本实验方案描述了在非炎症条件下使小鼠定植 pks+ Escherichia coli 所需的步骤，以及验证定植效果和评估粪便中 pks+ E. coli 扩增情况的非侵入性方法。
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摘要
摘要
pks+ 大肠杆菌（Escherichia coli） increasingly 被认为与结直肠癌（CRC）的发生有关，尤其是在早发性结直肠癌年轻患者中这一亚群迅速扩大。pks+ 大肠杆菌菌株可产生一种基因毒素——colibactin，已知该毒素可导致 DNA 双链断裂，并在与 CRC 相关的细胞增殖和分化通路中引发突变。本文详细介绍了一种在非炎症条件下实现pks+ 大肠杆菌在小鼠体内定植的方法，涵盖细菌接种物的制备到定植效果的验证。经过过夜培养后，通过口服灌胃将pks+ 大肠杆菌菌株E. coli NC101 接种至经抗生素处理的小鼠体内。通过定量检测粪便中乳糖发酵型革兰氏阴性菌的菌落形成单位（CFUs）数量以及采用定量 PCR 扩增法来评估定植情况。利用该方案的研究显示，在成功实现E. coli NC101 菌株在 C57BL/6 小鼠体内的定植后，补充膳食纤维菊粉可促进pks+ 大肠杆菌的生长，表现为 CFUs 回收量增加、Enterobacteriaceae 科细菌丰度升高以及clbP 基因水平上升。总之，该模型可用于研究针对结直肠癌发生过程中关键致病共生菌的预防性和治疗性干预措施。
引言
肠道微生物群在宿主健康与疾病中具有重要作用，肠道菌群失调，即某些潜在致病菌（pathobionts）过度增殖，已被确认为多种疾病状态的特征，包括心血管疾病、炎症性肠病（IBD）和癌症1. 产pks大肠杆菌 是一种在炎症性肠病（IBD）患者结肠组织样本中富集的共生致病菌2 结直肠癌（CRC）3 与健康个体相比。肿瘤促进活性的 pks+ 大肠杆菌 与聚酮合酶（polyketide synthase，pks) 基因簇及基因毒素colibactin的产生4. 大肠杆菌素可转位至结肠上皮细胞的细胞核内，导致双链DNA断裂的形成5 以及结直肠癌相关关键通路中的突变6. pks+ 大肠杆菌 定植已被证明有助于肿瘤的启动7 和肿瘤进展3 在结肠炎相关性结直肠癌（CAC）的临床前模型中。最近，大肠杆菌素诱导的诱变已被关联于早发性结直肠癌8,9近年来，早发性结直肠癌（发生在50岁以下人群）的发病率持续上升，有可能逆转当前结直肠癌总体发病率下降的趋势。9.
