本方案描述了一种可重复的双样本孟德尔随机化工作流程，用于利用公开可用的全基因组关联研究汇总统计数据分析缺血性卒中与血管性痴呆之间潜在的因果关联。
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缺血性卒中与血管性痴呆之间的因果关系：一项孟德尔随机化研究
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2026年9月11日
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摘要
摘要
缺血性卒中（IS）是全球范围内导致残疾和死亡的主要原因，而血管性痴呆（VaD）是一种与脑血管损伤相关的常见痴呆亚型。观察性研究提示IS与VaD之间存在关联，但这些研究易受混杂因素和反向因果关系的影响。本方案描述了一种可重复的两样本孟德尔随机化（MR）工作流程，用于利用公开的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计数据评估IS与VaD之间潜在的因果关系。与IS相关的遗传工具变量从公开的GWAS数据集中提取，VaD的结局关联数据则来自公开的VaD GWAS数据集。相应的数据集编号已在方案部分提供。在完成结局匹配和等位基因校正后，共保留51个单核苷酸多态性（SNPs）用于最终的MR分析。该工作流程包括工具变量筛选、连锁不平衡剔除、等位基因校正、工具变量强度评估、逆方差加权（IVW）分析、加权中位数分析、MR-Egger分析、异质性检验、水平多效性评估以及留一法敏感性分析。在代表性分析中，IVW方法显示遗传预测的IS与VaD风险之间存在正向关联，加权中位数方法也得出方向一致的结果。MR-Egger估计值方向一致，但未达到统计学显著性。因此，这些发现应被解读为提示可能存在因果效应的证据，而非因果关系的确凿证明。本方案可帮助研究人员利用公开的GWAS数据，采用透明且可重复的MR工作流程来探究与脑血管疾病相关的结局。
引言
缺血性卒中（IS）是全球范围内导致严重残疾和死亡的主要原因之一1。根据全球疾病负担研究的最新数据，尽管全球IS发病率有所下降，但其疾病负担仍然显著，尤其是在东欧、东亚、中亚和撒哈拉以南非洲地区2,3。此外，在社会人口发展指数（SDI）较低的国家，IS的发病率正在上升，并预计从2020年到2030年将持续增加。
大量流行病学研究提示脑血管疾病与血管性痴呆（VaD）之间可能存在关联4,5。在中国，VaD是老年人中最常见的痴呆类型之一，而缺血性卒中（IS）的高患病率与VaD的发生密切相关。然而，大多数现有研究为观察性研究，残余混杂因素、反向因果关系以及疾病定义的差异可能限制对因果关系的推断。因此，需要采用其他分析方法来评估IS是否可能参与VaD的发生发展过程。
缺血性卒中（IS）可能通过多种机制影响血管性痴呆（VaD）的发生。IS 引起的脑血管损伤可导致脑灌注不足，进而引发神经退行性改变6。此外，VaD 可能与IS后的慢性脑血管损伤、微血管损害以及炎症反应有关7,8。因此，研究IS与VaD之间的关系对于理解潜在的疾病关联并指导未来的预防策略具有重要意义。
孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）是一种分析方法，利用遗传变异作为工具变量，评估暴露因素与结局之间潜在的因果关联9。与传统的观察性研究相比，在满足有效工具变量假设的前提下，MR 可减少混杂偏倚和反向因果偏倚。与随机对照试验或实验模型相比，当直接干预研究不可行、不符合伦理或难以实施时，MR 可利用现有的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计数据来评估具有临床意义的关联。近期采用孟德尔随机化方法的遗传学研究已探讨了缺血性卒中（IS）与血管性痴呆（VaD）之间的关联10。然而，关于暴露变量工具的选择、结局数据提取、等位基因一致性校正、工具变量强度评估、异质性检验、多效性评估以及敏感性分析等具体实验方案层面的详细描述，对于实现可重复的研究实施仍具有重要意义。
当暴露因素和结局的公开可用的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计学数据均可获得、能够为暴露因素选择有效的遗传工具变量，且研究问题旨在评估潜在的因果关联而非直接阐明生物学机制时，本方案适用。因此，本研究提出了一种两样本孟德尔随机化（MR）方案，利用公开可用的GWAS汇总统计数据来评估缺血性卒中（IS）与血管性痴呆（VaD）之间潜在的因果关联。本方案旨在提供一种可重复的分析流程，而非确立明确的生物学机制。本方案详细描述了遗传工具变量的选择、结局匹配、等位基因一致性校正、MR效应估计及敏感性分析，并以IS与VaD的关联为例进行说明。
方案
本研究使用了公开可用的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计资料。原始研究已获得机构审查委员会批准，并取得了参与者的知情同意。本二次分析无需额外的伦理审批。
1. 研究设计与伦理声明
- 采用双样本孟德尔随机化设计，评估缺血性卒中（IS）与血管性痴呆（VaD）之间潜在的因果关联。
- 仅使用公开可用的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计资料。由于纳入GWAS数据集的所有原始研究均已获得机构审查委员会批准并取得参与者的知情同意，因此本二次分析无需额外的伦理审批。
- 在数据提取前，将缺血性卒中（IS）定义为暴露因素，血管性痴呆（VaD）定义为结局变量。
2. 软件准备
