本研究采用16S rRNA测序技术，比较了健康对照组、未经治疗的帕金森病（PD）患者以及接受吡贝地尔治疗的PD患者之间的肠道微生物群，并鉴定了与吡贝地尔治疗相关的微生物组成差异。
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本研究采用16S rRNA测序技术，比较了健康对照组、未经治疗的帕金森病（PD）患者以及接受吡贝地尔治疗的PD患者之间的肠道微生物群，并鉴定了与吡贝地尔治疗相关的微生物组成差异。
本研究旨在确定培高利特治疗是否改变帕金森病（Parkinson’s disease, PD）患者的肠道微生物群，为理解培高利特诱导的肠道微生物群变化及其潜在临床意义提供理论参考。采用16S核糖体RNA（16S rRNA）基因测序分析粪便样本。比较接受培高利特治疗的PD患者（培高利特组）、未接受培高利特治疗的PD患者（PD组）与健康对照者（空白组）之间的差异。与空白组相比，培高利特组中某些菌属的相对丰度 金黄色葡萄球菌，红球菌，而帕金森病组中其他属的相对丰度较高，而 不动杆菌属 和 Delftia 较低。此外，相对丰度 不动杆菌属，德尔夫特菌属 和 施氏假单胞菌 吡拉西坦组的相对丰度高于帕金森病组，而相对丰度 金黄色葡萄球菌，红球菌属， 与其他物种相比含量较低。与健康个体相比，帕金森病（PD）患者的肠道微生物群表现出显著变化。服用吡贝地尔的PD患者其肠道微生物群与未治疗患者有明显差异。这些结果提示吡贝地尔与PD患者肠道微生物群的改变之间存在关联。
帕金森病（PD）的发病率正逐渐上升，但其病因和发病机制尚未完全阐明。越来越多的研究表明，肠道微生物群与帕金森病的发生和发展密切相关。He 等人1指出，帕金森病患者的肠道微生物群组成与健康人群存在差异，且肠道致病菌的增加可能与帕金森病的发病相关。Scheperans 等人2证实，帕金森病患者肠道中Prevotella和Bacteroides的相对丰度降低，而这些菌属与肠道屏障功能密切相关。
多项研究已探讨了肠道微生物群与帕金森病（PD）之间的关联。研究表明，菌群失调可能通过多种机制（包括炎症和代谢紊乱）在PD的病理生理过程中发挥关键作用，影响运动和非运动症状3。此外，用于治疗PD的药物已被证实会改变肠道微生物组的组成4,5，凸显了药物与肠道微生物组之间复杂的相互作用。
作为非选择性多巴胺受体激动剂，吡贝地尔在帕金森病（PD）的治疗中具有重要作用；通过刺激多巴胺受体，可改善患者的运动症状6。然而，其临床应用常受到不良反应的限制，主要为胃肠道症状，包括恶心、呕吐和腹部不适7。这些副作用的潜在机制尚不明确，且吡贝地尔是否通过引起肠道微生物群的变化而导致这些症状，目前仍不清楚。
近年来，肠道微生物群与药物不良反应之间的关联受到越来越多的关注。Hill-Burns 等人8分析了帕金森病（PD）患者的肠道微生物群，发现肠道微生物群的多样性与药物治疗反应相关。此外，多巴胺受体激动剂可能影响肠道蠕动功能和微生物组成9。这些变化背后的机制被认为涉及肠道转运时间的改变，从而影响微生物的多样性和丰度。而且，肠道微生物群可影响药物的吸收和代谢10，进而影响这些药物的疗效和副作用。然而，目前仍缺乏关于吡贝地尔（一种常用于治疗帕金森病的药物）是否以及如何调节肠道微生物群结构的系统性研究，也尚未明确此类微生物变化与其胃肠道不良反应之间的关联。
在本研究中，我们比较了健康对照者、未经治疗的帕金森病（PD）患者以及接受吡贝地尔治疗的PD患者之间的肠道微生物群结构。我们假设，吡贝地尔治疗与PD患者肠道微生物群组成发生特异性改变相关，且这些微生物变化可能与吡贝地尔相关的胃肠道不良反应有关。本研究旨在鉴定与吡贝地尔相关的特定微生物改变，并探讨其与胃肠道不良反应的潜在关联，从而为理解吡贝地尔相关不良反应的机制提供理论依据。
肠道微生物群是帕金森病（PD）发病机制研究的重要方向11。通过观察吡非尼酮对PD患者肠道微生物群的影响，本研究有助于阐明药物相关肠道微生物群变化的临床意义，并为优化吡非尼酮的临床应用及安全管理提供参考。
