方法文章

开发并验证一种快速LC-MS/MS方法用于多发性骨髓瘤患者血浆中卡非佐米定量

DOI：

10.3791/70167

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2026年5月12日

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1College of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Chinese Medicine, 2Department of Pharmacy, Second Affiliated Hospital of Naval Medical University, 3Department of Rehabilitation, Second Affiliated Hospital of Naval Medical University, 4School of Pharmacy, Shanghai University of Medicine and Health Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本研究旨在开发并验证一种快速灵敏的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于定量人血浆中卡非佐米。该完全验证的方法支持多发性骨髓瘤患者的治疗性药物监测，从而实现个性化剂量优化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

卡非唑单，一种第二代蛋白酶体抑制剂，需要治疗性药物监测（TDM）。本研究旨在开发和验证一种灵敏且稳健的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于定量人血浆中卡非佐米。血浆样本通过含乙腈（ACN）的蛋白质沉淀处理。色谱分离是在一个C18 柱（2.1毫米×100毫米，3.5微米）上实现的，保持在40°C，流动相由ACN和10 mmol/L醋酸铵在水中（80：20，v/v），以0.35 mL/min的流量输送。该方法在2.00-1000.00 ng/mL的浓度范围内表现出优异的线性性。此外，观察到日内和日间的高精度和准确性较高，卡非佐米的恢复率在84.1%至93.0%之间。这种经过验证的LC-MS/MS方法能够准确、高效且灵敏地测定多发性骨髓瘤患者血浆中的卡非唑米浓度，从而支持基于卡非唑米的治疗优化。

引言

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多发性骨髓瘤（MM）是一种血液恶性肿瘤，其特征是骨髓中浆细胞的克隆增殖。它是全球第二常见的血液恶性肿瘤2，约占所有血液癌症的10%。多年来，药物治疗的进步，包括蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物和单克隆抗体的引入，带来了更好的治疗效果。然而，显著比例（20%-30%）的多发性骨髓瘤患者仍面临诸如短无进展生存期（PFS）4.5不良反应（ADR）、耐药性和复发等挑战。

博替佐米，首创的蛋白酶体抑制剂7，彻底改变了多发性骨髓瘤的治疗格局。尽管有效，大多数患者最终仍发展为复发或难治性疾病，且常伴有博替单抗药性8,9，治疗反应和生存率降低10,11。这些挑战凸显了改善多发性骨髓瘤预后所需的创新治疗方法。卡非索米是一种获得FDA批准的第二代蛋白酶体抑制剂，提供了更稳定的药代动力学结构，能够持续抑制类壶菌蛋白酶活性，并发挥强效的抗骨髓瘤效果。通常适用于接受过至少两条既往治疗线路的MM患者，包括博替唑米和免疫调节药物1,11。研究表明，卡非唑米在骨髓瘤细胞中比硼替唑单更能实现更强的蛋白酶体抑制，并具备克服硼替单抗药的能力12,13。

定量生物基质中药物浓度最广泛使用的方法包括高性能液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）14。尽管高效液相色谱-紫外线操作简便且成本低，但其实用性受限于灵敏度和选择性相对较低。因此，目标分析物的准确定量，尤其是在低浓度或复杂生物基质中，仍然具有挑战性15。ELISA表现出高度灵敏度。然而，其应用面临若干限制，包括开发过程冗长、依赖高质量抗体，以及易与样本中结构相似的化合物产生交叉反应。这些因素共同影响了16号测定的特异性。相比之下，LC-MS/MS具有卓越的选择性、卓越的灵敏度和快速的分析通量。这些优势使其成为治疗性药物监测（TDM）和药物动力学研究的金标准方法论17。卡非唑单具有广泛血浆蛋白结合、 体内稳定性差 和治疗指数狭窄的特征。LC-MS/MS技术能够快速定量分析目标化合物，有效减少基质效应，并为精确的临床用药提供科学基础。