- 使用 R 统计软件进行所有分析。
- 加载 TwoSampleMR 软件包，用于工具变量提取、结局数据提取、等位基因整合、孟德尔随机化估计、异质性检验及敏感性分析。加载 MRPRESSO 软件包，用于评估全局水平多效性及潜在的异常值变异体。
- 在工作流程中使用以下核心函数：extract_instruments、extract_outcome_data、harmonise_data、mr、generate_odds_ratios、mr_heterogeneity、mr_pleiotropy_test、mr_singlesnp、mr_leaveoneout、mr_scatter_plot、mr_forest_plot、mr_funnel_plot 和 mr_leaveoneout_plot。使用 MRPRESSO::mr_presso 执行 MR-PRESSO 全局检验，并在适用时进行异常值和偏倚检验。
3. 暴露数据集选择与工具变量筛选
- 从 IEU OpenGWAS 数据集 ebi-a-GCST90018864 中提取与缺血性卒中（IS）相关的单核苷酸多态性（SNPs）。该数据集包含 11,929 例 IS 病例和 472,192 例对照，总样本量为 484,121 名参与者。
- 使用显著性阈值 p < 5 × 10-6 筛选与 IS 相关的候选 SNPs。
- 在本代表性方案中采用 p < 5 × 10-6 阈值，以保留足够数量的独立工具变量用于敏感性分析。由于该阈值比传统的全基因组显著性阈值宽松，因此基于这些工具变量得出的结果应视为探索性和提示性，而非确定性结论。
- 进行连锁不平衡剪枝（linkage disequilibrium clumping），以保留独立的 SNPs。使用 r2 阈值为 0.001，剪枝窗口为 10,000 kb。
- 使用以下 R 命令提取候选工具变量：
extract_instruments(outcomes = "ebi-a-GCST90018864", p1 = 5e-06, clump = TRUE) - 使用公式 F = (β/SE)2 计算每个保留 SNP 的 F 统计量，其中 β 和 SE 分别为 SNP–暴露效应估计值及其标准误。
- 排除 F 统计量 < 10 的 SNPs，以降低弱工具偏倚的风险。使用最小值、最大值、中位数和四分位距（IQR）总结 F 统计量的分布。
4. 结果数据集提取
- 从 FinnGen GWAS 数据集 finn-b-F5_VASCDEM 中提取 VaD 结局关联。该数据集包含 881 例 VaD 病例和 211,508 例对照。
- 使用 extract_outcome_data 函数提取所有选定的 IS 相关 SNP 的结局关联。
- 当目标 SNP 在结局数据集中不可直接获得时，搜索代理 SNP。在具有有效代理信息且等位基因对应关系明确的情况下，保留代理匹配的变异。
- 使用以下 R 命令提取结局数据集：
extract_outcome_data(snps = exp_dat$SNP, outcomes = "finn-b-F5_VASCDEM", access_token = NULL)
5. 等位基因协调与SNP保留
- 在进行孟德尔随机化分析之前，对暴露和结局数据集进行整合。
- 统一效应等位基因和其他等位基因，确保SNP–暴露和SNP–结局的效应估计值对应相同的效应等位基因。
- 在整合过程中检查SNP，识别等位基因不匹配、结局关联数据缺失以及等位基因方向不明确的情况。保留整合后具有可用暴露和结局效应估计值的SNP。
- 使用以下R命令进行等位基因整合：harmonise_data(exposure_dat = exp_dat, outcome_dat = out_dat, action = 1)
- 记录从暴露数据集中最初提取的SNP数量、具有可用结局关联的SNP数量、通过代理匹配的变异位点数量，以及最终用于孟德尔随机化分析的SNP数量。
6. 主要 MR 分析与敏感性分析
- 使用逆方差加权法（inverse variance weighted, IVW）进行主要的孟德尔随机化分析。
- 采用加权中位数法和MR-Egger法进行补充性孟德尔随机化分析，以在不同假设下评估因果效应估计的一致性。
- 根据孟德尔随机化估计结果生成比值比（OR）及其95%置信区间（CI）。
- 使用以下R语言命令运行孟德尔随机化分析并计算比值比：
res <- mr(dat)
res <- generate_odds_ratios(res) - 由于仅评估一个预先设定的主要暴露-结局关联，将主要孟德尔随机化推断的Bonferroni校正阈值定义为0.05/1 = 0.05。主要IVW分析的统计学显著性阈值采用双侧p值< 0.05。
- 鉴于血管性痴呆（VaD）病例数量有限，为明确主要分析的统计精度，基于观察到的IVW估计值及其标准误进行事后双侧Wald检验功效计算。使用非中心参数βIVW/SEIVW在双侧α水平0.05下计算检验功效。将对应80%功效的最小可检测效应计算为exp[(z0.975 + z0.80) × SE]。由于缺血性卒中（IS）为二分类暴露变量，且SNP-暴露关联以log-odds尺度表示，因此将此分析报告为基于效应条件的精度描述性评估，而非预先设定的样本量计算11。
7. 异质性、水平多效性及留一法分析
- 使用 Cochran’s Q 统计量评估 SNP 间的异质性。
- 使用以下 R 命令计算异质性统计量：
mr_heterogeneity(dat) - 使用 MR-Egger 截距检验评估方向性水平多效性。
- 使用以下 R 命令计算 MR-Egger 截距：
