为评估细菌毒力因子、宿主免疫反应或旨在减轻组织损伤的治疗干预措施提供了标准化且可重复的实验平台。

摘要

Streptococcus pyogenes 是一种人类病原体，可引起严重的坏死性软组织感染，其特征是组织迅速且广泛地破坏。研究这类感染的一个关键挑战在于缺乏能够独立评估细菌复制和宿主介导的组织损伤的实验模型。本文介绍了一种标准化且可重复的小鼠皮下S. pyogenes坏死性皮肤感染模型，旨在克服这一局限性。该方案描述了对数期细菌接种物的制备、小鼠的皮下感染以及病灶发展的纵向监测。关键步骤包括对细菌培养物进行超声处理以标准化链长、对病灶进行数字成像以定量分析溃疡面积，以及通过组织匀浆和涂板测定细菌负荷量。这一多功能模型可轻松用于评估特定细菌基因、宿主因子或治疗干预措施对感染进展和组织病理的影响。通过实现对细菌和宿主参数的可重复且定量的评估，该方法为研究链球菌侵袭性感染的发病机制以及测试减轻组织损伤的策略提供了可靠的平台。

引言

Streptococcus pyogenes （A组 链球菌，GAS）是一种重要的人类病原体，可引起坏死性软组织感染（NSTIs）1，导致皮肤及皮下组织迅速破坏2,3,4研究这些感染的发病机制需要动物模型，既能模拟局部组织损伤，又能独立评估细菌复制和宿主介导的病理变化。5许多传统的感染模型，例如全身接种或 体外 细胞培养系统在区分细菌负荷与组织损伤方面存在局限性，因此难以评估毒力因子或宿主反应的具体作用6.

本方法的总体目标是建立一种标准化且可重复的小鼠皮下S. pyogenes坏死性皮肤感染模型。该技术的设计原理在于构建一个可操作的体内系统，将病原体复制与宿主介导的组织损伤分离开来。该模型适用于常见的实验小鼠品系。尽管SKH1（无毛）品系常因便于病灶监测而被选用7,8，但本方案在脱毛处理后的有毛品系（如C57BL/6J）上同样有效。已发表的研究通常使用任一性别或单一性别（常为雌性），并在特定实验条件下常发现病灶面积和细菌负荷相似；然而，在某些情况下，宿主的遗传背景和性别可能影响A组链球菌（GAS）疾病的严重程度，因此在实验设计和结果分析时应予以考虑9。相较于其他模型，该模型的一个关键优势在于能够对局部病灶进行长期动态监测，从而在同一动物个体中随时间推移独立、精确地量化溃疡面积和细菌负荷。在选择适当的接种量和菌株时，皮下感染通常局限于局部，便于研究病灶的发展与消退过程。然而，感染是否局限取决于菌株、接种量和宿主因素：某些临床分离株（或获得covRS突变的菌株）以及足够大的接种量可能引起播散性感染，导致免疫功能正常小鼠出现菌血症或致死性疾病10。研究者在将该模型应用于新分离株时，应明确报告所用菌株、接种量、接种途径及任何宿主修饰，并对接种量进行滴定。该方法具有高度可重复性、易于实施，并可兼容多种下游分析，包括组织学检查和免疫表型分析。

该方案已应用于多种A族链球菌（GAS）菌株（包括HSC511等M1型分离株以及其他M1T110,12菌株）以及临床坏死性软组织感染（NSTI）分离株。由于不同emm型别及不同分离株之间的毒力表型存在差异13，研究者在将该方案应用于新菌株时，应通过实验优化接种量，并监测系统性扩散情况。

本方案适用于从事微生物致病机制、免疫学及转化医学研究的研究人员，旨在研究细菌毒力、宿主免疫应答或针对侵袭性感染期间组织保护的新型治疗策略。该方案具有标准化和定量化的实验设计，可对干预措施进行严格评估，并为研究病原体复制与宿主介导的组织损伤之间的相互作用提供一个多功能平台。

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方案

所有动物实验均按照马歇尔大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）及动物资源设施的规定进行。涉及Streptococcus pyogenes的所有操作均在经公共卫生服务局（PHS）认证、AAALAC认证的动物设施中，依照机构生物安全规程，在生物安全二级（BSL-2）防护条件下进行。实验流程如图1所示。

注意：试剂、材料和设备的具体信息见材料表。

1. 接种物用细菌的制备

  1. 从冻存菌种中接种Streptococcus pyogenes HSC5至10.5 mL C培养基（含0.5%蛋白胨、1.5%酵母提取物、10 mM K2HPO4、0.4 mM MgSO4和17 mM NaCl）中，制备过夜培养物。于37 °C静置培养16–20小时。
  2. 测定过夜培养物在600 nm处的光密度（OD600）。取10 mL培养物，在室温下以6,000 ×g离心5分钟。
  3. 将细菌沉淀重悬于0.5 mL新鲜预热的Todd Hewitt肉汤中，该肉汤添加有1%酵母提取物。
  4. 将重悬的细菌接种至锥形管中含50 mL预热的、添加1%酵母提取物的Todd Hewitt肉汤中，初始OD600调至0.05。
  5. 将锥形管于37 °C培养，不振荡。每30分钟监测一次OD600。
  6. 当培养物OD600达到约0.200时，在4 °C下以6,000 × g离心5分钟收集细菌。
  7. 弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL冰冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  8. 再次在4 °C下以6,000 × g离心5分钟。将最终沉淀重悬于1 mL冰冷的无菌PBS溶液中。将悬液置于冰上保存。
    注意：此浓缩细菌悬液在进行超声处理前可在冰上保存最多30分钟。

