本方案提供了一种可重复的空间转录组数据分析工作流程，指导用户完成公共数据获取、基于Seurat的质量控制、数据整合、空间特征检测、细胞类型去卷积、感兴趣区域注释以及细胞间通讯分析，并设置了实用的检查点，以支持透明化的操作执行。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
空间转录组学（ST）能够在保留组织切片中 mRNA 分子二维空间信息的同时，对全基因组范围内的基因表达进行分析，从而支持对组织结构和微环境相关生物学的研究。然而，ST 数据分析仍然具有挑战性，因为数据导入、质量控制、整合、去卷积、空间统计分析和可视化通常需要多个软件环境以及可重复的参数选择。本实验方案介绍了一种在 R 语言中处理公共 ST 数据集的实用计算流程，从数据获取和软件配置开始，依次进行基于 Seurat 的数据加载、质量控制、标准化、多样本整合、聚类分析以及空间可变基因分析。随后，该流程应用了多种互补的去卷积策略，包括基于参考的 SPOTlight 分析和无监督的 STdeconvolve 主题建模方法，继而采用基于 Giotto 的空间细胞间通讯分析，并通过自定义的 Python Dash 应用程序实现交互式感兴趣区域（ROI）选择。本方案强调基于脚本的执行方式、明确的参数设定依据、预期输出结果以及故障排查检查点，为标准阵列型 ST 数据集及相关平台提供了一个可灵活调整的分析框架，前提是需针对具体数据集和平台进行参数评估。
引言
空间转录组学（ST）是一类具有变革性的技术，可在保留组织切片内信使RNA（mRNA）分子空间坐标的同时，检测全基因组范围的基因表达。ST方法包括基于测序的技术，该技术使用带有位置条形码的阵列，以及 原位 在完整组织微环境中定位转录信号的成像方法1,2通过保留空间信息，空间转录组学（ST）能够分析组织结构、细胞邻域分布、细胞间通讯以及与微环境相关的生物学过程，而这些信息在组织解离后将无法完整解析。3.
公共空间转录组（ST）数据存储库的快速发展为二次分析和方法开发带来了前所未有的机遇3。诸如CROST数据库等资源汇集了跨越多个物种和技术平台的数百个空间分辨转录组数据集，而STOmicsDB等专业数据库则专注于特定技术方法，例如Stereo-seq4,5。尽管数据资源日益丰富，由于空间数据结构的复杂性、分析工具的多样性以及实现可重复工作流程中的技术障碍，计算分析仍然面临挑战6,7,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案中分析的所有生物数据集均为公开可用，且仅用于演示目的。相关步骤中提供了具体的数据编号及来源数据库。原始数据集由各原始研究者根据相应研究适用的机构伦理准则生成。请参见材料表以确认所有必需的软件及R语言程序包版本。
硬件要求：此工作流程所需的计算内存随分析的样本数和点数的增加而增加。对于典型的空間转录组学数据集（例如，每个样本约 3,000 个点，最多三个样本），配备至少 16 GB 内存的标准工作站足以运行该流程。然而，强烈建议使用 32 GB 或更高内存，以确保最佳性能和稳定性，特别是在进行 SCTransform 标准化以及去卷积过程中的矩阵分解等内存密集型计算步骤时。
1. 数据采集与目录结构准备
- 获取公开的空间转录组学数据集（例如，GEO 编号 GSE169749，提交日期为 2021 年 3 月 26 日，最后更新日期为 2022 年 3 月 6 日）以及单细胞 RNA 测序参考数据（例如，GEO 编号 GSE264408，提交日期为 2024 年 4 月 19 日，最后更新日期为 2024 年 12 月 10 日）。
- 从数据库下载原始数据压缩包（例如，GSE169749_RAW.tar）并解压该压缩包。
注意：本方案所用的代表性数据集中，解压后的目录包含每个样本的多个文件，文件名通....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
工作流程的实施与数据整合揭示了主要的组织特征
将计算工作流程应用于小鼠结肠空间转录组学数据，以展示各分析阶段的预期输出结果。如工作流程示意图（图1）所示，该流程从数据获取和质量控制开始，其中空间特征图可勾画出组织边界（图2A、B）。随后采用Seurat基于锚点的整合流程，以减少技术批次效应，同时保留可解释的生物学变异。整合后的UMAP可视化结果展示了样本的对齐情况及空间聚类模式（图2C、D）。通过基于累积方差的定量动态主成分（PCs）选择方法，指导降维和下游聚类分析（见补充图1）。标志基因热图分析揭示了空间聚类背后不同的转录谱特征（图2E）。
为了评估计算聚.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案提供了一套全面的空间转录组数据分析计算流程，在分析深度与实际可操作性之间实现了平衡。该逐步操作方法指导研究人员完成从初始数据获取到高级空间分析的整个分析流程，同时强调关键决策点和潜在的陷阱。
由于某些步骤会影响后续结果，因此在操作流程中需特别注意。质量控制和过滤阈值应根据特定的组织类型和技术平台仔细调整，因为过于严格的过滤可能会去除具有生物学意义的点，而过于宽松的阈值则可能引入技术噪声。标准化方法的选择会显著影响下游的聚类和差异表达分析结果。例如，本流程采用SCTransform而非标准的对数归一化方法，因为已有研究报道SCTransform能够建模并减少单细胞和空间工作流程中与测序深度及其他技术因素相关的技术变异14,15。在整合过程中，整合特征和分辨率参数的选择需要仔细权衡，以在保证整合强度的同时保留生物学信号。在空间可变基因识别方面，本流程选用Moran's I，因其在基于阵列的数据中具有计算可扩展性，并适用于空间自相关分析；然而，根据数据集大小和研究目.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
作者感谢 Seurat、Giotto 和 SPOTlight 软件包的开发与维护人员所提供的支持和文档。同时衷心感谢公共数据存储库以及慷慨分享其数据集的研究人员所做出的贡献。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ggplot2 | Posit Software, PBC | v4.0.0(CRAN) | 高级数据可视化 |
| Giotto | Dries 实验室 | v4.2.2 (GitHub) | 空间网络与细胞间通讯分析 |
| patchwork | Thomas Lin Pedersen | v1.3.2 (CRAN) | 图形组合与布局 |
| R 软件 | 统计计算基金会 R Foundation for Statistical Computing | v4.4.3 | 核心执行环境（macOS aarch64） |
| scater | Davis McCarthy 等 | v1.34.1 (Bioconductor) | 单细胞质量控制与可视化 |
| scran | Aaron Lun 等 | v1.34.0 (Bioconductor) | 单细胞方差建模与标志物检测 |
| Select Spatial Spots（自定义 Python 工具） | LeafLight | v1.0.0 (GitHub) | 交互式空间感兴趣区域（ROI）选择（https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots） |
| Seurat | Satija 实验室 | v5.3.0 (CRAN) | 空间数据预处理、整合与聚类 |
| SeuratObject | Satija 实验室 | v5.2.0 (CRAN) | 单细胞与空间数据的数据结构 |
| SingleCellExperiment | Bioconductor 核心团队 | v1.28.1 (Bioconductor) | 单细胞 RNA 测序的标准数据容器 |
| SPOTlight | Marc Elosua-Bayes 等 | v1.10.0 (Bioconductor) | 基于参考的无监督空间去卷积 |
| Stdeconvolve | Jean Fan 实验室 | v1.3.2 (Bioconductor) | 无监督潜在主题建模 |
| tidyverse | Posit Software, PBC | v2.0.0 (CRAN) | 核心数据操作与格式化套件 |
参考文献
- Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.
- Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.
- Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.
- Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcri....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