mr_pleiotropy_test(dat) - 使用 MR-PRESSO 进行全局水平多效性评估，并检测潜在的离群变异，设置 10,000 次模拟、显著性阈值为 0.05，并同时启用离群值检验和畸变检验12。
- 使用以下 R 命令进行 MR-PRESSO 分析：
set.seed(20260729)
mr_presso(
BetaOutcome = "beta.outcome",
BetaExposure = "beta.exposure",
SdOutcome = "se.outcome",
SdExposure = "se.exposure",
OUTLIERtest = TRUE,
DISTORTIONtest = TRUE,
data = dat,
NbDistribution = 10000,
SignifThreshold = 0.05
) - 进行单 SNP 分析，分别估计每个 SNP 的效应。
- 使用以下 R 命令进行单 SNP 分析：
res_single <- mr_singlesnp(dat) - 进行留一法分析，每次依次移除一个 SNP 并重复进行 IVW 分析。
- 使用以下 R 命令进行留一法分析：
res_loo <- mr_leaveoneout(dat)
8. 可视化与输出
- 生成散点图，以展示不同方法下的孟德尔随机化（MR）估计结果。
- 生成森林图，以展示单个SNP的估计值及总体MR估计值。
- 生成漏斗图，用于直观评估各SNP特异性估计值的对称性。
- 生成留一法图（leave-one-out plot），以评估总体估计结果是否由某单一SNP驱动。
- 使用以下 R 命令生成图形：
mr_scatter_plot(res, dat)
mr_forest_plot(res_single)
mr_funnel_plot(res_single)
mr_leaveoneout_plot(res_loo) - 导出MR结果、工具变量表、结局关联表以及敏感性分析结果，用于报告撰写与结果复现。
结果
图1 总结了双样本孟德尔随机化分析的整体工作流程，从数据集选择和工具变量筛选，到敏感性分析及结果可视化。各阶段的代表性输出结果如下所示。
遗传工具变量与数据协调质量控制
最初使用 p < 5 × 10-6 的显著性阈值，从暴露性全基因组关联研究（GWAS）数据集中提取了共计 52 个与 IS 相关的单核苷酸多态性（SNP）。随后从血管性痴呆（VaD）GWAS 数据集中提取了结局关联数据。经过结局匹配、代理 SNP 搜索和等位基因校正后，最终保留了 51 个 SNP 用于孟德尔随机化（MR）分析。其中有 2 个变异位点通过代理 SNP 进行匹配。保留的遗传工具列于表 1中。这 51 个保留工具的 F 统计量范围为 20.91 至 46.06，中位数为 25.08，四分位距（IQR）为 22.95–30.71。所有保留的 SNP 的 F 统计量均不低于 10，表明弱工具偏倚的可能性较低。
IS 和 VaD 的 MR 估计值
散点图展示了不同孟德尔随机化方法下各单核苷酸多态性特异性估计值的方向和幅度图2IVW 和加权中位数方法显示存在正向关联，而 MR-Egger 估计结果方向一致，但未达到统计学显著性。
各单核苷酸多态性（SNP）估计值的森林图显示了SNP特异性与血管性痴呆（VaD）风险的关联（图3）。总体孟德尔随机化（MR）估计结果总结于图4。逆方差加权（IVW）方法显示，基因预测的缺血性卒中（IS）与VaD风险之间存在具有统计学意义的正向关联（OR = 1.63，95% CI：1.21–2.21，p = 0.0013）。加权中位数方法得出了一致且显著的估计值（OR = 1.60，95% CI：1.06–2.42，p = 0.0240）。MR-Egger估计结果方向一致，但未达到统计学显著性（OR = 2.21，95% CI：0.97–5.01，p = 0.0645）。
FinnGen VaD 结局的全基因组关联研究（GWAS）纳入了 881 例病例和 211,508 例对照。在事后基于观察到的 IVW 估计值进行的双侧 Wald 检验计算中，主要 IVW 分析在 α = 0.05 水平下的估计检验效能为 89.5%。相应地，达到 80% 检验效能的最小可检测效应为比值比（OR）1.54。相比之下，MR-Egger 分析的最小可检测效应为 OR 3.23，超过了观察到的方向一致的 MR-Egger 估计值（OR = 2.21）。因此，MR-Egger 分析结果无统计学显著性，应被解释为反映了该敏感性分析方法效率较低、精确度有限，而不能单独作为反对主要 IVW 估计值方向的证据。
由于仅评估了一个预先指定的主要暴露-结局关联，主要孟德尔随机化推断的Bonferroni校正显著性阈值为0.05/1 = 0.05。因此，IVW结果达到了校正后的显著性阈值。综合来看，这些发现提示遗传预测的缺血性卒中（IS）可能对血管性痴呆（VaD）风险具有正向影响，主要依据为IVW估计值，并得到加权中位数敏感性分析的支持。然而，MR-Egger估计值虽方向一致，但未达到统计学显著性；因此，结果不应被解释为因果关系的确凿证据。
异质性与水平多效性分析