pks+ 大肠杆菌的作用 在结直肠癌发生发展以及其他微生物群介导的宿主健康方面的作用机制仍在持续阐明中。此外，已有研究表明多种因素可产生影响 pks 基因表达，包括炎症10管腔铁浓度11以及饮食因素12,13，为靶向微生物群的干预措施开辟了道路。本文描述了一种方法 pks+ 大肠杆菌 肠道定植 通过 使用小鼠品系进行小鼠口服灌胃 pks+ 大肠杆菌 菌株 NC101（E. coli NC101）。其他模型已评估了 E. coli NC101对通过口服灌胃和直肠拭子接种的无菌（GF）小鼠炎症及致癌过程的影响3，在遗传易感性（IL-10）个体中-/-结肠炎模型3,14以及在化学诱导的结肠炎症和肠道屏障破坏模型中15然而，使用具有成本效益的方式进行定植 pks+ 大肠杆菌 在使用抗生素预处理以创造定植和扩增生态位的无特定病原体（SPF）小鼠中，也可在非炎症条件下获得14,16,17. 检测与定量的各种方法 pks+ 大肠杆菌 小鼠粪便中的结果也已展示，包括目标基因的定量PCR（qPCR）扩增 clbP 基因，通过qPCR评估该科的丰度 肠杆菌科，以及在麦康凯琼脂培养基上回收革兰阴性乳糖发酵菌的菌落形成单位（CFUs）。这些方法可互换使用或联合应用，以确认特定微生物的存在 pks+ 大肠杆菌 以及用于验证目的或评估产肠杆菌素差异的生产 pks+ E. coli 针对微生物群干预措施的扩增反应。
本方案通过qPCR和CFU回收来评估膳食纤维菊粉对pks+ E. coli定植与扩增的影响。菊粉是一种益生元，已被证明可促进肠道内有益的Bifidobacterium和Lactobacillus菌种的生长，并增加短链脂肪酸的产生，后者在维持肠道稳态中发挥重要作用18。然而，研究也发现菊粉可促进pks+ E. coli的生长及其colibactin的生成，从而在葡聚糖硫酸钠（DSS）处理的腺瘤性息肉病ApcMin/+结直肠癌（CRC）模型中加剧肿瘤发生。本实验旨在评估在无炎症或肠道屏障未受损的小鼠模型中，膳食菊粉对pks+ E. coli扩增的影响。
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方案
所有操作均在蒙特利尔大学医院研究中心（CRCHUM）机构动物护理委员会批准后，依照加拿大动物护理委员会的指南进行。实验所用七周龄小鼠购自商业来源，并在实验开始前适应环境一周。本方法的示意图见图1。本研究中使用的动物、试剂和设备的详细信息列于材料表中。
图1示意图 pks+ 大肠杆菌 制备与定植 第4天（D-4）：灌胃前4天开始给小鼠服用抗生素。第1天（D-1）：灌胃前24小时撤除抗生素。准备 pks+ E. coli 过夜培养。D0：准备 pks+ 大肠杆菌 细菌接种物。给予 pks+ 大肠杆菌 或向小鼠给予溶剂对照（生理盐水） 通过 接种物制备后应尽快通过口服灌胃给予。D7+ 收集小鼠粪便，用于检测和定量分析 pks+ 大肠杆菌 定植 请点击此处以查看此图的放大版本。
1. 抗生素处理
- 将氨苄青霉素、多粘菌素和链霉素溶于无菌饮水中，使其终浓度分别为氨苄青霉素 1 mg/mL、多粘菌素 1 mg/mL 和链霉素 5 mg/mL。
- 允许 随意摄取 连续3天在饮水中给予抗生素。
- 移除抗生素，并在灌胃前恢复无菌水供应，进行为期24小时的洗脱期 E. coli NC101 接种物
注意：抗生素溶液应每次实验前新鲜配制。应监测抗生素溶液的摄入量。如有必要，可向水中添加甜味剂。
2. 准备 E. coli NC101 接种物（最多 n = 12 只小鼠）
