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方法文章

人类粪便样本的DNA病毒大小分级宏基因组学

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DOI：

10.3791/70187

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2026年3月24日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

本文内容

摘要

我们提出了一种灵活的方案，用于从人类粪便样本中获得高质量的病毒大小分馏宏基因组（病毒组）。该方案最初为土壤病毒组学开发，现成功应用于粪便样本，从而实现了对人类肠道病毒圈的可靠表征。

摘要

要理解健康人体病毒圈（微生物组中的病毒组分），需要对多种类型的病毒群落组成进行准确测量。在先前土壤病毒群落生态学方法的基础上，本文展示了一系列用于从人类粪便样本中富集并提取细胞外DNA病毒DNA的实验方法。我们提供了一个可操作的主要实验方案，并在不同步骤中列出了可选的调整方案。总体流程包括：加入液体缓冲液（默认：蛋白增强型磷酸盐缓冲液，PPBS），以促进从粪便基质中释放游离病毒颗粒；通过离心分离含有病毒颗粒的液体组分；过滤（默认：0.2 µm 孔径）以去除大多数细胞；浓缩病毒颗粒（默认：超速离心）；在病毒颗粒裂解前使用核酸酶去除游离核酸；最后提取DNA用于测序。文中还列举了其他可选技术，包括不同的缓冲液、滤膜孔径和浓缩方法。总体而言，本方案提供了多种生成高质量病毒组DNA用于测序的途径。该方案并未针对特定仪器或资源进行定制，其灵活性使其适用于配备不同常规分子生物学设备的各类实验室。

引言

病毒组学（viromics）是指对混合群落中病毒尺寸组分进行非靶向宏基因组测序，可揭示未培养病毒的多样性、进化及生态特征。二十多年前，研究人员首次尝试对肠道病毒群落进行编目，当时主要采用了针对环境样本（如海水）开发的方法1。自此以来，病毒组学方法持续推动着人类微生物组中病毒生态学的研究进展2。然而，目前尚无统一通用的病毒组学实验流程，技术方法的差异可能影响测序结果3,4，最终干扰对病毒群落动态的解读，并阻碍不同研究之间的比较。为了更可靠地表征人类病毒圈，亟需优化实验方案，并深入理解不同方法学选择对病毒组谱型的影响。

尽管目前尚无通用的病毒组学研究方案，但病毒组学方法的基本原理通常包括：根据病毒样颗粒（virions）的大小和/或密度，通过物理手段将其分离并富集；在裂解病毒颗粒之前，去除游离的核酸（部分来源于细胞碎片或结构受损的病毒衣壳）；随后提取DNA和/或RNA用于测序。某些病毒组学技术会特异性地富集或排除特定类型的病毒，这种选择性可能是研究人员的有意设计，也可能是方法本身带来的非预期局限性。注射器过滤或真空过滤常用于去除微生物细胞及其他杂质，而滤膜孔径的大小直接影响可回收病毒组的质量和组成。例如，过滤可提高病毒组的纯度5，但可能遗漏较大的病毒颗粒6,7。病毒颗粒的浓缩方法（如超速离心、聚乙二醇（PEG）沉淀、密度梯度超速离心和超滤）在纯度、通量和设备成本之间也存在权衡3,8。目前已知多种缓冲体系适用于病毒组学研究。这些缓冲体系对病毒组特征的整体影响可能有限9，但储存和重悬缓冲液仍可能影响病毒的回收效率以及生物信息学分析所获得的病毒组谱型10,11。最后，由于自然样本中病毒核酸浓度通常较低，许多研究在文库构建前选择扩增病毒DNA（例如通过多重置换扩增（MDA）或序列非依赖性单引物扩增（SISPA））。然而，其中一些扩增技术会引入显著的偏差12,13。总体而言，尽管多种病毒组学方法均能成功生成病毒组数据，但采用经过优化、考虑偏差因素并具有一定标准化程度的实验流程，将有助于实现准确且可重复的病毒组研究。

本文介绍了一种从人类粪便样本中提取病毒组的灵活工作流程。该方案借鉴了已验证的土壤病毒组学技术14,15,16，包含多个便于修改的步骤，使研究人员可根据自身设备和研究需求进行调整。下文所述的标准土壤病毒组学方法已成功应用于土壤和冷冻粪便样本，可在无需病毒DNA扩增步骤的情况下获得高质量的病毒组文库。尽管其他研究已在不同程度上测试了本方案的若干修改建议，但本文未考察这些修改对人类粪便病毒组序列的具体下游影响。