2. 细菌浓度的标准化

  1. 将1 mL细菌悬液转移至微量离心管中。使用杯型探头超声仪在冰上对悬液进行超声处理，以打断化脓性链球菌（S. pyogenes）的长链。
    警告：超声过程中请佩戴适当的听力保护装置。该操作会产生高频噪音，可能导致听力损伤。
  2. 将超声仪设置为进行5个循环、每个循环1分钟的脉冲处理（具体参数取决于超声仪型号）。为确认链状结构是否有效打断，取10 µL超声处理后的悬液滴于显微镜载玻片上，加盖盖玻片后在40倍物镜下观察。
    注意：超声处理的目的是将长链打断为以短链（理想情况下每链1–4个细胞）和单个球菌为主。如果仍存在较多长链（>10个细胞），需重复超声处理循环。
  3. 用无菌PBS溶液将超声处理后的细菌悬液稀释100倍。
  4. 取10 µL稀释后的细菌悬液加入计数板/细菌血球计数板中。
  5. 在显微镜下计数计数板中10个大方格内的细菌链数量。
  6. 使用以下公式计算细菌浓度（单位：每毫升菌落形成单位，CFU/mL）：浓度 = (总菌数 / 10) × 稀释倍数 × 1.25 × 106。
    注意：每条细菌链计为一个CFU。
  7. 用预冷的PBS将超声处理后的菌液原液稀释至终工作浓度为1 × 108 CFU/mL。

3. 小鼠皮下感染

  1. 感染前一天，剃除每只小鼠左侧后侧腹部的毛发。使用电动剪毛器完全去除约 2 cm × 2 cm 面积内的所有毛发。
  2. 将小鼠置于诱导室中进行麻醉（诱导浓度为 4%，维持浓度为 1.5% 异氟烷）。为保持感染同步，以较小且易于操作的批次处理小鼠（例如每批 5–10 只）。
  3. 使用配有 27 号针头的 1 mL 注射器，吸取 100 µL 细菌接种液。
  4. 将小鼠从异氟烷麻醉室中取出，立即将针头斜面向上刺入麻醉小鼠的剃毛后侧腹部皮下。
  5. 缓慢注射全部 100 µL 液体，形成局部隆起的皮丘。随后拔出针头。
  6. 将小鼠放回笼中，并持续观察直至其完全从麻醉中恢复。
  7. 对实验组中的所有小鼠重复步骤 3.2–3.5。
  8. 用 PBS 对剩余的细菌接种液进行连续 10 倍梯度稀释。
  9. 取每种稀释液 5 µL 点种于琼脂平板上。于 37 °C 厌氧条件下过夜培养，以确认实际接种剂量。

4. 感染进展的纵向监测

  1. 每天至少监测一次所有感染小鼠，观察是否存在任何不适症状。必须遵守既定的人道终点标准，尤其是在使用高毒力菌株或免疫缺陷宿主时尤为重要。
  2. 按照步骤 3.2 中描述的程序对每只小鼠进行麻醉。
  3. 将小鼠从异氟烷麻醉舱中取出，并将其侧置于标识标签旁。为实现对个体小鼠的长期追踪，应在实验开始前对每只动物进行标记（例如耳缘穿孔或耳标）。
  4. 使用正对小鼠上方固定的相机拍摄病灶区域的数字图像。
  5. 在图像分析软件（ImageJ/Fiji）中打开数字图像。从工具栏中选择 自由选择工具。
  6. 手动勾勒图像中可见溃疡的边缘轮廓。
  7. 打开 分析 菜单，选择 测量 以计算所勾勒轮廓内的面积。
  8. 在每个时间点记录每只小鼠的测量面积（单位：平方毫米）。
    注意：实验可在此处暂停。将小鼠放回笼中继续观察，直至下一个观察时间点或实验终点。