注意：步骤 2.1-2.8 应采用无菌技术操作。
- 制备并高压灭菌溶菌肉汤（Lysogeny Broth, LB）。
- 使用无菌接种环将甘油保存的 E. coli NC101 菌种划线接种至 LB 琼脂平板上。37 °C 培养过夜。
- 用接种环挑取 LB 琼脂平板上的单菌落，接种于装有 5 mL 无菌 LB 液体培养基的培养管中。在台式恒温摇床中 37 °C、150 rpm 条件下培养过夜。
- 在室温下以 1500 × g 离心 5 分钟。
- 小心移除并弃去上清液，避免扰动管底呈乳白色沉淀状的细菌菌体沉淀。
- 用 5 mL 0.9% 无菌生理盐水重悬细菌菌体沉淀。
- 重复步骤 4 至 6 进行洗涤。
- 使用细胞密度计测定 600 nm 处的光密度（OD600），并用无菌生理盐水将 OD600 调整至 0.625（约 1 × 108 CFU/只小鼠）。
注意：为确保步骤 3 中培养基无细菌污染，可另取 2–3 mL 无菌 LB 液体培养基于单独的培养管中过夜培养。若无菌状态良好，该培养基应保持澄清，无浑浊。若初始 OD600 小于 0.625，应重复步骤 4 至 6，并使用较小体积的生理盐水重悬菌体沉淀。为确保给予小鼠的 E. coli NC101 剂量准确，应对灌胃液进行系列稀释，涂布平板并过夜培养。根据各稀释度的菌落数，可推算出细菌悬液中的初始 CFU 数量。
3. 口服灌胃 E. coli NC101
- 轻轻振荡细菌接种液，以确保细菌分布均匀。
- 将灌胃针安装到1 mL注射器上，并吸取0.2 mL细菌接种液，排除所有气泡。
- 将小鼠从笼中取出，用拇指指腹和食指侧面轻轻但牢固地抓握小鼠耳后至肩胛之间的皮肤以固定其头部。用同一只手的中指或无名指固定尾巴。
- 将小鼠保持直立姿势，从口腔侧方插入灌胃针。将灌胃针尖端沿上颚滑入食道并进入胃部，同时轻轻向后推动小鼠头部以伸展颈部。若感到阻力，应立即退出灌胃针。必要时重新抓握固定小鼠后再尝试。
- 缓慢注入细菌接种液（0.2 mL），然后沿插入时的相同角度撤出针头。
- 将小鼠放回笼中，并对剩余小鼠进行相同操作。
注意：细菌接种液应在配制后尽快给予。对照组小鼠应给予0.2 mL的0.9%无菌生理盐水（载体）。灌胃针的合适长度、规格和球部直径应根据每项实验中小鼠的平均体重确定。操作后5分钟及离开动物设施前，应检查小鼠的呼吸模式和活动状态。若观察到呼吸困难或呼吸窘迫，应按照批准的方案实施安乐死。口服灌胃操作仅可由经过培训的研究人员执行。操作不当可能导致食道穿孔或将灌胃液注入肺部，从而引发严重并发症甚至死亡。由经验丰富的研究人员操作时，本程序不应导致动物死亡。本实验所用小鼠应在SPF条件下饲养。为防止笼间污染，应使用独立通风笼具，并在生物安全柜内操作小鼠。打开每个笼子前，应用适当的消毒剂（如加速过氧化氢）擦拭双手和笼盖外部。本方案中操作小鼠所需的个人防护装备（PPE）包括实验服（一次性或可重复使用）和手套。宿主动物设施可能要求额外的个人防护装备。所有涉及对照组小鼠的操作应优先进行。
4. 粪便样本的采集
- 按照步骤 3.3 所述方法抓起小鼠，从每只小鼠收集一粒粪便于 1.5 mL 微量离心管中。小鼠应立即排便。或者，将小鼠放入干净的空笼中，等待最多 30 分钟以使其排便。
- 将试管置于液氮中快速冷冻样品。将样品储存于 -80 °C，直至进一步分析。