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本研究经安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会审查（伦理审查编号：2025AH-101，伦理批准日期：2025-07-02）。
研究对象
在安徽中医药大学第一附属医院招募帕金森病（PD）患者和健康对照者。采集新鲜粪便样本用于后续分析。采集的新鲜粪便样本被分装至无菌EP管中，立即在液氮中速冻，随后于−80 °C长期保存。PD患者的纳入标准如下：（1）临床诊断为帕金森病；（2）年龄>70岁；（3）对于吡贝地尔组：入组后开始接受吡贝地尔单药治疗，且此前未使用过该药物；对于PD组：未接受抗帕金森病药物治疗；（4）无其他严重全身性疾病，如严重心脏病、肝病、肾病或癌症。在入组前，所有参与者均签署书面知情同意书。排除标准如下：（1）PD严重并发症，如严重运动功能障碍；（2）近期接受过抗生素治疗；（3）存在可能影响研究结果的其他健康状况，如炎症性肠病、肠易激综合征等；（4）对吡贝地尔过敏。健康对照者（空白组）为年龄匹配（年龄>70岁）、无神经系统疾病或重大胃肠道疾病史的个体。
所有参与者在入组前均需保持其日常饮食习惯。参与者均未接受过益生菌、益生元、膳食纤维补充剂或其他营养补充剂。此外，所有参与者在样本采集前至少三个月内未接受过任何抗生素治疗。研究期间未实施标准化的饮食干预，但要求所有参与者保持稳定的生活方式和饮食习惯，以尽量减少对肠道微生物组的潜在混杂影响。
研究分组
本研究队列分为三组：帕金森病组（PD组，n = 10）：采集自未服用抗帕金森病药物的帕金森病患者的粪便样本。吡贝地尔组（n = 10）：采集自帕金森病患者连续21天接受吡贝地尔治疗（50 mg，每日两次）后的粪便样本。空白对照组（n = 5）：采集自健康个体的粪便样本。
16S 核糖体 RNA 测序
测序在测序平台上进行，具体方法如其他研究中所述12,13，简言之，采用十二烷基硫酸钠（SDS）法从粪便样本中提取总微生物DNA14,15,16提取的DNA完整性通过1%琼脂糖凝胶电泳进行验证，使用分光光度计测定DNA浓度和纯度。利用简并引物341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’），在聚合酶链式反应（PCR）扩增仪中对细菌16S rRNA基因的高变区V3-V4进行扩增。细菌16S rRNA基因的扩增程序如下：94 °C预变性2 min；随后进行28个循环，每个循环包括94 °C变性30 s、55 °C退火30 s、72 °C延伸30 s；最后在72 °C延伸10 min，并将反应体系维持在4 °C。PCR反应体系包含：2× PCR预混液25 μL、正向引物（10 μM）2 μL、反向引物（10 μM）2 μL、模板DNA 10 ng，最后用ddH₂O补足至总体积。2O 至 50 μL。PCR 反应设三个重复。PCR 反应体系包含 2× PCR 超级混合液 25 μL、正向引物（10 μM）2 μL、反向引物（10 μM）2 μL、模板 DNA 10 ng，最后加 ddH₂O 至终体积。2O至50 μL。PCR反应设三个重复。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳回收，使用胶回收试剂盒进行纯化。采用MGI V2通用Plus DNA文库构建试剂盒建库：（1）片段连接；（2）利用磁珠筛选去除接头自连片段；（3）通过PCR扩增富集文库模板；（4）磁珠回收PCR产物；（5）PCR产物环化。文库验证合格后进行测序。
质量控制点：检查点 1（样本采集）：样本采集后立即速冻，并于 −80°C 保存。任何出现明显融化或污染迹象的样本均被弃用。检查点 2（DNA 提取）：可接受的纯度：A260/A280 = 1.8–2.0，A260/A230 ≥1.8；通过 1% 琼脂糖凝胶电泳显示单一高分子量条带确认完整性。检查点 3（PCR 扩增）：在 2% 琼脂糖凝胶上约 460 bp 处出现单一条带表明扩增成功（引物 341F/806R，V3-V4 区域）；若条带缺失或非特异性，需调整退火温度或模板浓度。文库构建所需回收浓度须 ≥0.5 ng/μl。检查点 4（文库构建与测序）：由测序机构依照其经过验证的标准操作流程完成；未设置额外的内部质控步骤（如 Bioanalyzer 片段分析）。
