开发间充质干细胞膜包纳米囊泡以增强基因传递

摘要

本方案旨在引入一种生产和纯化间充质干细胞（MSC）来源的细胞外囊泡仿生物的方法，用于基因治疗。纳米囊泡被MSC来源的脂质双层包裹，并包裹携带目标基因的重组AAVs。该纳米囊泡为 体内 基因递送提供了增强载体。

摘要

间充质干细胞（MSC）来源的细胞外囊泡（EVs）在治疗应用和再生医学方面具有巨大潜力。电子细胞是所有已知细胞类型分泌的纳米级囊泡，携带多种物质，包括膜锚定蛋白、可溶性因子、多种RNA物种以及调控受体细胞生理和行为的代谢物。虽然MSC衍生或工程化的EV可以递送治疗性蛋白和RNA，但由于缺乏高效机制将DNA序列分选为囊泡，EV介导的DNA递送仍具挑战性。我们团队及其他团队的先前研究表明，含有腺相关病毒（AAV）的EVs能够实现靶向核递送，并在 体外 和 体内持续实现基因表达。然而，由于产量低且工艺耗时，其产量和分离受到限制。本文报道了通过尺寸定义挤出方法生成的MSC膜包膜纳米囊泡的开发，以实现高效的基因递送。这些囊泡直径约200纳米，模仿天然电子代谢的特性，同时包裹携带治疗基因序列的重组AAV载体。与传统AAV相比，工程化的MSC囊泡提高了基因递送效率，并以显著更高的产量和更低的时间和成本，相较于自然分泌的EV-AAV更低。总之，我们提出了一种新型基于MSC的膜纳米囊泡平台，结合了EV模拟结构与AAV介导基因转移的优势。这种方法提升了递送效率和生产可扩展性，为推动基因治疗迈向临床转化提供了有前景的策略。

引言

基因治疗通过引入、替代或沉默特定基因，恢复正常细胞功能，代表了一种治疗遗传和获得性疾病的变革性方法。在过去二十年里，载体工程和递送策略的进步显著拓展了基因治疗的领域。在开发的多种载体系统中，腺相关病毒（AAV）因其良好的安全性、高效的转导以及在分裂和非^{分裂细胞中的}长期基因表达，成为最成功且被广泛采用的平台之一^1,2。迄今为止，多种基于AAV的治疗药物已获得临床监管批准，包括脊髓性肌萎缩症、视网膜营养不良和血友病的治疗，标志着转化医学的重要^里程碑。AAV载体广泛的嗜向性和低免疫原性也使其能够应用于多种组织，包括肝脏、肌肉、中枢神经系统^和眼4。因此，AAV已成为体内基因递送的领先平台，支持针对代谢、神经和心血管疾病的临床前和临床研究。

尽管AAV基因疗法临床取得显著成功，但它仍面临若干内在挑战，限制了其更广泛的应用。一个主要限制在于AAV衣壳（~4.7 kb）的基因组包装能力有限，这限制了其用于传递大型或多个治疗基因^5,6。此外，AAV载体的生物分布和细胞嗜性主要由其血清型决定，每种细胞型对特定组织表现出独特的亲和力。尽管广泛采用了胶壳工程和肽展示策略以提升组织靶向和转导效率，但在多样生物学环境中实现精确且可预测的趋向性仍是一个重大难^题7。另一个关键限制是人类群体中针对自然AAV血清型的先天中和抗体（NAbs）的普遍存在。即使是低滴度的NAbs，也可能显著降低载体转导效率，限制患者资格并使重复剂量更^复杂。多种策略，如理性衣壳重设计、免疫抑制方案和瞬时血浆交换，已被探索以减轻抗体介导的中^和，但这些方法仅能带来部分或短暂的缓解。综合来看，这些限制降低了AAV介导基因递送在临床环境中的整体治疗效果和可重复性。