使用 Cochran’s Q 统计量评估 SNP 间的异质性。IVW 异质性检验结果为 Q = 57.46，自由度为 50（p = 0.218）；MR-Egger 异质性检验结果为 Q = 56.77，自由度为 49（p = 0.208）。这些结果未提示 SNP 特异性估计值之间存在显著异质性。使用 MR-Egger 截距检验评估方向性水平多效性。MR-Egger 截距为 -0.0195（标准误 SE = 0.0253，p = 0.444），表明无统计学证据支持存在方向性水平多效性。MR-PRESSO 分析基于保留的 51 个标准化 SNPs 进行，共进行 10,000 次模拟。MR-PRESSO 全局检验未发现全局水平多效性的证据（观测残差平方和 RSSobs = 59.61；经验p = 0.2388）。由于全局检验无统计学显著性，个体异常值检验和偏差检验不适用，因此未生成异常值校正后的估计值。漏斗图用于直观评估 SNP 特异性估计值的对称性（图 5）。详细的 MR-PRESSO 设置与结果见补充表 1。
留一法敏感性分析与方案输出验证
采用留一分析法评估整体MR估计值是否受到任一单个SNP的驱动。留一分析图显示，依次移除各个SNP并未对整体估计值产生实质性影响（图6），表明没有单个遗传工具变量主导了该关联。综上，这些代表性结果展示了本方案中所述两样本MR工作流程的实际输出结果。表1列出了在SNP筛选与数据协调后保留的遗传工具变量，图2展示了不同方法下MR估计值的方向，图3呈现了各SNP特异性的估计结果，图4总结了整体MR估计值，图5用于可视化评估多效性或不对称性，图6评估了各个SNP的影响程度。补充表2将每个主要实验步骤与其对应的验证性输出结果进行了对应链接。
本研究中分析的所有全基因组关联研究（GWAS）汇总统计原始数据均公开可获取。缺血性卒中暴露数据集来自IEU OpenGWAS数据库，数据集编号为ebi-a-GCST90018864。血管性痴呆结局数据集来自FinnGen GWAS数据集，数据集编号为finn-b-F5_VASCDEM。提取的工具变量表、标准化分析数据集、孟德尔随机化（MR）结果表及相关输出文件均作为补充材料提供。
图1。两样本MR分析流程图。 本图总结了该方案的主要步骤，包括暴露数据集选择、工具变量筛选、结局数据提取、等位基因一致性校正、MR效应估计、异质性检验、水平多效性评估、留一法分析及结果可视化。请点击此处查看该图的高清版本。
图 2。IS 与 VaD 关联的孟德尔随机化估计散点图。 每个点代表一个特定 SNP 的估计值。拟合线表示使用不同孟德尔随机化方法获得的估计关联。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3。单SNP孟德尔随机化估计的森林图。 该图显示了缺血性卒中相关遗传变异与血管性痴呆（VaD）风险之间关联的各个SNP特异性估计值。水平线代表95%置信区间。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4．不同方法下整体 MR 估计值的森林图。 该图总结了使用 IVW、加权中位数和 MR-Egger 方法获得的整体 MR 估计值。水平线代表 95% 置信区间。MR，孟德尔随机化；IVW，逆方差加权。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5．SNP特异性孟德尔随机化估计的漏斗图。 该图展示了SNP特异性孟德尔随机化估计值的分布情况，可用于对遗传工具变量之间的对称性进行视觉评估。MR，孟德尔随机化；IVW，逆方差加权法。请点击此处查看该图的放大版本。
图6．逐一剔除敏感性分析。 该图显示了依次移除每个SNP后的MR估计结果。该图用于评估整体估计结果是否受到任一单一遗传工具的影响。请点击此处查看此图的放大版本。
| 无 | 单核苷酸多态性 | 基因 | Chr. | EA | OA | EAF.IS | EAF.VD | IS β (SE) | VD β（标准误） | F 统计量 | R² |
| 1 | rs10886430 | GRK5 | 10 | G | A | 0.118244 | 0.09536 | 0.1147 (0.0220) | -0.0172 (0.0852) | 27.18 | 5.61E-05 |
| 2 | rs10936572 | LOC107986051 | 3 | T | C | 0.179643 | 0.1235 | -0.0512 (0.0104) | 0.1444 (0.0743) | 24.24 | 5.01E-05 |
| 3 | rs11045239 | PDE3A | 12 | A | G | 0.492943 | 0.4629 | 0.0604 (0.0089) | 0.0303 (0.0494) | 46.06 | 9.51E-05 |
| 4 | rs11047532 | LOC105369698 | 12 | G | C | 0.305214 | 0.1513 | 0.0499 (0.0105) | 0.0159 (0.0689) | 22.59 | 4.66E-05 |
| 5 | rs11065836 | CUX2 | 12 | A | G | 0.159123 | 0.07442 | -0.0608 (0.0103) | 0.0245 (0.0929) | 34.84 | 7.20E-05 |
| 6 | rs11105378 | ATP2B1 | 12 | T | C | 0.203466 | 0.07522 | -0.0540 (0.0098) | -0.1174 (0.0916) | 30.36 | 6.27E-05 |
| 7 | rs117140252 | - | 14 | A | G | 0.041216 | 0.06988 | 0.1568 (0.0311) | 0.1498 (0.0967) | 25.42 | 5.25E-05 |
| 8 | rs117343276 | - | 10 | G | A | 0.030533 | 0.0431 | -0.0905 (0.0196) | -0.1449 (0.1233) | 21.32 | 4.40E-05 |