注意：应在实验开始前通过实时 PCR 检测粪便中 clbA 的存在或对 clbP 进行定量，以确认小鼠未被 pks+ E. coli 定植。为了维持超过一周的定植状态，可能需要在不预先给予抗生素（步骤 2.1–3.6）的情况下重复进行细菌灌胃，具体取决于实验条件。首次实施本方案时，应至少每周通过菌落形成单位（CFU）回收法或实时 PCR 对粪便中的 E. coli NC101 进行定量，以优化给药频率。
5. 粪便细菌DNA提取
- 使用DNA提取试剂盒，按照制造商说明书从收集的粪便样本中提取细菌DNA。
- 使用分光光度计测定DNA浓度，并将DNA浓度调整至5 ng/µL。
6. 通过检测clbA和E. coli 16S基因确认定植
- 使用适当的PCR预混液和仪器，按照制造商说明书，通过PCR同时扩增clbA基因和E. coli 16S核糖体RNA（rRNA）基因（补充表1）。
- 通过琼脂糖凝胶电泳检测定植了E. coli NC101的小鼠体内clbA和E. coli 16S基因的存在，方法如先前所述19。未定植小鼠应无clbA条带。
7. 定量分析 E. coli NC101 通过菌落形成单位回收率
注意：使用无菌技术执行步骤 7.1-7.7。
- 称量一个空的 1.5 mL 微量离心管。
- 向该 1.5 mL 微量离心管中加入约 20 mg 粪便样本，并记录加入样本后管子的总重量。
- 向每根管中加入 200 µL 0.9% 无菌生理盐水。
- 室温下静置 10–15 分钟使粪便软化，然后以最大速度涡旋振荡每根管 5 分钟，以获得均一的悬液。未消化的食物残渣形成的细小颗粒仍可能可见。
- 将每种悬液中的 100 µL 转移至麦康凯琼脂平板中，使用 L 形涂布棒将悬液均匀涂布。
- 将平板在 37 °C 下孵育过夜。
- 计数粉红色菌落的数量，并根据每个粪便样本的重量和涂布体积进行标准化。
注意：麦康凯琼脂用于选择革兰氏阴性菌。此外，能够发酵乳糖的细菌（如 E. coli）会形成粉红色菌落，而不能发酵乳糖的细菌则形成无色或黄色菌落。本实验方案仅需计数粉红色菌落。若菌落数过多难以计数，可使用 0.9% 无菌生理盐水对初始匀浆液进行系列稀释。计算每份样本的菌落数时，需考虑稀释倍数。
粪便样本重量 = 含粪便样本的微量离心管重量 − 空微量离心管重量。
8. clbP 基因的定量分析
- 使用适当的预混液和实时荧光定量PCR仪器，按照制造商说明书，通过定量PCR扩增clbP基因和通用16S rRNA基因（补充表1）。
9. 定量分析 肠杆菌科
- 使用适当的实时荧光定量PCR预混液和仪器，通过定量PCR扩增肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和通用16S RNA基因（补充内容）。
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结果
通过PCR和凝胶电泳在实验终点检测粪便中clbA和E. coli 16S基因的扩增与可视化结果显示，在定植了E. coli NC101的小鼠中两种基因均可检出，而在对照组小鼠中仅能检出E. coli 16S基因，证实E. coli NC101不存在于对照组小鼠中（图2B）。
与预期一致15，接受添加菊粉饮食的小鼠体内大肠杆菌（E. coli）NC101的定植情况显示，经过一周后，E. coli NC101 的扩增更为显著，这通过在麦康凯琼脂培养的粪便匀浆中回收的更高菌落形成单位（CFU）得以确认（图 2C），同时clbP基因水平升高（图 2D）以及肠杆菌科（Enterobacteriaceae）丰度...