近年来，细胞外囊泡包膜型AAV（EV-AAV）被探索为替代载体，有望克服传统^{AAV12、13、14、15}的若干关键局限。在载体包装过程中，部分AAV颗粒可通过囊泡运输途径分泌，并被包裹在细胞外囊泡中。该过程被认为涉及AAV编码的膜相关辅助蛋白（MAAP），该蛋白促进病毒排出并促进膜结合^16,17。所得的EV-AAV颗粒相比传统AAV表现出更好的转导效率和增强的中和抗体抗性，主要得益于其囊泡膜促进细胞摄取并部分屏蔽抗体识别¹⁸。然而，尽管有这些优势，电动-AAV的生产效率依然低落。通常，载体基因组中只有极小部分（约0.5%-12%）以EV相关AAVs的形式分泌到培养基中，而大多数仍存在于细胞内或以游离AAV的形式存在^12,13。因此，需要大规模生产以获得足够的矢量产量。此外，EV-AAV的产生主要通过HEK293T生产细胞得到验证，其EV可能表现出快速的肝脏清除、短循环半衰期以及潜在的生物安全隐患。这些局限凸显了对更高效、可定制膜包覆策略的需求，促使本研究开发细胞膜包膜AAV（CME-AAV）平台。

间充质干细胞（MSCs）及其EVs因其再生潜力和免疫规避特性已被广泛研究。除了基于细胞或自然分泌的电子代谢疗法外，近期研究还展示了一种利用包裹MSC膜的纳米颗粒增强药物递送的替代^方法。MSC膜涂层赋予主动靶向能力，降低免疫清除率，延长循环时间，这些效应很可能归因于MSC来源膜的内在分子组成^22,23。基于这一概念，我们利用MSC衍生的膜材料构建了细胞膜包覆的AAV（CME-AAV）纳米囊泡用于基因递送。为此，纯化后的MSC膜片段与重组AAV颗粒混合，并进行受控挤出工艺，该技术最初用于脂质体制备^24,25。通过尺寸定义挤出，膜组分自发组装成纳米级囊泡，包裹AAV颗粒。所得的CME-AAV通过基于密度梯度的离心法进一步从游离、未封装的AAV纯化。该策略使膜包膜AAV载体能够高效且可重复地制备，其转导效率显著优于传统AAVs，并且对中和抗体的抵抗性与EV-AAV相当。通过替代不同的转基因，CME-AAV平台在治疗多种遗传和获得性疾病方面具有广泛潜力。

方案

所有动物作均由中国珠海北京师范大学动物护理与使用机构委员会批准。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 通过 孔径定义型挤出制备和形成CME-AAV

