小鼠心脏移植中急性抗体介导排斥反应的建立与分析

摘要

本研究建立了一种实用的小鼠心脏移植后急性抗体介导排斥反应模型，其特征为强效的DSA产生、典型的病理学改变以及中等程度的移植物存活率。

摘要

心脏移植受者移植物失功的主要原因是抗体介导的排斥反应（AMR）。因此，小鼠AMR模型成为解析其潜在机制并推动创新疗法开发的重要工具。本研究中，受体小鼠被分为三组：非致敏组（NS）、预先致敏组（PS）和预先致敏并接受环孢素A治疗组（PS + CsA）。NS组移植物平均存活时间为6.8 ± 0.7天，在心脏移植（CT）后4天内未见血清DSA水平升高，且移植物C4d染色呈阴性，提示其病理特征以急性细胞排斥为主。本研究通过在CT前一周对受体进行皮肤移植（ST）以实现预先致敏，从而预先激活免疫系统，建立急性AMR模型。该方法成功诱导出严重的AMR表型，表现为移植物存活时间显著缩短至2.8 ± 0.4天，ST及CT后DSA-IgG水平显著升高，并在CT后12小时内即出现血管炎和广泛的C4d沉积等早期病理特征。然而，该模型的极端严重性限制了其更广泛的应用。为减少ST引起的并发T细胞活化，并建立更具特异性的急性AMR模型，本研究使用了环孢素A进行干预。结果表明，PS + CsA组的移植物存活时间为5.2 ± 0.4天。血清DSA-IgG水平在ST后第7天显著升高，并在CT后5天内持续维持在高水平。CT后第2天的病理学评估证实存在明显的血管炎和C4d沉积，这些结果共同符合中度至重度急性AMR的诊断标准。综上所述，本研究建立了一种高度实用且具有转化价值的小鼠急性AMR模型，其特征为强烈的DSA产生、典型的病理改变以及中等程度的移植物存活时间。

引言

心脏移植（CT）仍是终末期心脏病的金标准治疗方案¹。尽管目前移植后的中位生存期已超过13年，但远期移植物失功仍不可避免²。抗体介导的排斥反应（AMR）是导致心脏移植后晚期移植物丢失的主要原因³。研究表明，由AMR引起的移植物丢失发生率高于T细胞介导的排斥反应，且晚发性AMR患者发生移植物失功的风险约为早期AMR的两倍^4,5。因此，对AMR进行早期识别并及时干预，对于改善移植物存活至关重要。

抗体介导的排斥反应（AMR）由供体特异性抗体（DSA）驱动，这些抗体会通过补体激活、血管炎症和缺血性损伤导致移植物功能丧失⁶。DSA 与血管内皮结合后会引发内皮损伤，促进血栓形成，并诱导急性和慢性炎症反应。DSA 介导损伤的主要机制包括补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性通路⁷。尽管已开发出靶向治疗药物，如抗 C5 抗体依库珠单抗（eculizumab）和 B 细胞清除剂利妥昔单抗（rituximab），但在晚期 AMR 患者中，临床疗效仍不理想^7,8,9。因此，利用急性动物模型进行进一步的机制研究，对于深入理解疾病进展并发现新的治疗靶点至关重要。

小鼠带血管异位心脏移植模型是研究心脏移植的成熟平台，尤其适用于缺血-再灌注损伤和排斥反应的研究^10,11,12。移植物功能通常通过每日腹部触诊心搏强度进行监测，该指标反映移植物功能状态并用于定义移植物失功¹³。然而，传统模型往往难以在移植后早期检测到抗体介导排斥反应（AMR）的发生，因此需要预先致敏以诱导供体特异性抗体（DSA）的形成并触发急性AMR。此外，不同小鼠品系的免疫反应性存在差异；例如，C57BL/6小鼠表现出更强的补体激活能力，而BALB/c小鼠则倾向于Th2偏移型免疫反应^14,15。因此，预先致敏策略和受体品系的选择均是决定模型性能的关键因素。

在既往研究中，本研究团队在皮肤移植（ST）后采用不同大鼠品系进行肾移植，建立了抗体介导排斥反应（AMR）模型并分析其特征，积累了丰富的经验^16,17,18。2021年，该团队进一步在CT小鼠中建立了ST诱导的急性AMR基础研究模型，该模型具有高度稳定性¹⁹。与同种异体输血预致敏效率相对较低²⁰或脾淋巴细胞输注操作更复杂且耗时较长²¹相比，皮肤移植提供了一种高效、稳定且操作简便的致敏方案。该模型可在移植早期检测到血清供体特异性抗体（DSA）水平升高以及急性AMR所致的移植物损伤，因此特别适用于急性AMR的干预研究。然而，皮肤移植诱导的急性AMR通常较为严重，造成显著的组织损伤，往往掩盖了慢性损伤的进展过程。本研究旨在进一步详细描述建立该模型所采用的方法与操作步骤，分析模型的免疫学与病理学特征，并总结实践经验。

