人类粪便样本的DNA病毒大小分级宏基因组学

摘要

我们提出了一种灵活的方案，用于从人类粪便样本中获得高质量的病毒大小分馏宏基因组（病毒组）。该方案最初为土壤病毒组学开发，现成功应用于粪便样本，从而实现了对人类肠道病毒圈的可靠表征。

摘要

要理解健康人体病毒圈（微生物组中的病毒组分），需要对多种类型的病毒群落组成进行准确测量。在先前土壤病毒群落生态学方法的基础上，本文展示了一系列用于从人类粪便样本中富集并提取细胞外DNA病毒DNA的实验方法。我们提供了一个可操作的主要实验方案，并在不同步骤中列出了可选的调整方案。总体流程包括：加入液体缓冲液（默认：蛋白增强型磷酸盐缓冲液，PPBS），以促进从粪便基质中释放游离病毒颗粒；通过离心分离含有病毒颗粒的液体组分；过滤（默认：0.2 µm 孔径）以去除大多数细胞；浓缩病毒颗粒（默认：超速离心）；在病毒颗粒裂解前使用核酸酶去除游离核酸；最后提取DNA用于测序。文中还列举了其他可选技术，包括不同的缓冲液、滤膜孔径和浓缩方法。总体而言，本方案提供了多种生成高质量病毒组DNA用于测序的途径。该方案并未针对特定仪器或资源进行定制，其灵活性使其适用于配备不同常规分子生物学设备的各类实验室。

引言

病毒组学（viromics）是指对混合群落中病毒尺寸组分进行非靶向宏基因组测序，可揭示未培养病毒的多样性、进化及生态特征。二十多年前，研究人员首次尝试对肠道病毒群落进行编目，当时主要采用了针对环境样本（如海水）开发的方法¹。自此以来，病毒组学方法持续推动着人类微生物组中病毒生态学的研究进展²。然而，目前尚无统一通用的病毒组学实验流程，技术方法的差异可能影响测序结果^3,4，最终干扰对病毒群落动态的解读，并阻碍不同研究之间的比较。为了更可靠地表征人类病毒圈，亟需优化实验方案，并深入理解不同方法学选择对病毒组谱型的影响。

尽管目前尚无通用的病毒组学研究方案，但病毒组学方法的基本原理通常包括：根据病毒样颗粒（virions）的大小和/或密度，通过物理手段将其分离并富集；在裂解病毒颗粒之前，去除游离的核酸（部分来源于细胞碎片或结构受损的病毒衣壳）；随后提取DNA和/或RNA用于测序。某些病毒组学技术会特异性地富集或排除特定类型的病毒，这种选择性可能是研究人员的有意设计，也可能是方法本身带来的非预期局限性。注射器过滤或真空过滤常用于去除微生物细胞及其他杂质，而滤膜孔径的大小直接影响可回收病毒组的质量和组成。例如，过滤可提高病毒组的纯度⁵

方案

所有参与粪便样本采集的受试者均签署了知情同意书。样本采集方案已获得加州大学戴维斯分校机构审查委员会批准，研究符合《赫尔辛基宣言》的要求。本方案改编自 Emerson 等人（2022）¹⁷。

1. 材料准备

1. 制备蛋白增强型磷酸盐缓冲液（PPBS，10× PBS，1% K-柠檬酸盐，150 mM MgSO₄，2% 牛血清白蛋白（BSA））¹⁸。
   ​注：病毒组学方案中其他常用的缓冲液包括盐水-镁（SM）¹⁹ 和改良柠檬酸钾启动缓冲液（AKC’）¹¹。
   1. 在1个可高压灭菌的玻璃瓶（1 L）中加入10 mL 10× PBS、10 g K-柠檬酸盐、18.05 g 无水MgSO₄，然后用超纯实验室用水定容至1 L。调节pH至6.5（通常需要约50 µL 6 M HCl或约100 µL 2 M HCl）。在瓶内留置一个搅拌子，用于步骤1.1.2。
   2. 将装有缓冲液的瓶子和一个空的1 L可高压灭菌玻璃瓶一同进行高压灭菌。灭菌后，待缓冲液冷却至室温，将其置于磁力搅拌器上，缓慢直接加入20 g BSA，每次加入约5 g BSA（为避免起泡，应....