| 9 | rs11831940 | HDAC7 | 12 | A | G | 0.251914 | 0.3526 | 0.0631 (0.0130) | 0.1226 (0.0513) | 23.56 | 4.87E-05 |
| 10 | rs11880613 | DNM2 | 19 | A | G | 0.184857 | 0.1804 | -0.0613 (0.0110) | 0.1499 (0.0640) | 31.06 | 6.41E-05 |
| 11 | rs12445022 | LOC124903748 | 16 | A | G | 0.271667 | 0.3193 | 0.0605 (0.0112) | 0.0218 (0.0527) | 29.18 | 6.03E-05 |
| 12 | rs12509595 | - | 4 | C | T | 0.297929 | 0.3124 | 0.0577 (0.0091) | 0.1462 (0.0533) | 40.2 | 8.30E-05 |
| 13 | rs12633109 | - | 3 | T | G | 0.360897 | 0.3263 | 0.0436 (0.0089) | 0.0395 (0.0526) | 24 | 4.96E-05 |
| 14 | rs1275980 | KCNK3 | 2 | T | C | 0.498545 | 0.5481 | -0.0582 (0.0094) | -0.0128 (0.0495) | 38.33 | 7.92E-05 |
| 15 | rs13123551 | - | 4 | A | T | 0.616442 | 0.5065 | 0.0552 (0.0097) | 0.0818 (0.0493) | 32.38 | 6.69E-05 |
| 16 | rs147871383 | MIR99AHG | 21 | A | G | 0.02368 | 0.01925 | 0.2259 (0.0494) | 0.2534 (0.1903) | 20.91 | 4.32E-05 |
| 17 | rs16918175 | - | 10 | C | T | 0.104037 | 0.0811 | -0.0649 (0.0131) | 0.0332 (0.0895) | 24.54 | 5.07E-05 |
| 18 | rs17182166 | ACVR1 | 2 | T | G | 0.12494 | 0.137 | 0.0751 (0.0156) | -0.0046 (0.0703) | 23.18 | 4.79E-05 |
| 19 | rs1906779 | - | 15 | A | G | 0.211386 | 0.1239 | 0.0438 (0.0095) | -0.0342 (0.0758) | 21.26 | 4.39E-05 |
| 20 | rs1948696 | ITGB5 | 3 | C | T | 0.650138 | 0.6041 | -0.0459 (0.0091) | 0.0219 (0.0501) | 25.44 | 5.25E-05 |
| 21 | rs1973765 | LSP1 | 11 | C | T | 0.486717 | 0.4124 | 0.0441 (0.0092) | -0.0229 (0.0505) | 22.98 | 4.75E-05 |
| 22 | rs2429123 | CACNA1C，DCP1B | 12 | C | T | 0.729926 | 0.725 | 0.0473 (0.0098) | 0.0190 (0.0549) | 23.3 | 4.81E-05 |
| 23 | rs2447561 | - | 8 | T | A | 0.873442 | 0.8382 | -0.0589 (0.0116) | -0.0570 (0.0674) | 25.78 | 5.33E-05 |
| 24 | rs245015 | MSH3 | 5 | A | G | 0.685061 | 0.6562 | -0.0456 (0.0089) | 0.0065 (0.0519) | 26.25 | 5.42E-05 |
| 25 | rs2501968 | CENPQ | 6 | G | A | 0.465302 | 0.4229 | -0.0490 (0.0086) | -0.0879 (0.0498) | 32.46 | 6.71E-05 |
| 26 | rs2526620 | - | 7 | G | A | 0.252144 | 0.2459 | 0.0500 (0.0092) | 0.0505 (0.0576) | 29.54 | 6.10E-05 |
| 27 | rs284160 | TGFBR3 | 1 | A | G | 0.192644 | 0.1186 | 0.0572 (0.0096) | 0.1573 (0.0768) | 35.5 | 7.33E-05 |
| 28 | rs2842870 | PMF1，PMF1-BGLAP | 1 | C | T | 0.360398 | 0.3434 | -0.0446 (0.0087) | -0.0727 (0.0518) | 26.28 | 5.43E-05 |
| 29 | rs2880492 | NCOR2 | 12 | C | T | 0.035841 | 0.01984 | -0.1293 (0.0266) | -0.1917 (0.1781) | 23.63 | 4.88E-05 |