方案

所有动物实验均严格遵循广东省实验动物管理规定、《赫尔辛基宣言》以及3R原则。实验方案已获得广州杰诺生物技术有限公司委员会批准（批准号：JENNIO-IACUC-2024-A027）。实验所用雄性Balb/c和C57BL/6小鼠（6–8周龄，体重20–25 g），均为无特定病原体（SPF）级，购自商业来源。本研究中使用的试剂和设备详见材料表。

1. 动物准备

1. 将SPF级小鼠饲养在适当的动物实验设施系统中。
2. 将小鼠分为三个实验组，如图1所示：
   1. 非致敏组（NS）：以Balb/c小鼠作为供体，C57BL/6小鼠作为受体进行CT。
   2. 预致敏组（PS）：以Balb/c小鼠作为供体，C57BL/6小鼠作为受体进行ST，一周后进行CT。
   3. 预致敏+环孢素A组（PS + CsA）：以Balb/c小鼠作为供体，C57BL/6小鼠作为受体进行ST，一周后进行CT。从ST当天开始，每天皮下注射CsA，剂量为2 mg/(kg·d)，持续至移植物失效或移植物样本采集为止。

2. 术前准备

1. 确保供体小鼠在手术前不禁食或禁水，而受体小鼠禁食 8 小时，但不禁水。
2. 麻醉
   1. 将小鼠放入麻醉诱导舱内进行诱导（异氟烷浓度：3%–4%；流速：300–500 mL/min）（遵循机构批准的方案）。轻摇诱导舱以检查动物是否已完全麻醉。
      注：若小鼠翻转至侧卧位且不试图恢复至俯卧位，则表明已完全麻醉。
   2. 在手术台上调整维持麻醉浓度后，将小鼠从诱导舱中取出，将其鼻部固定于麻醉面罩中（异氟烷浓度：1.0%–2.5%；流速：100–200 mL/min），并检查小鼠是否完全麻醉（用手指按压足爪或尾巴；若无反应，则表明已完全麻醉）。

3. 预致敏 通过 ST（适用于第2组和第3组）

1. 供体小鼠尾部皮肤的采集
   1. 用75%酒精对麻醉后的供体小鼠尾部皮肤进行消毒。
   2. 使用手术刀在尾部远端1/3处截断尾巴，用左手镊子固定残端，右手持手术刀沿尾静脉之间切开皮肤，暴露下方白色肌腱。然后用镊子固定尾骨，用弯头镊子夹住切口处的皮肤，小心将其剥离。
   3. 将剥离的皮肤放入盛有无菌冰冻生理盐水的烧杯中，组织面朝下。剪取一块1.0 cm × 1.0 cm大小的皮肤以备后续使用。
2. 受体小鼠背部皮肤移植
   1. 使用毛发修剪器剃除麻醉后受体小鼠背部区域的毛发，用75%酒精消毒，并铺上无菌洞巾。
   2. 使用手术刀切开皮肤，用有齿镊夹住皮肤边缘，用组织剪剪下略大于1.0 cm × 1.0 cm的皮肤，制备移植床。
   3. 将供体小鼠的皮肤移植物组织面朝下放置于移植床上。修剪移植物后，在显微镜下使用8-0尼龙线将供体皮肤缝合至受体皮肤，确保供体皮肤均匀地贴合于移植床上。
   4. 用无菌粘性敷料覆盖伤口，待小鼠恢复意识后放入饲养笼中。