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方案

所有参与粪便样本采集的受试者均签署了知情同意书。样本采集方案已获得加州大学戴维斯分校机构审查委员会批准，研究符合《赫尔辛基宣言》的要求。本方案改编自 Emerson 等人（2022）17。

1. 材料准备

  1. 制备蛋白增强型磷酸盐缓冲液（PPBS，10× PBS，1% K-柠檬酸盐，150 mM MgSO4，2% 牛血清白蛋白（BSA））18。
    ​注：病毒组学方案中其他常用的缓冲液包括盐水-镁（SM）19 和改良柠檬酸钾启动缓冲液（AKC’）11。
    1. 在1个可高压灭菌的玻璃瓶（1 L）中加入10 mL 10× PBS、10 g K-柠檬酸盐、18.05 g 无水MgSO4，然后用超纯实验室用水定容至1 L。调节pH至6.5（通常需要约50 µL 6 M HCl或约100 µL 2 M HCl）。在瓶内留置一个搅拌子，用于步骤1.1.2。
    2. 将装有缓冲液的瓶子和一个空的1 L可高压灭菌玻璃瓶一同进行高压灭菌。灭菌后，待缓冲液冷却至室温，将其置于磁力搅拌器上，缓慢直接加入20 g BSA，每次加入约5 g BSA（为避免起泡，应尽量减少溶液剧烈搅动，例如从低速开始搅拌，再逐步提高速度）。
    3. 将整个缓冲液体积通过无菌0.22 µm真空滤器过滤至步骤1.1.2中的空灭菌1 L瓶中。将缓冲液储存于4 °C直至使用。
      注：PPBS缓冲液可在4 °C下保存约3个月，但在高于冰点温度下长期储存不稳定。
  2. 准备超速离心管。
    ​注：本方案使用超速离心法浓缩病毒颗粒。其他常见方法包括聚乙二醇（PEG）沉淀法、密度梯度超速离心法（如氯化铯梯度）以及超滤法。
    1. 清洁超速离心管时，先用超纯实验室用水刷洗离心管，再用超纯实验室用水冲洗。
    2. 用1 M NaOH充满离心管，浸泡至少1小时（可过夜浸泡）。将塑料/橡胶离心管盖及其O型圈浸入1 M NaOH中进行清洗。
      注：切勿将金属螺口盖浸入NaOH中。
    3. 浸泡后，先用超纯实验室用水冲洗三次，再用无核酸酶、分子生物学级水冲洗一次。通过倒置并轻轻敲击使离心管干燥，或过夜自然晾干。用样品编号标记每个超速离心管。
  3. 将超速离心转子提前置于冰箱或冷室中过夜，使其在4 °C预冷。

2. 病毒粒子的纯化与浓缩

  1. 将粪便样品称重后放入无菌、无DNase、无RNase且无DNA的50 mL锥形管中。
    注意：所用粪便的量可根据可获得的样品量进行调整。此处使用了2 g粪便。如果需要将未使用的样品冷冻保存，请考虑在冷冻前将整个样品分装，以尽量减少后续的冻融循环。
  2. 直接向含有粪便的锥形管（锥形管#1）中加入8 mL PPBS缓冲液，并通过涡旋充分重悬。
  3. 在4 °C下以300 RPM振荡管子10分钟。
    注意：如有必要，可在室温下进行振荡，但推荐在4 °C下操作。
  4. 将锥形管#1中的样品在4 °C下以4,000 × g离心10分钟。
    注意：如有可能，使用摆桶转子，以便实现垂直密度分离，使后续步骤更简便。
  5. 小心地将上清液倾入一个新的无菌50 mL锥形管（锥形管#2）中，并在4 °C下保存（此处的上清液含有病毒颗粒）。不要丢弃含有沉淀物的锥形管（锥形管#1），因为它将在步骤2.6中再次使用。
  6. 重复步骤2.2–2.5两次（使锥形管#1中的样品总共经历3次缓冲液重悬、3次振荡和3次离心），并将上清液持续汇集至锥形管#2中。
    注意：三次重复后应累计获得约24 mL上清液。
  7. 将含有汇集上清液的50 mL锥形管（锥形管#2）在4 °C下以10,000 × g离心8分钟。
  8. 进行第二轮离心。首先，将锥形管#2中的上清液倾入一个新的50 mL锥形管（锥形管#3）中，然后将锥形管#3在4 °C下以10,000 × g离心8分钟。
  9. 使用注射器过滤法，依次过滤锥形管#3中的上清液，避免接触管底或靠近底部的沉淀物。先用无菌5.0 µm聚醚砜（PES）注射器滤器预过滤，再用无菌0.20 µm PES注射器滤器过滤，直接滤入超速离心管中。
    注意：使用5.0 µm滤器预过滤的目的是减少0.20 µm滤器的堵塞。若发生堵塞，仍需丢弃并更换注射器滤器。可通过将5 µm滤器堆叠在0.20 µm滤器上方，连接至同一注射器，并直接滤入超速离心管，实现一步过滤。优先选用PES膜，因为其他膜材料可能吸附病毒颗粒（如玻璃纤维）或更容易堵塞（如聚偏二氟乙烯，PVDF）。0.45 µm是另一种常用的滤膜孔径。
  10. 检查所有超速离心管及其内容物的质量，并根据质量配对放入超速离心机中。如有必要，向每对中较轻的管中添加PPBS以平衡重量（配对管之间的质量误差应控制在0.05 g以内）。
  11. 在4 °C下真空环境中以112,000 × g超速离心2小时25分钟。
    注意：根据所用转子的不同，离心时间会有所差异（依据沉降系数（s）= 58）。请参见材料表中列出的本实验所用转子。在从超速离心机中取出管子前，记录每个管子在转子中的方向，以帮助定位病毒沉淀。有时，超速离心后病毒沉淀不可见，在下一步去除上清液时应格外小心。