安全与废物处理：所有样品操作过程中均佩戴手套和实验服。工作台面使用70%乙醇清洁。所有被污染的耗材（枪头、离心管、凝胶）均需经高压灭菌（121°C，20分钟）后，作为生物危害废物进行处置。
生物信息学
16S rRNA基因的原始测序读长首先进行解复用，随后使用fastp（版本0.20.0）进行质量过滤，并依据标准化筛选标准通过FLASH（版本1.2.11）进行序列拼接。简要步骤如下：（i）当50 bp滑动窗口内的平均质量值低于20时，对原始300 bp序列进行截短处理；去除截短后长度小于50 bp或含有模糊碱基的读长；（ii）仅对重叠区域超过10 bp的序列进行拼接，重叠区域的最大错配比例设为0.2，未能成功拼接的未配对读长将被剔除；（iii）根据条形码和引物序列对各个样本进行划分，以进行后续的方向校正。条形码匹配要求完全比对，而引物匹配允许最多2个核苷酸错配。使用Quantitative Insights into Microbial Ecology（QIIME）分析流程（版本1.8.0）17对16S rRNA读长进行分析。使用FLASH（版本1.2.11）18将标签序列附加至双端读长。采用UPARSE（版本7.0.1090） 进行序列截短，要求最小长度为200 bp且平均质量值不低于25，随后在97%的相似性阈值下进行聚类，以生成操作分类单元（OTUs）19。代表性OTU序列通过RDP Classifier 2.2进行分类学注释，置信度阈值≥0.6。使用USEARCH global20比对确定标签和读长的丰度。嵌合序列的鉴定基于与Gold数据库的比对，使用UCHIME（版本4.2.40）21完成。随后基于Bray–Curtis相异度，在稀疏化数据集上进行主坐标分析（PCoA），聚类时序列相似性阈值设为97%。代表性OTU及其对应的分类谱型进一步使用R软件（版本3.1.1）进行分析。采用基于线性判别分析（LDA）效应量的线性判别分析效应量（LEfSe）算法，筛选在OTU水平上具有显著差异丰度的生物标志物。该方法通过两个步骤强调统计显著性和生物学相关性：首先识别在不同组间具有一致差异的特征（采用Kruskal-Wallis检验进行多组比较），然后利用LDA估计每个差异丰度特征的效应量。LDA得分>2.0被定义为丰度显著升高22。
统计学方法
统计分析使用 SPSS 进行。符合正态分布的数据采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析。不符合正态分布的数据采用 Wilcoxon 秩和检验进行分析。所有定量数据中，符合正态分布的参数以均值 ± 标准误（SE）表示，而不符合正态分布的数据则以中位数和四分位距表示。当 p 值 < 0.05 时，认为差异具有统计学意义。
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与吡拉西坦治疗相关的微生物多样性差异
DNA 提取质量控制结果（浓度范围、纯度）见补充表 1。PCR 扩增质量控制（条带大小、回收浓度）见补充表 2。测序质量控制指标（读长数量、测序深度、覆盖度）详见补充表 3。采用 ACE、Chao1、InvSimpson、Shannon 和 Simpson 指数分析粪便样本中的肠道微生物群。ACE 和 Chao1 指数结果显示，空白组与 PD 组之间肠道微生物群多样性无显著差异。然而，InvSimpson、Shannon 和 Simpson 指数结果表明，空白组的肠道微生物群多样性显著低于 PD 组（图 1A）。在 PD 组与吡贝地尔组的比较中（图 1B），ACE、Chao1、InvSimpson、Shannon 和 Simpson 指数的分析均显示，PD 组的肠道微生物群多样性显著高于吡贝地尔组。这些结果提示，空白组与 PD...