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讨论
产大肠杆菌素的pks+ E. coli的促癌作用最近已被证实与早发性结直肠癌（CRC）发病率的上升9以及“"西方化饮食"”的普及密切相关12，这些因素将在未来几十年持续影响结直肠癌的发展趋势。目前大多数关于pks+ E. coli定植的研究模型均基于结肠炎相关癌症背景，无法在非炎症条件下对pks+ E. coli进行特征分析。本实验方案描述了一种在小鼠中实现pks+ E. coli定植的方法，可用于研究涉及一种与结直肠癌发生及治疗耐药相关的致病共生菌的宿主-微生物群相互作用，同时有助于探索以减轻该菌有害影响为目标的靶向性微生物群干预治疗策略20,21。
在整个实验方案中，应采取若干步骤以确保各组小鼠中 pks+ E.coli 的定植达到最佳状态。在抗生素预处理阶段，小...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由加拿大卫生研究院（CIHR，资助号 CSV-198232）提供的资助支持。我们感谢CRCHUM动物实验中心的支持。图示使用BioRender.com制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 无菌生理盐水 | Baxter | JF7634 | |
| 含10%菊粉的定制饲料 | Teklad | TD.240286 | 代表性结果 |
| 无纤维、含50 ppm FeSO₄的定制饲料 | Teklad | TD.120515 | 代表性结果 |
| 8–12周龄雌性B6小鼠 | Charles River Laboratories | C57BL/6 | 代表性结果 |
| 氨苄青霉素钠盐 | Wisent Inc | 400-110 XG | |
| 台式离心机 | Fisher scientific | 75004381 | |
| 细胞密度计 | Biochrom | 80-2116-30 | |
| 13 mL培养管 | Sarstedt | 62.515.006 | |
| EcNC101 | N/A | N/A | 由北卡罗来纳大学教堂山分校Christian Jobin博士惠赠 |
| 灌胃针头，38 mm × 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | 已不再供应——可考虑使用Instech Labs提供的替代产品（FTP-22-38） |
| 恒温振荡摇床 | VWR | 980153 | |
| 接种环 | Fisher scientific | 22-363-595 | |
| L型涂布棒 | Fisher scientific | 14-665-230 | |
| LB培养基 | Wisent Inc | 800-060 LG | 将35 g LB粉末溶于1 L水中，使用前高压灭菌。 |
| LB琼脂培养基 | Wisent Inc | 800-011 LG | 将35 g LB粉末溶于1 L水中，使用前高压灭菌。 |
| 麦康凯琼脂 | Becton Dickinson | 211387 | 将50 g麦康凯粉末溶于1 L水中，使用前高压灭菌。 |
| 微生物DNA提取试剂盒 | Qiagen | 47016 | |
| 微生物培养箱 | Fisher scientific | 150152633 | |
| 1.5 mL微量离心管 | UltiDent Scientific | 73-M150-C | |
| 实时PCR用Rotor-Gene条形管 | UltiDent Scientific | 73-V100-RG | |
| 培养皿 | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| 实时PCR SYBR Green预混液 | ThermoFisher | A25742 | |
| 实时PCR仪 | Corbett Research | RG-3000A | |
| 15 mL螺口管 | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 硫酸多黏菌素钠 | Fresenius Kabi | C309306 | |
| 硫酸链霉素 | Millipore Sigma | S9137 | |
| 1 mL结核菌素注射器 | Becton Dickinson | 309659 | |
| 涡旋振荡器 | Fisher scientific | 12-812 |
参考文献
- Hou, K., et al. Microbiota in health and diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 135(2022).
- Martin, H. M., et al. Enhanced Escherichia coli adherence and invasion in Crohn's disease and colon cancer. Gastroenterology. 127 (1), 80-93 (2004).
- Arthur, J. C., et al. Intestinal Inflammation targets cancer-inducing activity of the microbiota. Science. 338 (6103), 120-123 (2012).
- Nougayrède, J. -P., et al. Escherichia coli Induces DNA double-strand breaks in eukaryotic cells. Science. 313 (5788), 848-851 (2006).
- Dziubańska-Kusibab, P. J., et al. Colibactin DNA-damage signature indicates mutational impact in colorectal cancer. Nat Med. 26 (7), 1063-1069 (2020).
- Iftekhar, A., et al. Genomic aberrations after short-term exposure to colibactin-producing E. coli transform primary colon epithelial cells. Nature Commun. 12 (1), 1003(2021).
- Yang, Y., Gharaibeh, R. Z., Newsome, R. C., Jobin, C. Amending microbiota by targeting intestinal inflammation with TNF blockade attenuates development of colorectal cancer. Nat Cancer. 1 (7), 723-734 (2020).
- Rosendahl Huber, A., et al. Improved detection of colibactin-induced mutations by genotoxic E. coli in organoids and colorectal cancer. Cancer Cell. 42 (3), 487-496.e6 (2024).