1. 重组AAV载体的制备
   注意：AAV生产协议遵循先前发布且广泛使用的程序。详细的优化步骤和变体已在先前研究中描述，^12,26。
   1. 在完全培养基中培养细胞HEK293T，并在转染当天保持细胞在70%-80%的汇聚度。
   2. 制备三种质粒，分别编码（i）携带目标转基因的AAV转移载体，（ii）对应目标血清型的AAV重复/帽基因，以及（iii）腺病毒辅助功能。
   3. 按照标准实验室作，使用成熟的转染方法（如磷酸钙或聚合物转染），与这三种质粒共转染HEK293T细胞。
   4. 培养转染细胞48-72小时，以便AAV组装和积累。
   5. 收集细胞和培养基，并通过反复冻融循环或等效细胞裂解方法释放AAV颗粒。
   6. 以低速离心裂解液去除细胞残渣，并收集含有AAV颗粒的上清液。
   7. 使用密度梯度超速离心或其他成熟的纯化方法纯化AAV颗粒。
   8. 将纯化AAV载体交换为无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS），并在−80°C下储存以待使用。
2. MSC膜分数的制备
   注：人类间充质干细胞（MSCs）是在符合机构指南的前提下分离的。细胞在既定条件下或实验室修改的方案下进行培养和扩增。通过使用流式细胞术评估表型标志物如CD73、CD90和CD105的表达，可以确认MSC的身份。MSC的多能性通过其体 外分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力得到验证。当细胞达到70%-90%的汇聚度时，就可以收集。以下作不一定必须在无菌条件下进行。
   1. 取出培养基，并用细胞刮刀将MSC从培养皿中取出。
   2. 将脱落的细胞收集到含有PBS的锥形管内，并在300× 克 、4°C离心5分钟，沉淀细胞。
   3. 用PBS清洗细胞两次，每次以300× 克 离心，4°C离心5分钟。
   4. 将最终细胞沉淀剂重新置于PBS中，并补充蛋白酶抑制剂混合物。
   5. 对细胞悬浮液进行三次冻融循环，破坏质膜并生成粗糙的细胞裂解液。
   6. 用移液器彻底移液均质化，然后以1000× 克 离心机在4°C下离心20分钟，去除细胞杂质。
   7. 将上清液转移到新管子，并以18,000× 克 离心机在4°C下1小时，以沉淀膜分馏。
   8. 丢弃上清液，将所得膜沉淀重新悬浮于PBS中。该悬浮液代表粗糙的MSC膜组分，将用于AAV封装。
   9. 通过依次通过配备20至27克针头的注射器均匀化膜悬浮液。
   10. 利用BCA测定均质膜悬浮液的蛋白质浓度。将悬浮液分段并储存在−80°C，或直接进行以下步骤。每次解冻后，使用27克注射器重新均质膜悬浮液。
3. 通过挤出形成CME-AAV的过程
   1. 将制备好的膜悬浮液与AAVs混合，比例为150微克膜蛋白每1×10个^10个10 个AAV基因组拷贝（g.c.）。将混合物在37°C下孵育30分钟，并轻轻摇晃。
   2. 将膜-AAV混合物装入配备400纳米聚碳酸酯（PC）膜的迷你挤出机上。将样品通过挤出机20次，促进膜-AAV的包膜。
   3. 将400 nm的PC膜替换为200 nm的膜，并重复挤出过程20次，以进一步降低囊泡尺寸的异质性。
   4. 收集加工过的混合物。如果需要更多数量，则将多批挤出分成一池。最终悬浮液含有CME-AAVs，以及未包裹的AAVs和空膜囊泡。立即进入CME-AAV净化。

2. 通过密度梯度离心纯化CME-AAV

注意：本步骤描述了利用碘二醇密度梯度超速离心法，将纯CME-AAV从未封装的AAVs、蛋白质聚集体和残余核酸中分离出来。通过该步骤获得的纯化CME-AAV适用于体 外 和 体内 研究。所有手术建议在无菌组织培养罩下进行。

1. 碘二醇梯度的制备
   1. 通过用10×PBS和无菌去离子水稀释原汁液，制备40%和25%碘沙醇溶液，最终浓度为1×PBS。
   2. 在一个13.2毫升开顶薄壁超透明管中，从底部下方铺入1毫升40%碘沙醇和3毫升25%碘沙醇，谨慎建立不连续的密度梯度。
   3. 轻轻将第1.14步获得的含CME-AAV的7毫升悬浮液覆盖在梯度顶部。平衡管子，然后装入摆动桶超速离心机转子。
2. 超速离心及CME-AAV组分的收集
   1. 在150,000 g ×离心，在4°C下进行3小时，采用快速加速和慢减速（分别为9级和1级）。
   2. 小心地将管子从转子上取下，同时不扰动梯度。从管子顶部到底部收集1毫升的分馏，放入标记为1.5毫升的微离心管（F1-F11）。把所有分数都冷藏起来。
   3. 识别并收集含有纯化CME-AAV的F7和F8组分，进入一个新的开顶超速离心管。将PBS加入总体积11毫升，并用1毫升移液器轻柔混合。
3. CME-AAV的洗净与回收
   1. 在150,000 g × g下，在4°C下进行3小时离心（两种设置均为9级）。
   2. 小心丢弃上清液，并将CME-AAV沉淀液重新悬浮于50-200微升无菌PBS中，具体取决于所需浓度。
   3. 根据需要分量，保存在−80°C下，等待进一步使用。