4. CT

1. 供体心脏的获取
   1. 使用毛发剪刀剃除麻醉后供体小鼠胸腹部的毛发，用75%酒精消毒，并铺无菌洞巾。
   2. 用手术刀做腹正中切口，暴露下腔静脉上段，使用注射器向下腔静脉注入1 mL含50 U/mL肝素的冷生理盐水（4 °C）。
   3. 使用组织剪打开胸腔并暴露心脏。游离升主动脉，并在其第一分支前切断；游离肺动脉，并在分叉处横断；使用6-0无创缝线结扎下腔静脉及肺门处的结缔组织；在结扎部位远端用组织剪剪除多余组织，取出心脏。
   4. 迅速将获取的心脏置于2 mL高渗枸橼酸腺嘌呤（HCA）溶液中，并保存于冰水混合物中备用。采用颈椎脱位法处死供体小鼠。
2. 受体小鼠心脏移植（CT）
   1. 使用毛发剪刀剃除麻醉后受体小鼠腹部的毛发，用75%酒精消毒，并铺无菌洞巾。
   2. 用有齿镊提起皮肤，使用组织剪从剑突至膀胱基底部沿正中线切开腹壁。在切口两侧放置无菌湿润纱布以保护切口。
   3. 使用无菌棉签将肠袢推至切口右侧，并用湿润纱布包裹。钝性分离腹膜后，暴露下腔静脉和腹主动脉，结扎腰静脉，并使用血管夹阻断主动脉和下腔静脉的近端与远端血流。
   4. 在显微镜下，使用显微剪在静脉壁上做约2 mm切口，使其直径与供体心脏肺动脉相匹配；同样，在动脉壁上做1–2 mm切口，使其直径与供体心脏升主动脉相匹配。
   5. 取出供体心脏，使用12-0无创缝线将供体心脏肺动脉与受体下腔静脉行端侧吻合。同样，将供体心脏升主动脉与受体腹主动脉行端侧吻合（打最后一个结时，用生理盐水冲洗管腔以排除空气；吻合过程中间歇性滴加4 °C生理盐水于供体心脏表面以保持低温）。
   6. 松开血管夹，恢复心脏血供（可见冠状动脉正常充盈，心脏颜色转为粉红，并在1–2分钟内恢复搏动）。将肠袢复位后，使用4-0尼龙缝线关闭腹腔。
      注意：若术中出血量超过0.5 mL，应皮下注射生理盐水以维持体液容量。
   7. 术后将小鼠置于37 °C加热平台上进行监测。待受体小鼠意识恢复后，将其放回饲养笼中。小鼠术后可恢复正常饮食和饮水。

5. 术后护理与监测

1. 一般状况观察
   1. 术后需每日观察小鼠疼痛状态，注意是否存在食欲减退、活动减少、过度舔舐或抓挠伤口，以及攻击性增强等情况。
   2. 术后需每日观察手术伤口，检查是否有红肿、渗出液或化脓性感染症状。必要时对伤口进行清洁和消毒。
2. 心脏移植物存活情况观察
   1. 每日进行观察和触诊，检查并记录移植心脏搏动的强度。必要时对小鼠实施麻醉，并做切口以直视心脏跳动情况。
      注意：当移植心脏的搏动完全停止时，记录为移植物失功，并记录存活时间。

6. 术后评估

1. DSA 水平检测
   1. 在 NS 组中，于移植后第 0、4 和 7 天（CT 后）采集血液样本，以监测移植后 DSA 水平的变化。在 PS 组中，于 ST 后第 0、4 和 7 天以及 CT 后第 1 和 3 天采集样本，以评估预致敏后 DSA 的动态变化。在 PS+CsA 组中，于 ST 后第 0、4 和 7 天以及 CT 后第 1、3 和 5 天采集血液，以评估 CsA 对 DSA 水平的影响。
   2. 将受体小鼠的全血样本离心（2000 × g，10 分钟，4 °C），收集血清；用 PBS 将血清稀释 10 倍后，与供体小鼠脾细胞在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   3. 在 350 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟后，弃去上清液。用 1 mL PBS 轻柔吹打重悬细胞进行洗涤，随后再次离心，重复洗涤步骤两次。
   4. 将细胞与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗小鼠 IgG 抗体以及藻红蛋白（PE）标记的抗小鼠 IgM 抗体在 4 °C 下孵育 1 小时。
   5. 用 PBS 洗涤细胞后，重悬至浓度为 5 × 10⁶ /mL。
   6. 采用流式细胞术分别检测两种抗体，分析平均荧光强度（MFI），以评估受体小鼠体内 DSA 水平（IgG、IgM）。（参数设置：采集 10,000 个事件用于分析。使用 FSCA 与 SSCA 图排除碎片，再通过 FSCA 与 FSCH 门控去除双联体。设置阴性对照，并调节各通道电压，使阴性群体位于 10⁰-10¹ 范围内）。
2. 心脏移植物的组织病理学检查
   1. 在 CT 后 6 小时、12 小时、1 天、2 天、3 天、4 天和 5 天采集移植物。采集后，用 4% 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片并进行苏木精-伊红（H&E）染色。在 400 倍光学显微镜下观察移植物的病理变化。
3. C4d 染色
   1. 将石蜡包埋的组织切片切成 4 µm 厚度，在 42 °C 水中展片，随后置于 60 °C 烤箱中干燥 30 分钟。
   2. 依次使用二甲苯 I、二甲苯 II、乙醇和去离子水对组织进行脱蜡和水化。
   3. 将切片浸入 EDTA 抗原修复液中，在 95–100 °C 加热约 15 分钟，随后冷却至室温。
   4. 室温下用 3% 过氧化氢溶液孵育切片 10–15 分钟，以灭活内源性过氧化物酶。
   5. 用抗体稀释液将抗 C4d 抗体稀释至 1:200，4 °C 下与切片孵育过夜。孵育结束后，用 PBS 洗涤切片。
   6. 加入相应的二抗，室温孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤。
   7. 加入 DAB 显色液，室温孵育 30 秒进行显色。
   8. 用苏木精复染，乙醇脱水，浸入二甲苯透明，中性树胶封片。
   9. 在 400 倍光学显微镜下观察移植物的染色结果。