- Díaz-Gay, M., et al. Geographic and age variations in mutational processes in colorectal cancer. Nature. 643 (8070), 230-240 (2025).
- Arthur, J. C., et al. Microbial genomic analysis reveals the essential role of inflammation in bacteria-induced colorectal cancer. Nat Commun. 5 (1), 4724(2014).
- Tronnet, S., et al. High iron supply inhibits the synthesis of the genotoxin colibactin by pathogenic Escherichia coli through a non-canonical Fur/RyhB-mediated pathway. Pathog Dis. 75 (5), ftx066(2017).
- Arima, K., et al. Western-style diet, pks Island-carrying Escherichia coli, and colorectal cancer: Analyses from two large prospective cohort studies. Gastroenterology. 163 (4), 862-874 (2022).
- Oliero, M., et al. Oligosaccharides increase the genotoxic effect of colibactin produced by pks+ Escherichia coli strains. BMC Cancer. 21 (1), 172(2021).
- Thakur, B. K., et al. Dietary fibre counters the oncogenic potential of colibactin-producing Escherichia coli in colorectal cancer. Nat Microbiol. 10 (4), 855-870 (2025).
- Oliero, M., et al. Inulin impacts tumorigenesis promotion by colibactin-producing Escherichia coli in ApcMin/+ mice. Front Microbiol. 14, 067505(2023).
- Jans, M., et al. Colibactin-driven colon cancer requires adhesin-mediated epithelial binding. Nature. 635 (8038), 472-480 (2024).
- Devaux, A., et al. L-serine promotes pro-carcinogenic effects of colibactin-producing E. coli. Gut Microbes. 17 (1), 2515480(2025).
- Li, L. L., et al. Inulin with different degrees of polymerization protects against diet-induced endotoxemia and inflammation in association with gut microbiota regulation in mice. Sci Rep. 10 (1), 978(2020).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
- Oliero, M., et al. Putrescine supplementation limits the expansion of pks+ Escherichia coli and tumor development in the colon. Cancer Res Commun. 4 (7), 1777-1792 (2024).
- Jans, M., Vereecke, L. Physiological drivers of pks+ E. coli in colorectal cancer. Trends Microbiol. , (2025).
- Lavelle, A., et al. Baseline microbiota composition modulates antibiotic-mediated effects on the gut microbiota and host. Microbiome. 7 (1), 111(2019).
- Russell, A., et al. Reduced housing density improves statistical power of murine gut microbiota studies. Cell Rep. 39 (6), 110783(2022).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
- Harnack, C., et al. Short-term mucosal disruption enables colibactin-producing E. coli to cause long-term perturbation of colonic homeostasis. Gut Microbes. 15 (1), 2233689(2023).
- Gurbatri, C. R., et al. Engineering tumor-colonizing E. coli Nissle 1917 for detection and treatment of colorectal neoplasia. Nat Commun. 15 (1), 646(2024).
- Yang, S., et al. Surface expression of antitoxin on engineered bacteria neutralizes genotoxic colibactin in the gut. Nat Microbiol. 11 (1), 53-66 (2026).
- Tronnet, S., et al. The Genotoxin colibactin shapes gut microbiota in mice. mSphere. 5 (4), (2020).
- Condamine, B., et al. Strain phylogroup and environmental constraints shape Escherichia coli dynamics and diversity over a 20-year human gut time series. ISME J. 19 (1), (2024).
- Cougnoux, A., et al. Bacterial genotoxin colibactin promotes colon tumour growth by inducing a senescence-associated secretory phenotype. Gut. 63 (12), 1932(2014).
- Oliero, M., et al. Prevalence of pks + bacteria and enterotoxigenic Bacteroides fragilis in patients with colorectal cancer. Gut Pathog. 14 (1), 51(2022).
- Chen, J., et al. A commensal-encoded genotoxin drives restriction of Vibrio cholerae colonization and host gut microbiome remodeling. PNAS. 119 (11), e2121180119(2022).
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