卡非佐米的药物暴露水平与其治疗效果及ADR密切相关18,19。卡非唑单具有剂量依赖性20，其暴露水平随体内剂量增加而呈正向增加，这可能直接影响其治疗效果。一项研究显示，卡非唑米在多发性骨髓瘤治疗中的完全反应率（CR）为28%，非常良好部分反应率（VGPR）为73%，总体反应率（ORR）为93%21。此外，与对照组相比，接受卡非唑吡酯治疗的患者心毒性发生率显著增加，而周围神经病变无显著变化。另一项研究也提到卡非唑米在治疗多发性骨髓瘤中的疗效和安全性，并确认卡非唑米可能增加心毒性风险，同时改善治疗效果22。因此，卡非佐米的疗效和ADR与暴露水平相关。迄今为止，在定量卡非佐米于人血浆中的经过验证的LC-MS/MS方法报告甚少，尤其是那些符合严格生物分析验证标准（如FDA指南）的。现有研究主要聚焦于动物模型或其他生物矩阵23,24，凸显了MM患者TDM临床适用检测方法的空白。

因此，迫切需要建立一种快速、精准且灵敏的检测方法，以监测多发性骨髓瘤患者卡非佐米的浓度，以优化其治疗效用和安全性。在这项工作中，我们开发并验证了一种可靠的LC-MS/MS方法，能够在3分钟内定量人血浆中的卡非唑米，展现出极佳的灵敏度和可重复性。该方法为卡非唑米在多重骨髓免疫药中的TDM开发，支持剂量优化和暴露反应评估。使用者必须注意药物在血浆中的不稳定性;准确定量要求在采血后4小时内完成样本处理。

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方案

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该研究方案经海军医科大学第二医院（上海长征医院）伦理委员会批准。所有参与研究的患者均签署了知情同意书。

1. LC-MS/MS仪器

  1. 使用超高性能液相色谱（UHPLC）系统，配合配备电喷雾电离（ESI）源的三重四极质谱仪，进行方法开发和样品分析。
  2. 配置UHPLC系统，包含在线除气器、二进制泵、自动采样器和柱式烤箱。
  3. 使用仪器制造商的数据采集软件进行数据采集和处理。

2. 液相色谱条件

  1. 使用ZORBAX-SB C18 柱（2.1毫米×100毫米，3.5微米）实现色谱分离。
  2. 保持柱温40°C。
  3. 进行等裂洗脱，流动相含20% 10 mmol/L醋酸铵在水中，80% ACN含量。
  4. 将流量设置为0.35 mL/min。
  5. 在这些条件下，确保分析物和内部标准（IS）的峰值形状对称，并保持适当的时间。
    注：选择卡非唑b-d8作为IS是因为其结构与卡非佐米相似，确保了提取回收率、色谱行为和电离效率的可比性。
  6. 将总播放时间设为3.0分钟。

3. 质谱条件

  1. 将质谱仪以负ESI模式操作。
  2. 将毛细管电压设为-6000伏。
  3. 使用氮气作为雾化和干燥气体。
  4. 使用高纯度氮气作为碰撞气体，压力为0.2兆帕。
  5. 保持雾化器压力在20 psi。
  6. 将干燥气体加热至400°C，并以10升/分钟的流量输送。
  7. 将护套气体温度设定为350°C，流量为12升/分钟。
  8. 以多反应监测（MRM）模式获取数据。
  9. 获取卡非佐米（见图1A）和IS（见图1B）的产物离子谱，以展示其破碎模式。
  10. 使用MS2扫描模式识别母离子。
  11. 使用MS2 SIM模式来优化碎片器的电压。
  12. 使用产物离子模式来确定最优碰撞能量（CE）。
  13. 详细说明卡菲佐米和IS的优化质谱参数（见表1）。

4. 校准与质量控制样品

  1. 通过准确称重2.0毫克卡非佐米，并溶解在2毫升甲醇（MeOH）中，制备1.0毫克/毫升的卡非佐米液。
    注意：甲氧水是易燃且有毒的。操作时应在排气罩内进行，以防止吸入蒸汽或接触皮肤。使用适当的个人防护装备，包括手套和眼部/面部防护。
  2. 将高汤溶液保存在-80°C。
  3. 通过连续稀释10%的MeOH生成工作溶液，达到100.0 μg/mL、10.0 μg/mL和1.0 μg/mL的浓度。
  4. 通过在空白等离子体中加入工作溶液来建立校准标准。
  5. 将带刺的血浆与空白血浆以1：9（v/v）比例稀释，得到最终浓度为2.0、5.0、50.0、200.0、500.0、750.0和1000.0 ng/mL。
  6. 在5.0 ng/mL（低）、200.0 ng/mL（培养基）和750.0 ng/mL（高）浓度下，使用相同方法独立制备质量控制（QC）样品。