| 30 | rs35790371 | RBFOX1 | 16 | A | G | 0.005125 | 0.001903 | 0.5587 (0.1176) | 0.1447 (0.5420) | 22.57 | 4.66E-05 |
| 31 | rs5752720 | TTC28 | 22 | T | C | 0.28441 | 0.1844 | 0.0422 (0.0091) | -0.0311 (0.0635) | 21.51 | 4.44E-05 |
| 32 | rs57694670 | SH3PXD2A | 10 | G | A | 0.433638 | 0.3834 | -0.0507 (0.0086) | 0.0080 (0.0507) | 34.76 | 7.18E-05 |
| 33 | rs6462001 | - | 7 | T | G | 0.881494 | 0.8329 | -0.0765 (0.0151) | -0.0567 (0.0662) | 25.67 | 5.30E-05 |
| 34 | rs6843082 | - | 4 | A | G | 0.65294 | 0.6907 | -0.0438 (0.0092) | -0.0568 (0.0534) | 22.67 | 4.68E-05 |
| 35 | rs7091346 | SH3PXD2A | 10 | T | C | 0.45273 | 0.2664 | -0.0582 (0.0098) | -0.0143 (0.0552) | 35.27 | 7.28E-05 |
| 36 | rs7194129 | CFDP1 | 16 | T | C | 0.573691 | 0.5538 | 0.0399 (0.0084) | 0.0293 (0.0495) | 22.56 | 4.66E-05 |
| 37 | rs7341574 | ZFPM2 | 8 | T | C | 0.313243 | 0.3895 | 0.0463 (0.0094) | -0.0774 (0.0505) | 24.26 | 5.01E-05 |
| 38 | rs7451833 | - | 6 | G | A | 0.103042 | 0.1166 | 0.1280 (0.0220) | 0.1253 (0.0777) | 33.85 | 6.99E-05 |
| 39 | rs74617384 | LPA | 6 | T | A | 0.070999 | 0.04573 | 0.1415 (0.0281) | -0.0532 (0.1162) | 25.36 | 5.24E-05 |
| 40 | rs74849463 | PIK3C2B | 1 | T | C | 0.240949 | 0.2043 | 0.0445 (0.0092) | -0.0319 (0.0616) | 23.4 | 4.83E-05 |
| 41 | rs757241 | AFAP1-AS1 | 4 | C | G | 0.673377 | 0.6704 | -0.0681 (0.0145) | -0.0274 (0.0523) | 22.06 | 4.56E-05 |
| 42 | rs76099321 | CNNM2 | 10 | A | G | 0.052085 | 0.02979 | -0.0691 (0.0150) | -0.2215 (0.1464) | 21.22 | 4.38E-05 |
| 43 | rs7670136 | - | 4 | C | T | 0.571088 | 0.6269 | -0.0473 (0.0101) | 0.0391 (0.0509) | 21.93 | 4.53E-05 |
| 44 | rs77455924 | NTM | 11 | T | C | 0.056457 | 0.02996 | 0.1632 (0.0331) | 0.0444 (0.1477) | 24.31 | 5.02E-05 |
| 45 | rs7820334 | - | 8 | T | C | 0.246549 | 0.2949 | -0.0643 (0.0127) | -0.1327 (0.0648) | 25.63 | 5.29E-05 |
| 46 | rs7859727 | CDKN2B-AS1 | 9 | T | C | 0.518845 | 0.4151 | 0.0569 (0.0087) | 0.0281 (0.0498) | 42.77 | 8.83E-05 |
| 47 | rs7989823 | COL4A1, COL4A2 | 13 | C | A | 0.591615 | 0.6188 | 0.0527 (0.0089) | 0.0693 (0.0518) | 35.06 | 7.24E-05 |
| 48 | rs79960344 | - | 17 | G | T | 0.102808 | 0.1031 | 0.0651 (0.0130) | -0.1596 (0.0805) | 25.08 | 5.18E-05 |
| 49 | rs880315 | CASZ1 | 1 | C | T | 0.445525 | 0.4139 | 0.0416 (0.0089) | 0.0444 (0.0501) | 21.85 | 4.51E-05 |
| 50 | rs9112 | LOC100505841 | 5 | A | G | 0.436595 | 0.3573 | 0.0407 (0.0085) | -0.0274 (0.0523) | 22.93 | 4.74E-05 |