3. 利用透射电子显微镜（TEM）对CME-AAV进行表征

注意：透射电子显微镜（TEM）用于观察CME-AAV颗粒的形态、大小和膜结构。该程序遵循与细胞外囊泡类似的标准负染色程序。除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。

1. 样品制备与固定
   1. 将从步骤2获得的纯化CME-AAV悬浮液稀释至约1 ×^{10 9-1} × 10^{10 10} particle/mL的PBS浓度。
   2. 通过加入等量新鲜制备的4%对甲醛（最终浓度2%），并在室温下培养30分钟来固定样品。
   3. 在石蜡薄膜上放置一个Formvar/碳涂层铜网格（200网），碳面朝上。
   4. 将10微升固定CME-AAV悬浮液移液器滴入网格，允许在室温下吸附30分钟。吸附过程中避免干燥。
   5. 用滤纸轻轻去除网格边缘多余的液体，但不要碰到中心。
2. 洗涤与后定型
   1. 将样品面朝下，悬浮在50微升PBS滴上2分钟清洗。重复两次。
   2. 将网格转移到50微升的1%戊二醛滴上5分钟，以稳定膜结构。
   3. 用去离子水滴连续洗5次（每次30秒），去除缓冲盐。最后一次洗涤后轻轻吸拭。
3. 负染色
   1. 将网格放置在50微升的2%醋酸铀酰水溶液滴上，浸泡1分钟以实现阴染。
   2. 用滤纸轻轻触摸网格边缘，去除多余的污渍，并在室温下完全自然风干。
4. 成像
   1. 使用200 kV的透射电子显微镜检查染色栅极。
   2. 在30,000至120,000倍放大率下拍摄具有代表性的图像××以评估CME-AAV的形态学和膜完整性。
   3. 可选地，使用TEM图像分析软件测量颗粒直径，以确认囊泡尺寸与NTA结果的一致性。
      注意：样品浓度——调整CME-AAV浓度以获得适中的颗粒密度;过浓样品会导致颗粒重叠，而过稀样品则几乎没有可检测的囊泡。避免伪影——洗涤不完全可能留下盐晶，模糊颗粒的视觉。确保网格在染色过程中保持水分，以防止膜塌陷。替代染色——如果有放射性处理限制，可使用磷酸（PTA，1%-2%，pH 7.0）作为醋酸铀酰的替代品。储存——预备的网格可在室温无尘容器中保存数天后再进行成像，但建议立即观察以获得最佳对比度。

4. 利用qPCR定量CME-AAV

注意：本步描述了一种基于qPCR的方法用于定量CME-AAV基因组拷贝（g.c./μL）。该方案强调CME-AAV特有的样本制备和数据报告。qPCR的设置和循环的其他所有环节应遵循标准实验室作及制造商对所选qPCR试剂盒的说明。

1. 样品与标准制备
   1. 将纯化的CME-AAV溶化液，冰上轻柔混合。避免涡旋。
   2. 用无核酸酶去离子水或TE缓冲液，依次进行10倍稀释，将AAV标准稀释液从1×10⁶降至1×10³ g.c./μL。准备新鲜或等额标准，并以−20°C储存，用于短期使用。
   3. 准备以下对照：无模板对照（NTC;水）、负对照（PBS或空白矩阵）和阳性对照（已知浓度的AAV样本），如有。
   4. 按照制造商对所选化学成分（染料基或探针基）的说明，在冰上制备qPCR主混合液。
2. qPCR循环与数据分析
   1. 按照qPCR主混合液制造商推荐的循环参数运行qPCR。
   2. 通过绘制 C_t （纵轴）对对数₁₀（标准浓度 g.c./μL）（x轴）来生成标准曲线。拟合线性回归以得到斜率（m）和y截截（b）。
   3. 利用回归方程计算每次样本复制的CME-AAV基因组浓度：
      或
      