5. 样品制备

  1. 预处理血浆样品（100微升）时加入20微升4%磷酸溶液。
    注意：磷酸具有腐蚀性。请戴手套、护目镜和实验服，以避免皮肤和眼神接触。如果接触到，请立即用大量水冲洗。
  2. 使用标准实验室涡旋混合器，以最大速度对样品进行2分钟的涡旋混合。
  3. 在混合物25中加入200微升ACN，确保含有浓度为200.0 ng/mL的IS溶液。
    注意：ACN易燃、易燃且有毒。所有操作必须在排气罩内进行，并远离热源和火焰。使用适当的个人防护装备，包括手套和眼部/面部防护。
  4. 漩涡，混合混合物再次出现。
  5. 在12,500×克 下离心10分钟，温度为4°C25。
  6. 收集100微升上清液。
  7. 将100微升上清液与100微升水混合。
  8. 将所得溶液转移到带有玻璃插入件的高效液相色谱（HPLC）小瓶中。
  9. 将10微升最终溶液注入LC-MS/MS系统进行分析。

6. 特异性评估

  1. 通过比较卡非佐米和IS在六批不同批次的空白血浆、IS掺信血浆、定量下限（LLOQ）样本和正品血浆样本中的反应来评估特异性。
  2. 如果分析物的响应低于LLOQ的15%，且IS响应低于5%，则认为干涉是可接受的。

7. 线性性评估

  1. 通过分析不同日子（至少两天）的三组校准标准来评估线性性。
  2. 使用加权线性最小二乘回归模型，基于至少六种校准标准生成校准曲线。
  3. 定义最低浓度标准为LLOQ。
  4. 要求每个标准的反推浓度必须在其标称值的±%以内，LLOQ的容差范围±为20%。

8. 精度与准确性判定

  1. 通过分析三个浓度水平下的五次QC样品重复和至少两天的LLOQ样本，确定日内和日间的精度和准确性。
  2. 将精度表示为相对标准差（RSD%），要求质量控制样品≤15%，LLOQ为≤20%。
  3. 准确率表示为相对误差（RE%），要求质量控制样品的准确率在±15%以内，LLOQ在±20%以内。

9. 恢复与矩阵效应确定

  1. 通过比较提取前掺入血浆的卡非唑米峰值面积与提取基质中相同浓度的卡非佐米峰值面积来确定回收率。
  2. 通过比较卡非佐米在提取基质中掺入的峰值面积与在相同浓度下洁净溶液中卡非唑米的峰值面积来评估基质效应。
  3. 如果矩阵效应因子的RSD%低于15%，则表示空白等离子体矩阵对分析物信号的影响一致。

10. 继承评估

  1. 在最高校准标准后立即注入空白样品，以检测前一次注入的残余分析物信号，以评估继承。
  2. 如果卡非佐米在空白样本中的反应低于LLOQ的20%，且IS反应的5%以下，则认为传递可接受。

11. 稀释效应评估

  1. 通过稀释浓度超过定量上限（ULOQ）的尖峰血浆样品，与空白血浆混合，使浓度达到校准范围，以评估稀释效应。
  2. 将测量浓度与名义浓度进行比较。

12. 稳定性评估

  1. 通过分析三种浓度水平和不同储存条件下的质量控制样品，评估稳定性。
  2. 将QC样品存放在室温下，6小时后分析。
  3. 将处理过的样品存储在自动采样器中，并在0、2、4和6小时进行分析。
  4. 将质量控制样品交替存放于−20°C和室温，进行三次冻融循环，然后进行分析。
  5. 在−80°C下保存质量控制样品两个月，然后进行分析。
  6. 将测量浓度与标称值进行比较，确认偏差在±15%（RE%）以内。

13. 患者登记与样本采集

  1. 获得所有患者的书面知情同意。
  2. 为MM患者登记并用卡菲尔佐米治疗。
  3. 给药后立即采集血液样本（静脉输注30分钟）。
  4. 通过离心将采集在EDTA-3K管中的血液样本，在4500 ×克 、4°C下离心10分钟，获得血浆样本。