3. 病毒沉淀重悬与DNase处理

  1. 通过倾倒或使用移液器小心去除上清液，注意不要扰动沉淀，因为沉淀可能较为脆弱（沉淀中含有浓缩的病毒颗粒）。
    注意：如步骤 2.11 所述，沉淀可能可见也可能不可见，但通常可观察到一个针孔大小的棕色或黄色沉淀。
  2. 用 DNase 处理样品。
    注意：如果选择不对样品进行 DNase 处理，请直接进入步骤 4 并遵循“若未进行 DNase 处理”的操作说明。有关是否进行 DNase 处理的考虑因素，请参见讨论部分。
    1. 将沉淀重悬于 100 µL 无核酸酶、分子生物学级别的水中，并转移至已标记的 1.5 mL 微量离心管中。
    2. 为每个待处理样品配制 DNase 处理主混合液，每份样品加入 10 µL DNase 反应缓冲液和 10 µL DNase，用移液器充分混匀。
      注意：在步骤 3.2.3 中配制 DNase 处理主混合液时，应多准备若干份以补偿移液过程中可能发生的体积损失。
    3. 向重悬的病毒颗粒中加入 20 µL DNase 处理主混合液，轻轻吹打充分混匀。在 37 °C 下孵育 30 分钟。
    4. 加入 10 µL DNase 终止液以灭活核酸酶。短暂涡旋振荡。

4. 病毒核酸的提取

  1. 使用列表中的DNA提取试剂盒进行DNA提取 材料表.
    ​注意：对生产商说明书进行以下两项修改。1）在试剂盒操作步骤第1步后，将含有病毒颗粒的磁珠管置于缓冲液CD1中，在65 °C加热10分钟，然后按照生产商说明书继续进行提取。2）在DNA洗脱步骤（试剂盒操作步骤第16步）中，加入C6后，在室温下孵育柱子5分钟。
    1. 如果进行了DNase处理：在核酸酶失活后（步骤3.2.4），将全部体积用于DNA提取（即，在DNA提取试剂盒操作的第1步中，将此体积加入含有800 µL CD1的珠管中）。确保不要残留任何溶液（该溶液中含有病毒颗粒）。
    2. 如果未进行DNase处理：向含有第3.1步沉淀物的超速离心管中加入100 µL无核酸酶、分子级水。轻轻刮取沉淀并重悬。将重悬后的沉淀作为输入样本用于DNA提取。

5. DNA 定量

  1. 使用基于荧光的方法对提取的DNA进行定量。
    注意：病毒组DNA的得率通常不足以进行基于吸光度的定量；然而，该方法仍有助于识别化学污染物。
  2. 短期储存时，可在定量后将DNA保存在-20 °C；长期储存则应保存在-80 °C。DNA现已可用于文库构建和测序。有关本实验所用的文库构建试剂盒和测序平台，请参见材料表。

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结果

将本方案应用于一份冷冻粪便样本（病毒组学分析中进行技术重复三次）以及两份土壤样本的探索性研究表明，该方案能够从不同类型的样本中获得高质量的病毒组。利用经质量过滤的测序数据以及本方案从头组装（de novo assembled）的重叠群（contigs），通过一款开源病毒识别工具20鉴定出潜在的病毒序列。随后将比对到已鉴定病毒重叠群的测序读长用于估算各样本中病毒的相对丰度。粪便病毒组中病毒序列富集程度较高，病毒来源的读长平均占病毒组总测序读长的74%，而同一份样本产生的宏基因组中该比例仅为4%（图1A）。此外，从粪便样本中成功获得了高置信度的病毒基因组（图1B）。与土壤病毒组结果类似，粪便病毒组的平均病毒置信度评分较高，平均得分为0.97（最高分为1，表示序列为病毒的可能性最大）（图1B），表明所获得的重叠群极可能来源于病毒。值得注意的是，粪便病毒组重复样本组装所得病毒重叠群的平均病毒置信度评分显...