      其中C为每μL的基因组拷贝数。
   4. 平均技术重复，最终CME-AAV浓度为g.c./μL。
      注意：由于qPCR制备过程中的热变性会破坏包膜和AAV衣壳，因此无需单独提取DNA。热解前不要对样品进行DNase处理;一旦衣壳/膜被破坏，但样本未达到失活DNase的温度，DNase就能访问并降解AAV基因组。标准必须尽可能匹配：从经过充分表征的AAV标准中准备标准曲线。如果你的样本或标准在基因组配置上不同（单股AAV与自补/双链AAV），请相应调整报告值。引物/探针设计：引物可针对任何保守的AAV序列;例如，针对转基因上游CMV启动子的引物常被使用。

5. CME-AAV颗粒剖面的定量化

1. 使用纳米粒子跟踪分析（NTA）、可调电阻脉冲传感（TRPS）或类似的颗粒分析技术，确定CME-AAV制剂的颗粒分布和颗粒浓度。
2. 在分析前，将CME-AAV样品在冰上解冻纯化，并通过移液轻和均质。按照标准实验室作和制造商对所选仪器的说明进行测量，具体描述见先前发布的^{12、27、28、29}号规范。

6. CME-AAV介导基因转移的 体外 分析

注意：本步描述了评估培养细胞中CME-AAV介导基因递送及转基因表达的程序。该检测方法采用HEK293T细胞和CME-AAV9进行验证。EGFP，但也可以适应其他细胞类型或报告蛋白结构。常规（非膜包膜）AAV9。EGFP作为阳性对照，而PBS或空AAV颗粒作为负对照。

1. 细胞制备
   1. 在标准条件下（DMEM，含10% FBS，1%青霉素-链霉素），在37°C、5% CO₂下培养细胞HEK293T。
   2. 将细胞种子放入48孔或96孔板中，在转导时（通常为播种后24小时）达到约70%的合流度。根据井的大小调整播种密度（例如，48孔板每孔~5×10⁴孔，96孔板每孔~1×10⁴孔）。
   3. 让细胞连接并平衡24小时后再添加载体。
2. 载体应用
   1. 准备CME-AAV9。EGFP和AAV9。EGFP在无菌PBS中工作。典型病毒剂量：每48孔5×10⁸ g.c.（根据启动子强度、靶基因和实验目标调整）。
   2. 对每个孔，加入相等的基因组拷贝（g.c.）CME-AAV9。EGFP还是AAV9。EGFP直接传送到培养基。
   3. 包含含有等量PBS或空AAV颗粒的负对照井。
   4. 轻轻旋转盘子以确保均匀分布，然后返回孵化器。
   5. 根据启动子活性和转基因表达动力学，继续潜伏24-72小时。对于HEK293T细胞中CMV驱动的EGFP，通常在48小时内观察到强烈荧光。
3. 成像与活细胞分析
   1. 准备成像时，轻轻吸取培养基，并用PBS洗细胞两次以去除未结合颗粒。避免细胞脱落。
   2. 按照制造商说明，采用Hoechst 33342（活细胞兼容）染色细胞核。活细胞不要使用DAPI。
   3. 使用配备适当滤光片的倒置荧光显微镜进行活细胞荧光成像（例如，EGFP激发488 nm/发射513 nm;Hoechst激发350 nm/发射460 nm）。
   4. 如有需要，使用10×或20×的物镜来量化转导效率，63×的物镜用于高分辨率亚细胞定位。
   5. 每孔至少获得五个视场（例如四个角和一个中心），使用相同的成像参数（曝光时间、增益、光圈等）。
   6. 将所有图像保存为原始和灰度格式以便定量分析。
4. 定量图像分析
   1. 在ImageJ（FIJI）或同等软件中打开图片。
   2. 测量每个场的EGFP和Hoechst通道的平均荧光强度。
   3. 通过选择无荧光信号的区域并平均像素值来确定背景强度。
   4. 计算每个通道的校正强度：
      我_更正了 = 我的_意思是_——背景
   5. 计算每个场的归一化强度为：
      