| 51 | rs979380 | - | 17 | A | G | 0.531844 | 0.6197 | -0.0417 (0.0084) | -0.0196 (0.0506) | 24.64 | 5.09E-05 |
| EAF.IS 和 EAF.VD 分别表示缺血性卒中暴露数据集和血管性痴呆结局数据集中的效应等位基因频率。F 统计量 = (β/SE)²。每个 SNP 的 R² = F/(F + N − 2)，其中 N = 484,121。SNP 的筛选依据为 p < 5 × 10-6 和连锁不平衡剪枝（r²） < 0.001，在10,000 kb窗口范围内。 | |||||||||||
表1：缺血性卒中的遗传工具及与血管性痴呆（VaD）相应的SNP-结局关联。 该表格列出了最终筛选的51个SNP，包括SNP编号、对应基因、染色体、等位基因、效应等位基因频率（EAF）、SNP-性状估计值、F统计量以及每个SNP的R2值。SNP的筛选标准为p < 5 × 10-6，并在10,000 kb范围内以r2 < 0.001进行连锁不平衡剔除。EAF.IS和EAF.VD分别表示在缺血性卒中（IS）和血管性痴呆（VD）数据集中的效应等位基因频率。Chr.，染色体；EA，效应等位基因；OA，其他等位基因；EAF，效应等位基因频率；IS，缺血性卒中；VD，血管性痴呆。 请点击此处下载该表格。
补充表 1. 缺血性卒中-血管性痴呆分析中水平多效性的 MR-PRESSO 评估。 本表格总结了使用最终整合的 51 个 SNP 数据集进行的 MR-PRESSO 分析，用于评估全局水平多效性及潜在的异常值变异体。请点击此处下载该文件。
补充表 2. 实验方案步骤及相应的验证结果。 本表将方案中的每个主要步骤与其对应的结果图例及在论文中报告的位置进行关联，以展示分析工作流程的实施与验证情况。请点击此处下载该文件。
讨论
本研究提出了一种双样本孟德尔随机化（MR）方案，利用公开可用的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计数据，评估缺血性卒中（IS）与血管性痴呆（VaD）之间潜在的因果关联。在代表性分析中，逆方差加权（IVW）和加权中位数方法均支持遗传预测的IS与VaD风险之间存在正向关联，而MR-Egger估计结果虽方向一致，但未达到统计学显著性。因此，这些发现为可能存在因果效应提供了提示性证据，而非因果关系的确凿证明。
在脑血管损伤的背景下，所观察到的关联具有生物学上的合理性。缺血性卒中（IS）可导致区域性神经元损伤、脑灌注受损以及随后的神经退行性改变。既往研究表明，血管性痴呆（VaD）常发生于脑血流减少或脑血管损伤的情况下13,14。IS后持续存在的慢性脑血管改变可能进一步促进认知功能下降及VaD风险的增加15。此外，卒中后的微血管损伤、炎症反应以及慢性神经血管功能障碍，可能构成IS与VaD之间潜在的生物学联系。然而，目前的孟德尔随机化（MR）研究设计尚无法直接证实这些机制，研究结果需结合未来机制性研究和临床验证研究进行综合解读。
MR-Egger 估计结果未达到统计学显著性。这一发现应谨慎解读，而不能直接视为与 IVW 和加权中位数结果相矛盾。MR-Egger 方法在应对某些形式的定向多效性时可提供更为稳健的估计，但其统计效能通常较低，特别是当工具变量效应较弱时。在本分析中，MR-Egger 截距未提示存在统计学显著的定向水平多效性，异质性检验也未显示 SNP 间存在显著异质性。此外，MR-PRESSO 全局检验未发现全局水平多效性的证据。这些敏感性分析降低了对可测量的定向或多效性水平偏倚的担忧，但并不能排除所有可能的偏倚来源，也无法确立因果关系。
在解读这些发现时，仍应考虑到血管性痴呆（VaD）病例数较少的情况。尽管主要的IVW分析基于观测到的效应量，其事后估计功效为89.5%，但该结果仅为描述性统计，不应被解释为预先设定的样本量合理性依据。病例数有限尤其降低了效率较低的敏感性分析估计量的精确度；MR-Egger方法的最小可检测效应（80%）为比值比（OR）3.23，高于其观测估计值。因此，MR-Egger分析结果无统计学显著性，并不能消除对关联强度大小的不确定性。此外，这些功效计算并未解决与工具变量有效性、样本重叠、表型异质性或残余水平多效性相关的潜在偏倚问题。
该MR工作流程的可靠性依赖于多个关键分析步骤。首先，应使用数据集编号或登录信息明确定义暴露和结局的全基因组关联研究（GWAS）数据集。其次，应基于预设的阈值进行单核苷酸多态性（SNP）筛选及连锁不平衡剔除，以获得独立的遗传工具变量。第三，应使用F统计量评估工具变量的强度，以降低弱工具变量偏倚的风险。第四，必须进行等位基因一致性校正，确保SNP-暴露和SNP-结局的效应估计基于相同的效应等位基因。最后，应通过异质性检验、水平多效性分析和留一法分析，评估主要估计结果是否受到不一致的SNP效应、方向性多效性或单个主导遗传工具变量的影响。
该工作流程中常见的失败或偏倚来源包括：暴露相关 SNP 数量不足、工具变量较弱、结局相关的 SNP 不可获得、等位基因比对不明确、回文变异位点、替代 SNP 不匹配、各 SNP 特异性估计值之间的异质性、水平多效性、人群不匹配、表型异质性以及可能的样本重叠。可通过检查 GWAS 数据集标识符、采用一致的 SNP 筛选和剪枝阈值、记录替代 SNP 的使用情况、检查数据协调化输出结果、汇总 F 统计量，并结合异质性、多效性及留一法分析结果共同解释孟德尔随机化（MR）估计值，以应对上述问题。若检测到显著的异质性或多效性，应对主要的 IVW 估计值谨慎解释，并考虑进行额外的敏感性分析或使用替代数据集。