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结果

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LC-MS/MS优化

为优化卡非唑米的检测，分析物在正负电离模式下的响应值进行了比较。负电离模式对卡非唑米的反应优于正电离模式，因此被选用于后续分析。我们比较了C8、C18和T3-C18 的表现，以选择最优。C18 柱为卡非唑米提供了最佳的峰值形状和响应。通过优化洗脱梯度，卡非佐米的保留时间从6.0分钟缩短至3.0分钟。最初的实验使用甲氧硼作为有机相，氢氧化铵水溶液作为水相，结果出现了不对称的峰形但存在显著尾矿。随后，采用ACN作为有机相，10 mmol/L的醋酸铵作为水相，产生了尖锐且对称的峰值形状。

样品提取优化

血浆样本采用不同比例（1：2、1：3）的蛋白质沉淀剂（包括甲氧和酸盐）进行预处理。以ACN为沉淀剂时，卡非佐米的恢复率更高（84%-10...

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讨论

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与传统的HPLC-UV和ELISA方法不同，LC-MS/MS提供了卓越的选择性、灵敏度和速度，有效解决了前辈的局限性。这些优势巩固了其作为复杂生物矩阵药物分析黄金标准技术的地位，尤其是在TDM和药代动力学研究中17。我们开发并验证了一种LC-MS/MS方法，用于定量人血浆中的卡非佐米。该方法的一个关键实用优势是样品制备简便。它仅涉及一次蛋白质沉淀步骤，使用两倍体积的ACN和随后的稀释步骤。这种简化的工作流程避免了复杂且耗时的提取程序。

在方法开发中，C18 柱因烷基链更长且疏水性更强，卡非佐米具有更强的保留力，而C8 柱则保留较弱，可能影响分离和敏感性。T3-C18 柱降低了硅醇活性，从而改善峰值形状并减少极性分析物的尾矿现象。通过系统比较这些固定相，C18 被选为卡非佐米的最佳柱子，提升峰值形状、改进响应，并采用可靠且可重复的定量方法，同时不影响分离效果。该方法实现了稳定且较高的...

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披露

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作者声明他们没有已知的竞争财务利益或其他利益冲突。

致谢

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该工作得到了白求恩慈善基金会：中国光辉——药物研究能力建设资金（Z04JKM2023E040）、国际合作与交流项目（编号2014DFA33010）以及上海东部才俊计划领先人才项目（SHSLJRC-TX）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈（ACN）德国达姆施塔特的默克公司34888LC-MS级
醋酸铵德国达姆施塔特的默克公司9689分析纯度：≥99.0%
分析平衡萨托留斯（德国））精度：0.01毫克
解析柱安捷伦科技（美国）安捷伦ZORBAX SB-C18,2.1倍及次;100毫米、3.5毫米及微距;m
卡非佐米上海元业生物技术（中国上海）868540-17-4分析标准样本，纯度>99%
卡非唑胺-d8上海元业生物技术（中国上海）分析标准样品，纯度>98%
数据采集软件安捷伦科技（美国）安捷伦Masshunter数据处理软件（6.0版）
数据分析软件安捷伦科技（美国）安捷伦MassHunter定量分析软件（版本10.1）
蒸馏水深圳沃森蒸馏水有限公司（中国深圳）LC-MS级
高效液相色相管（HPLC）小瓶与插入物上海泰坦科技有限公司（中国上海）-
液相色谱系统安捷伦科技（美国）安捷伦1200系列包括二元泵、在线除气器、自动取样器和柱温箱。
甲醇（MeOH）德国达姆施塔特的默克公司1.06035LC-MS级
微量移液器埃彭多夫（德国）多种测量范围（例如，10和微观;L、100和微型;L型、200和微型;L、1000 和微型;L)
办公室与统计软件-Microsoft Office 365;GraphPad 棱镜 9.5
磷酸德国达姆施塔特的默克公司49685分析纯度，85 wt.%
冷藏离心机埃彭多夫（德国）对于以4度离心的样品;C
三联四极质谱仪安捷伦科技（美国）G6475AA安捷伦1200系列，配备电喷雾电离源（ESI）
涡旋混合器Labnet （美国）S0200可调速

参考文献

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