   6. 每口井至少五个田的平均归一化强度，并报告三个独立生物复制体的平均标准差±。
      注意：当使用相同基因组拷贝时，CME-AAV通常比传统AAV表现出更高的荧光强度，反映出细胞吸收和/或中和抗体的保护效果。最佳转导效率取决于CME-AAV制备质量、细胞类型、启动子强度和病毒滴度。如果观察到信号微弱，则增加基因组拷贝输入，通过qPCR确认载体完整性，并验证显微镜校准。根据实验需求，可能会使用其他荧光报告剂（如mCherry、mNeonGreen、tdTomato）或荧光素酶构造体。在处理原级或非粘附细胞时，应相应调整播种和成像条件（例如，在板上涂覆聚L-赖氨酸或使用腔体载玻片）。

7. 评估CME-AAV介导基因在小鼠模型中的传递

注意：本步描述了利用小鼠模型评估CME-AAV介导基因递送的 体内 表现。

1. 动物制备
   1. 使用野生型小鼠，如C57BL/6。确保所有动物作均经机构动物护理与使用委员会批准，并按照相关法规执行。
   2. 选择4-6周龄的小鼠，以确保实验间最佳一致性。
   3. 在注射前，将动物维持在标准的饲养条件下，并可自由获得食物和水。
2. 载体制备与给药
   1. 根据研究目的和目标组织选择AAV血清型。本研究采用了AAV9和CME-AAV9。
   2. 制备编码荧光素酶报告基因（如CME-AAV9.荧光素酶）的病毒载体，用于非侵入性影像检查。
   3. 将病毒载体稀释于无菌生理盐水中，达到每匹小鼠每50微升1×10¹°基因组拷贝（g.c.）的最终浓度。
   4. 注射前用热敷垫或温水轻轻加热尾巴，扩张静脉。
   5. 将50微升病毒悬浮液注入31克胰岛素注射器，缓慢注入尾侧静脉，以减少泄漏和静脉破裂。
   6. 注射后，将老鼠放回笼子并观察直到完全康复。
3. 体内 生物发光成像
   1. 给药两周后，按照机构批准的方案对小鼠施以异氟醚麻醉，并注射D-荧光素（150 μg/g体重;Sigma）在腹腔内，PBS中。
   2. 将麻醉小鼠放入生物发光成像系统中。
   3. 注射后每2分钟采集一次发光图像，直到信号达到平台。
   4. 使用合适的软件量化生物发光。定义发光区域周围的兴趣区域（ROI），并计算每种动物的总光子通量（photons/s）。
   5. 分别将AAV9.luc处理组和PBS注射组作为阳性和阴性对照组进行比较。
4. 体外成像
   注意：此步骤为可选。
   1. 体内 影像检查 结束后，立即对小鼠进行安乐死，并采集主要器官（肝脏、心脏、脾脏、肾脏和大脑）。
   2. 使用相同的IVIS系统，在相同的成像参数下对分离的器官进行成像，以确定组织特异性的荧光素酶表达。
      注意：根据实验目标，可能会采用其他给药方式（如肌肉注射、脑内注射或腹腔注射）。生物发光强度反映了基因递送效率和组织生物分布。CME-AAV介导的荧光素酶表达通常比游离AAV更早起始且峰值表达更强，这得益于细胞吸收细胞的膜介导胞吞作用。确保荧光素剂量、时间和成像设置在各样品中保持一致，以实现准确比较。所述病毒剂量（每只小鼠1×10¹°g.c.）通常在注射后2-4周内能检测到信号，但可能需要针对不同载体或动物模型进行优化。