7. 统计分析

1. 使用均值 ± 标准差表示所有数据。
2. 对于符合正态分布的连续性数据，采用 t检验 进行组间比较；对于不符合正态分布的连续性数据，采用Mann-Whitney U检验进行组间比较。
3. 采用Kaplan-Meier分析比较各组间心脏异体移植物的存活时间。
4. 所有数据均使用SPSS 27.0版本进行统计分析，以P值 <0.05为差异具有统计学意义。

结果

心脏移植物存活时间
在成功建立小鼠模型后，采用Kaplan-Meier分析评估各组移植物的存活时间。正如预期，PS组小鼠的心脏移植物平均存活时间显著短于NS组（2.8 ± 0.4 天 vs. 6.8 ± 0.7 天，P < 0.01），此差异归因于急性抗体介导的排斥反应（AMR）。为了便于未来对急性AMR治疗策略的评估，使用环孢素A（CsA）以延长移植物存活时间并拓宽治疗窗口。结果显示，与PS组相比，PS + CsA组的心脏移植物存活时间显著延长（5.2 ± 0.4 天 vs. 2.8 ± 0.4 天，P < 0.01，图2A）。

DSA（IgG 和 IgM）水平
本研究进一步定量分析了各组小鼠血清中 DSA 的水平。在 NS 组中，仅在 CT 后第 7 天观察到 DSA-IgG 的 MFI 显著升高（574.3 ± 42.72 vs. 410.5 ± 57.97，P < 0.05），而在任何时间点均未检测到 DSA-Ig...

讨论

目前，晚期抗体介导排斥反应（AMR）的治疗仍无效，且缺乏可靠的早期诊断方法^22,23,24,25。为弥补这一空白，本研究建立了一种急性 AMR 小鼠模型，以促进其机制研究。受体小鼠先经ST预致敏，并给予CsA以抑制伴随发生的急性T细胞介导的排斥反应（aTCMR）。病理学分析显示，PS+CsA组移植物在术后第2天即出现典型的AMR病变，包括微血管损伤和C4d沉积，并伴有供体特异性抗体（DSA）的显著升高。与PS组相比，PS+CsA组受体小鼠的移植物存活时间延长，aTCMR严重程度降低。综上所述，这些结果证实了可重复且特异性的急性AMR模型的成功建立，为今后的机制研究和治疗探索提供了实用平台。

小鼠CT模型已有超过50年的研究历史，技术上从非血管化发展到血管化方法²⁶。与肾脏或肠道移植...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗C4d单克隆抗体	Hycult Biotech (荷兰)	HP8034	用于免疫组织化学检测（检测补体沉积）
显微外科手术器械全套	广州启华医疗器械有限公司		用于小鼠心脏移植手术操作
连续变倍立体手术显微镜	北京中天广正科技有限公司	TS-39NK	用于小鼠心脏移植手术操作
环孢素A	诺华制药（瑞士）	H20100673	用于抑制受体小鼠的T细胞介导排斥反应（TCMR）
FITC标记抗小鼠IgG抗体	Bio Legend (美国)	406001	用于流式细胞术定量检测DSA-IgG水平
流式细胞仪	Becton Dickinson, 美国	BD FACScalibur	用于评估受体小鼠血清中DSA水平
PE标记抗小鼠IgM抗体	Bio Legend (美国)	406507	用于流式细胞术定量检测DSA-IgM水平
小动物气体麻醉系统	安徽正华生物仪器设备有限公司	ZH-MZJ	配备异氟烷用于全身麻醉
血管夹（Bulldog钳）	ROBOZ SURGICAL INSTRUMENT CO.	RS-5481T	用于心脏移植过程中阻断血流