还应考虑样本重叠的可能性。暴露性状的全基因组关联研究（GWAS）与FinnGen结局GWAS均来源于欧洲血统人群资源，而参与者重叠的程度无法从现有的汇总统计资料中量化。这种重叠可能会使两样本孟德尔随机化（MR）估计值偏向于观察性关联，特别是当工具变量与暴露性状的关联较弱时。在解释代表性结果时，应考虑这一局限性。
与传统的观察性队列研究或病例对照研究相比，孟德尔随机化（MR）在满足有效工具变量假设的前提下，可减少混杂偏倚和反向因果关系偏倚。然而，观察性研究在估计疾病发病率、时间变化模式及临床预后方面仍然具有重要价值。与随机对照试验或实验模型相比，当直接干预研究不可行或不符合伦理时，MR 可利用现有的遗传数据评估潜在的因果关联。尽管如此，MR 无法直接揭示细胞层面的作用机制，也不能替代对机制的验证性研究。因此，本方案应被视为对队列研究、横断面分析、动物模型和细胞实验的补充，而非替代。
既往研究已采用流行病学和遗传学方法探讨了血管风险因素与痴呆相关结局之间的关系。例如，先前的临床和基于人群的研究表明，糖尿病和高血压与痴呆风险相关16。现有的基于孟德尔随机化（MR）的研究也已探讨了缺血性卒中（IS）、血管性痴呆（VaD）及相关共病机制。本文与这些研究的主要区别在于其研究目的。本文并非旨在发现新的分子靶点或实验验证疾病机制，而是重点介绍一种可重复的操作方案，用于利用公开可用的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计数据进行两样本MR分析。
该方案存在若干局限性。首先，分析基于公开可用的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计资料，研究结果可能无法完全推广至非欧洲人群或病例定义不同的数据集。其次，单核苷酸多态性（SNP）筛选阈值较为宽松（p < 5 × 10-6用于在敏感性分析中保留足够数量的独立工具变量。尽管所有保留的工具变量的 F 统计量均 >10，该阈值比传统的全基因组显著性阈值更为宽松，可能包含与暴露关联较弱或稳健性较差的变异位点。因此，代表性结果应被视为探索性与提示性发现，而非因果关系的确凿证据。第三，尽管孟德尔随机化（MR）可减少混杂因素及反向因果偏差的影响，但仍无法完全排除水平多效性、表型误分类、样本重叠或由无效工具变量引入的偏倚。第四，MR-Egger估计结果无统计学显著性，提示对因果效应的解释应保持谨慎。第五，本研究方案未包含细胞实验、动物模型或独立队列验证；这些方法对于阐明生物学机制与临床应用价值具有重要意义。
此外，IS 被建模为一个整体表型。该代表性实验方案并非旨在确定任何关联是否归因于大动脉粥样硬化性卒中、小血管闭塞、心源性栓塞性卒中或其他亚型。因此，不应将结果解读为支持某一亚型特异性效应的证据。未来的研究应采用预先设定且统一的分析方案，将相同的工作流程应用于具有充分统计效能的卒中亚型特异性全基因组关联研究（GWAS）数据集。
该方案未来的应用可能不仅限于缺血性卒中（IS）和血管性痴呆（VaD）。当存在合适的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计结果时，相同的分析流程也可用于评估其他脑血管、神经退行性、代谢性、炎症性或心血管疾病的暴露-结局关联关系。未来的研究还可通过整合独立的GWAS验证、双向孟德尔随机化（MR）、多变量MR、中介MR分析，或将结果与基于队列和实验研究的证据相结合，进一步拓展该分析流程。
综上所述，本方案提供了一种利用公开的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计数据分析双样本孟德尔随机化（MR）的可重复工作流程。代表性结果提示，遗传预测的缺血性卒中（IS）与血管性痴呆（VaD）风险之间可能存在正向关联，该结论主要由逆方差加权法（IVW）和加权中位数法支持，而MR-Egger估计结果未达到统计学显著性。然而，该发现不应被解读为确凿的机制性证据。未来仍需开展基于独立人群的验证研究以及实验性研究，以进一步阐明此关联的生物学机制及其临床意义。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。在本文手稿的撰写、编辑或准备过程中，未使用任何人工智能（AI）或大型语言模型（LLM）工具。
致谢
本研究未获得任何专项资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 芬恩基因组全基因组关联研究数据集 | FinnGen | finn-b-F5_VASCDEM | 作为血管性痴呆结局数据来源的公开全基因组关联研究数据集 |
| IEU OpenGWAS数据库 | MRC整合流行病学单位，布里斯托尔大学 | ebi-a-GCST90018864 | 作为缺血性卒中暴露数据来源的公开全基因组关联研究数据集 |
| R软件 | R统计计算基金会 | 不适用 | 用于孟德尔随机化分析的统计软件 |
| RStudio | Posit Software, PBC | 不适用 | 用于运行R脚本的集成开发环境 |
| TwoSampleMR软件包 | MRC整合流行病学单位，布里斯托尔大学 | 不适用 | 用于工具变量提取、数据协调、孟德尔随机化分析及敏感性分析的R软件包 |
| MRPRESSO软件包 | CRAN | 版本 1.0 | 用于评估全局水平多效性及潜在异常值工具变量的R软件包 |
| writexl软件包 | CRAN | 不适用 | 用于将结果表格导出为xlsx文件的R软件包 |
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