结果

将本方案应用于一份冷冻粪便样本（病毒组学分析中进行技术重复三次）以及两份土壤样本的探索性研究表明，该方案能够从不同类型的样本中获得高质量的病毒组。利用经质量过滤的测序数据以及本方案从头组装（de novo assembled）的重叠群（contigs），通过一款开源病毒识别工具²⁰鉴定出潜在的病毒序列。随后将比对到已鉴定病毒重叠群的测序读长用于估算各样本中病毒的相对丰度。粪便病毒组中病毒序列富集程度较高，病毒来源的读长平均占病毒组总测序读长的74%，而同一份样本产生的宏基因组中该比例仅为4%（图1A）。此外，从粪便样本中成功获得了高置信度的病毒基因组（图1B）。与土壤病毒组结果类似，粪便病毒组的平均病毒置信度评分较高，平均得分为0.97（最高分为1，表示序列为病毒的可能性最大）（图1B），表明所获得的重叠群极可能来源于病毒。值得注意的是，粪便病毒组重复样本组装所得病毒重叠群的平均病毒置信度评分显.......

讨论

本方案提供了一种相对简单且可调整的病毒组制备方法。该方法已在土壤样品中得到验证^14,15,16,21，本文中成功将其应用于人类粪便样本。本方案最适合回收细胞外完整DNA病毒，不旨在有意回收细胞内病毒或前噬菌体（尽管可能因污染细胞而回收到少量）、非常大的DNA病毒或RNA病毒。若需研究这些类群，可同时制备配对的细胞组分或宏基因组。该方案原理简单，虽然文中描述的是我们已验证成功的标准操作流程，但其关键步骤可根据具体需求和研究问题灵活调整。对滤膜孔径、缓冲液化学成分及病毒颗粒浓缩方法的多种修改均能获得可检测的DNA浓度，我们推测这些DNA在大多数情况下主要来源于病毒²¹。尽管不同修改方案所获得的病毒组DNA产量存在显著差异，但仍需后续测序与分析以明确其对病毒群落回收效果的影响。

使用较小.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白（BSA）无DNase和蛋白酶粉末	Fisher BioReagents	BP9706100	用于PPBS配方（步骤1.1）
DNeasy PowerSoil Pro试剂盒	QIAGEN	47016	DNA提取试剂盒（步骤4.1）
KAPA DNA HyperPrep文库构建试剂盒	Roche	n/a	使用该试剂盒构建的文库通过Illumina NovaSeq 6000平台进行测序（2 × 150 bp）。
硫酸镁（MgSO4），无水，≥99.5%	Sigma-Aldrich	M7506	用于PPBS配方（步骤1.1）
磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓度，pH 7.4，无RNase	Invitrogen	AM9624	用于PPBS配方（步骤1.1）
聚醚砜（PES）膜针筒式滤器，无菌，28 mm，0.2 μm	Corning	431229	用于针筒过滤（步骤2.9）
聚丙烯圆锥形离心管，无菌，50 mL	Olympus Plastics	28-108
柠檬酸钾一水合物（结晶级/认证级）	Fisher Chemical	P222	用于PPBS配方（步骤1.1）
Qubit 检测管	Invitrogen	Q32856	用于DNA定量（步骤5.1）
Qubit 4荧光计	Invitrogen	Q33238	用于DNA定量（步骤5.1）
Qubit双链DNA定量检测试剂盒	Invitrogen	Q32850	用于DNA定量（步骤5.1）
RQ1无RNase DNase	Promega	PR-M6101	包含反应缓冲液、DNase和终止液
Supor亲水性聚醚砜（PES）膜针筒式滤器，无菌，32 mm，5.00 µm	Cytiva（原Pall Lab）	28150-956	用于针筒过滤（步骤2.9）
超速离心机转子：50.2 Ti固定角转子，50,000 rpm，302,000 × g，12 × 39 mm	Beckman Coulter	337901	我们也使用Beckman Coulter 70 Ti固定角钛转子（货号337922）。若使用70 Ti转子，则离心3小时。
超速离心管：26.3 mL聚碳酸酯瓶带盖组件，25 × 89 mm	Beckman Coulter	355618	适用于Beckman Coulter的50.2 Ti（货号337901）和70 Ti（货号337922）转子
超速离心机：Beckman Instruments Optima LE-80K落地式超速离心机	Beckman Coulter	365668	我们也使用Beckman Coulter L8-70M制冷型超速离心机（货号344196）