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讨论

本方案提供了一种相对简单且可调整的病毒组制备方法。该方法已在土壤样品中得到验证14,15,16,21，本文中成功将其应用于人类粪便样本。本方案最适合回收细胞外完整DNA病毒，不旨在有意回收细胞内病毒或前噬菌体（尽管可能因污染细胞而回收到少量）、非常大的DNA病毒或RNA病毒。若需研究这些类群，可同时制备配对的细胞组分或宏基因组。该方案原理简单，虽然文中描述的是我们已验证成功的标准操作流程，但其关键步骤可根据具体需求和研究问题灵活调整。对滤膜孔径、缓冲液化学成分及病毒颗粒浓缩方法的多种修改均能获得可检测的DNA浓度，我们推测这些DNA在大多数情况下主要来源于病毒21。尽管不同修改方案所获得的病毒组DNA产量存在显著差异，但仍需后续测序与分析以明确其对病毒群落回收效果的影响。

使用较小...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢加州大学戴维斯分校医学院的 Sean Adams 博士、Trina Knotts 博士和 Mohamed R. Ali 博士按照机构审查委员会（IRB）规程和伦理标准采集并提供了粪便样本。我们感谢科罗拉多大学博尔德分校的 Matthew R. Olm 博士在粪便样本分析方面的合作。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）共同基金（人类病毒组计划）资助，项目编号 U01DE034198。LSH 还部分得到了美国能源部（DOE）科学办公室、生物与环境研究办公室（BER）基因组科学计划的支持，项目编号为 DE-SC0023127（授予 JBE，项目负责人 Sydney Glassman）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛血清白蛋白（BSA）无DNase和蛋白酶粉末Fisher BioReagentsBP9706100用于PPBS配方（步骤1.1）
DNeasy PowerSoil Pro试剂盒QIAGEN47016DNA提取试剂盒（步骤4.1）
KAPA DNA HyperPrep文库构建试剂盒Rochen/a使用该试剂盒构建的文库通过Illumina NovaSeq 6000平台进行测序（2 × 150 bp）。
硫酸镁（MgSO4），无水，≥99.5%Sigma-AldrichM7506用于PPBS配方（步骤1.1）
磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓度，pH 7.4，无RNaseInvitrogenAM9624用于PPBS配方（步骤1.1）
聚醚砜（PES）膜针筒式滤器，无菌，28 mm，0.2 μmCorning431229用于针筒过滤（步骤2.9）
聚丙烯圆锥形离心管，无菌，50 mLOlympus Plastics28-108
柠檬酸钾一水合物（结晶级/认证级）Fisher ChemicalP222用于PPBS配方（步骤1.1）
Qubit 检测管InvitrogenQ32856用于DNA定量（步骤5.1）
Qubit 4荧光计InvitrogenQ33238用于DNA定量（步骤5.1）
Qubit双链DNA定量检测试剂盒InvitrogenQ32850用于DNA定量（步骤5.1）
RQ1无RNase DNasePromegaPR-M6101包含反应缓冲液、DNase和终止液
Supor亲水性聚醚砜（PES）膜针筒式滤器，无菌，32 mm，5.00 µm Cytiva（原Pall Lab）28150-956用于针筒过滤（步骤2.9）
超速离心机转子：50.2 Ti固定角转子，50,000 rpm，302,000 × g，12 × 39 mmBeckman Coulter337901我们也使用Beckman Coulter 70 Ti固定角钛转子（货号337922）。若使用70 Ti转子，则离心3小时。
超速离心管：26.3 mL聚碳酸酯瓶带盖组件，25 × 89 mmBeckman Coulter355618适用于Beckman Coulter的50.2 Ti（货号337901）和70 Ti（货号337922）转子
超速离心机：Beckman Instruments Optima LE-80K落地式超速离心机Beckman Coulter365668我们也使用Beckman Coulter L8-70M制冷型超速离心机（货号344196）

参考文献

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