结果

本研究中使用的MSC根据相关伦理指南的方案从人类脐带组织中分离。MSC膜片段按照所述方案制备。AAV9。EGFP是在HEK293T细胞中采用瞬时双质粒转染系统自行制备的，如先前报道的^12,26。用于CME-AAV的制备、膜制备和AAV9。EGFP在协议中规定的1×10¹°病毒基因组中，膜蛋白含量为150微克，共孵育。随后将一毫升混合物装入配备400纳米聚碳酸酯多孔膜的迷你挤出机中，挤出20次，随后再通过200纳米膜再挤出20次。该过程产生了MSC膜包覆的AAV9。EGFP（CME-AAV9。EGFP）。

纯化后，使用透射电子显微镜（TEM）检查CME-AAVs的形态学（见图1A）。透射电子显微镜成像显示，CME-AAVs的尺寸尺寸和膜束缚结构与EV相似。与先前报道的EV-AAV复合物一样，单个包裹的AAV颗粒并不一致地可区分

讨论

CME-AAV协议的关键步骤

该方案描述了一种生成MSC膜包膜AAV的方法，且若干步骤对于成功形成CME-AAV至关重要。首先，对细胞膜进行细致的预处理至关重要。这一步骤的目标是在最大限度地减少来自核DNA、细胞质蛋白和细胞器污染的同时，获得适合挤出的膜片段。此外，膜碎片的大小是挤出效率的关键决定因素。过大的碎片可能会堵塞聚碳酸酯挤出膜，而过度破坏的膜材料在挤出诱导变形下可能难以重组为稳定的纳米囊泡。该方案采用逐渐增加离心力的顺序离心步骤去除非膜组分，随后通过注射器均质化，生成尺寸适宜且可重复分布的膜片段。

在纳米囊泡形成后，高效分离膜包膜AAV与无包膜AAV是另一个关键步骤。这一步骤尤为重要，因为CME-AAV制剂中存在的游离AAVs在体内给药时可通过循环中和抗体被轻易中和，从而降低有效基因递送效率^8,9,30

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物荧光成像系统	PerkinElmer	IVIS Spectrum 光学成像系统（Lumina III）
D-荧光素钾盐	Yeasen 生物技术	40902ES03
胎牛血清	Yeasen 生物技术	40130ES76
荧光显微镜	Zeiss	Axio Observer 7
覆膜/碳膜铜网 200 网	Millipore-Sigma	TEM-FCF400CU
戊二醛	Millipore-Sigma	354400
HBSS	Gibco	C14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe 试剂盒	Yeasen 生物技术	11205ES08
高葡萄糖 Dulbecco's 改良 Eagle's 培养基	Hyclone	SH30243
高速离心机	Beckman Coulter	Avanti J-E
Hoechst 33342	Beyotime	C1022
NTA 仪器	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
用于超速离心机的开顶薄壁超透明管	Beckman Coulter	344059
OptiPrep 碘海棠素	Millipore-Sigma	D1556
4% 的甲醛	Beyotime	P0099
PBS	Biosharp	BL302A
青霉素-链霉素	Millipore-Sigma	V900929
qPCR 仪器	Applied Biosystems	QS6 实时 PCR 系统
高速离心机转子	Beckman Coulter	JA-25.50
SW 41 Ti 超速离心机摆瓶转子	Beckman Coulter	331362
透射电子显微镜	JEOL	JEM-2100F
超速离心机	Beckman Coulter	Optima XE-100
醋酸铀酰盐	Electron Microscopy Sciences	NC1375332
Whatman Nuclepore 聚碳酸酯膜过滤器（200 nm）	Cytiva	10417004
Whatman Nuclepore 聚碳酸酯膜过滤器（400 nm）	Cytiva	10417104