5. 组织采集与细菌载量定量

  1. 在实验终点，采用二氧化碳吸入法对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位，该方法已获马歇尔大学IACUC批准。
  2. 使用无菌手术剪和镊子，无菌条件下完整切除整个病灶及少量周围组织。确保切除组织包含全层皮肤及下方皮下组织，通常延伸至但不包括肌肉层，除非感染已明显侵入肌筋膜。
  3. 将组织转移至预先称重的无菌2 mL螺口微量离心管中，管内含1 mL无菌PBS和两颗无菌2.8 mm不锈钢珠。
  4. 记录组织重量。
  5. 使用机械匀浆器在6.5 m/s条件下匀浆组织，持续60秒。
  6. 将离心管置于冰上5分钟，以防止过热。
  7. 再次以6.5 m/s匀浆60秒，进行第二个匀浆循环。
  8. 在96孔板中用无菌PBS对组织匀浆液进行10倍系列稀释，并将每种稀释液各取5 µL点种于琼脂平板上。
  9. 将平板在37 °C下厌氧培养24–48小时。例如，将平板放入密封罐中，并加入厌氧气体发生袋和厌氧指示剂。
  10. 计数菌落数在30–300之间的平板，计算每毫升组织匀浆液中的菌落形成单位（CFU/mL）。

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结果

S. pyogenes 的小鼠皮下感染模型可稳定产生局部进行性坏死性溃疡，能够同时定量细菌载量和组织病理学变化。本标准化方案的代表性结果如下。

实验组通常包括6至10只小鼠，以提供足够的统计效能（例如80-90%），用于检测病灶大小和细菌载量的显著差异，该设计依据既往研究8,14,15。数据采用适当的统计学方法进行分析（例如，两组间比较使用非配对t检验，多组间比较使用单因素方差分析结合事后检验）。对照组应包括仅注射载体（例如无菌PBS）的小鼠；在测试突变株时，还应设置平行组感染野生型（WT）亲本菌株。

在皮下接种 1 × 107 CFU 的野生型 S. pyogenes 菌株 HSC5 后，感染后 24 小时（hpi）注射部位即出现明确的硬结区域，并在 48–72 hpi 发展为坏死性...

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讨论

本文所述的小鼠皮下S. pyogenes坏死性皮肤感染模型为研究严重软组织感染的潜在机制提供了一个可靠且可重复的实验体系。该模型的主要价值在于能够将细菌负荷与组织病理分离，从而可对宿主和病原体因素如何独立促进疾病进展进行机制性研究。这一区分在S. pyogenes感染中尤为重要，因为坏死性筋膜炎的严重程度往往反映了宿主对链球菌溶素等毒力因子产生的过度炎症反应，而不仅仅取决于细菌的增殖18。

若干方法学步骤对于获得一致且可解释的结果至关重要。细菌接种物的标准化是必不可少的。培养物应在C培养基中过夜培养，随后转接到Todd-Hewitt（THY）肉汤中进行传代培养，并在对数生长期中期（OD600 ≈ 0.200）收获，以确保毒力因子的表达均匀一致。C培养基（含有酪蛋白水解物、酵母提取物和无机盐）能够支持细菌稳健的过夜生长，同时维持A族链球菌（GAS）的活性。感染前，细菌需进行充分的超声处理，时间约为5分钟，以破坏链球菌典型的链状结构。该步骤可确保接种物均匀，防止形成可能阻塞毛细血管...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本研究由马歇尔大学启动基金以及西弗吉尼亚州临床与转化科学研究所从实验室到临床（Bench-to-Bedside）资助项目（U54GM104942）资助，资助对象为 WX。美国国立卫生研究院资助项目 R21 AI163825（资助对象为 MGC）。我们感谢马歇尔大学动物资源中心负责人 Jill Khan 博士（文学硕士、兽医学博士、公共卫生硕士、美国实验室动物医学学会认证专家）以及 IACUC 委员会主席 Monica Valentovic 博士（哲学博士）对本文稿的审阅与宝贵意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器BD309628皮下注射
28-G 针头BD305109皮下注射
细菌血细胞计数板 / 计数室豪泽科学02-671-6接种前细菌计数
BD BBL GasPak EZ 厌氧培养容器系统Becton, Dickinson and Company (BD)260001用于厌氧培养
C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室6648-12周龄
二氧化碳（CO₂）钢瓶本地供应商N/A用于安乐死
杯角式超声破碎仪 （例如，Q700）Qsonica431C2用于标准化细菌链长度
数码相机N/AN/A用于病灶成像
电动剪毛器Wahl例如，8655-200用于剃除小鼠 flank 部毛发
FastPrep-24 均质器MP Biomedicals116005500用于组织匀浆
ImageJ 软件美国国立卫生研究院（NIH）N/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/
异氟烷Baxter1001936060麻醉剂
异氟烷麻醉系统 （室） &和雾化器）VetEquip 或类似产品N/A用于小鼠麻醉
蛋白胨Becton, Dickinson and Company (BD)211677用于C培养基的配制
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco10010023无菌，pH 7.4
S. pyogenes 菌株 HSC5Caparon 实验室M1T1 临床分离株
SKH1 小鼠查尔斯河实验室4778-12 周龄，无毛
不锈钢珠，2.8 mm通用医疗D1133-28无菌的
无菌手术剪和镊子精细科学工具或类似产品N/A用于无菌组织采集
Todd Hewitt 肉汤Becton, Dickinson and Company (BD)249240用于细菌传代培养
酵母提取物 （用于C培养基）Becton, Dickinson and Company (BD)212750用于C培养基的制备（与肉汤补充剂相同）

参考文献

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