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帕金森病是全球第二常见的神经退行性疾病，仅次于阿尔茨海默病23。自1970年以来，培高利特作为多巴胺受体激动剂，已被广泛用于帕金森病的治疗24。然而，在临床实践中，培高利特可能引起一些不良反应，例如恶心、呕吐和胃肠道不适。越来越多的研究表明，帕金森病的发展以及多巴胺受体激动剂的治疗干预均能够重塑肠道微生物群落的结构。
成功的微生物组分析依赖于多个关键步骤：粪便样本采集后需立即冷冻（30分钟内），以防止细菌过度生长；采用SDS法进行一致的DNA提取；严格的PCR质量控制（在2%琼脂糖凝胶上检测到单一约460 bp的条带）；以及DNA纯度验证（A260/A280为1.8–2.0，A260/A230≥1.8）。若PCR未产生条带，可检查DNA纯度或调整退火温度；若出现非特异性条带，可减少循环次数或使用新鲜分装的冷冻粪便样本（避免反复冻融）。本方案使用常规试剂（SDS、2×Es Taq MasterMix、标准琼脂糖凝胶）和开源生物信息学工具（QIIME、UPARSE、LEfSe），便于其他实验...
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作者声明不存在利益冲突。
本研究得到安徽省学术和技术带头人后备人选资助项目（编号：2022H287）、安徽省卫生健康杰出人才项目（编号：ahsjhmypygc20230074）、安徽省中医药传承与创新科研项目（编号：2025CCCX017）以及安徽中医药大学基础与临床结合专项项目（编号：JCLCA2025009）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2× 反应缓冲液（Taq MasterMix） | Kangweii | CW0690 | |
| 琼脂糖 | （通用） | 不适用 | 分子生物学级 |
| AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 | Axygen Biosciences | （未提供） | |
| 台式高速冷冻离心机 | 湖南科盛 | GTR116C | |
| DNA 提取试剂（SDS、苯酚、氯仿、乙醇） | （通用） | 不适用 | |
| DNBSEQ-G99 PE300 测序平台 | 华大智造科技有限公司 | DNBSEQ-G99 | |
| 凝胶电泳装置 | 北京六一 | DYY-8C | |
| 凝胶成像系统 | 上海嘉鹏 | JP-2880 | |
| LEfSe 软件 | （开源） | 在线版本 | |
| NanoDrop 分光光度计 | 杭州海派 | Aurora-900 | |
| PCR 仪 | 杭州朗基 | A200 | |
| 吡拉西坦 | Servier | 6094078 | |
| 引物：341F 和 806R（合成） | （定制合成） | 不适用 | |
| QIIME 软件 | （开源） | http://qiime.org | 版本 1.8.0 |
| Quantus 荧光计 | Promega | E6150 | |
| Qubit 4.0 荧光计 | Invitrogen | Q33226 | |
| SDS（十二烷基硫酸钠） | （通用） | 不适用 | |
| UPARSE 软件 | （开源） | http://drive5.com/uparse | 版本 7.0.1090 |
| VAHTS Universal Plus DNA 文库构建试剂盒（适用于 MGI V2） | Vazyme | NDM627-01 |