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方法文章

一种采用改良Hulth手术法建立小鼠膝骨关节炎模型的外科方法

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DOI：

10.3791/70379

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2026年5月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案概述了改良Hulth模型的精细手术步骤，提供了一种标准化且可重复的实验性骨关节炎诱导方法。

摘要

膝骨关节炎（KOA）是一种慢性退行性关节疾病，以关节软骨退变、软骨下骨重塑、骨赘形成和滑膜炎为特征，是骨关节炎中最常见的类型。

本方案介绍了一种采用改良Hulth手术方法建立小鼠膝骨关节炎模型的技术。与通过注射诱导或传统的手术模型（如内侧半月板失稳术（DMM）和前交叉韧带切断术（ACLT））相比，改良Hulth模型可导致更早的疾病 onset 和更严重的关节炎症。该方法通过切断内侧副韧带、内侧半月板以及前交叉韧带，破坏膝关节的力学对齐状态，从而促进骨关节炎（OA）的进展。此模型特别适用于急性OA病理机制的研究以及潜在治疗干预措施的评估。为评估关节炎严重程度，我们采用小动物超声结合关节腔三维（3D）重建技术，定量分析关节腔体积并评估滑膜液积聚情况。此外，对组织学切片进行番红O/快绿染色，并依据国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分标准评估软骨破坏程度。

引言

膝骨关节炎（OA）是一种常见的慢性退行性关节疾病，临床表现为膝关节疼痛、僵硬、活动范围受限以及周围肌肉无力。该病在女性中的患病率高于男性。若未能有效控制，OA可导致身体功能进行性下降、睡眠障碍、慢性疲劳，最终致残。随着全球人口老龄化，膝骨关节炎的发病率持续上升，对全球医疗系统和经济构成重大挑战1,2。

从病理生理学角度来看，软骨丢失是骨关节炎（OA）的核心特征，常伴随整个关节及关节周围组织的结构和功能损害。为了阐明疾病机制并评估治疗干预措施，研究人员已开发出多种能够模拟人类OA关键特征的动物模型。其中，手术诱导模型应用最为广泛，例如内侧半月板失稳术（DMM）3和前交叉韧带横断术（ACLT）4，这些手术会破坏关节的正常结构，从而导致软骨退变和类似OA的改变。另一类为化学诱导模型，依赖于向关节腔内注射可降解细胞外基质的试剂（如胶原酶或单碘乙酸钠），引起软骨细胞快速死亡和软骨侵蚀5,6。注射模型通常在数周内即可达到终点病理状态，而手术模型一般需要更长的时间进程。

在现有的手术技术中，我们选择并进一步优化了Hulth模型，因其骨关节炎（OA）发病速度较快7。该模型通过切断前交叉韧带和后交叉韧带，结合内侧副韧带切除及全内侧半月板切除术，可稳定地诱导出严重且快速进展的软骨损伤以及软骨下骨的改变。由于其在较短时间内即可导致关节结构破坏，改良后的Hulth模型特别适用于急性或亚急性骨关节炎的研究。我们建议，本研究优化的实验方案可为未来的临床前研究提供一种实用且可重复的技术平台。

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方案

所有实验程序均经上海中医药大学动物伦理委员会批准。6至8周龄、体重约20 g的雄性C57BL/6小鼠购自商业供应商（见材料表）（伦理批准编号：PZSHUTCM2312210005）。

1. 术前护理

  1. 手术前让小鼠适应环境至少1周。
  2. 手术前对所有外科器械进行灭菌，并对术中工作区域进行消毒。
  3. 打开气体麻醉机，将小鼠置于诱导室中，使用2–3%异氟烷进行5分钟诱导，以实现全身麻醉。
    注意：确保氧气流速维持在0.5 NL/min至1 NL/min之间。
  4. 麻醉成功后，将小鼠转移至手术平台，并通过麻醉面罩持续给予1–1.5%异氟烷以维持麻醉状态，直至手术完成（1–1.5%异氟烷）。
  5. 将小鼠仰卧位固定，膝关节朝上，确保体位稳定并充分暴露手术区域。
  6. 通过检查反射是否消失来确认麻醉深度，然后涂抹脱毛膏，彻底清除膝关节周围的毛发。
  7. 用纱布或棉签小心清除残留的脱毛膏，随后先用75%乙醇对暴露的皮肤进行消毒，再用碘酊消毒，以确保无菌条件。

2. 手术步骤（图1）

  1. 伸展小鼠后肢并施加牵引力以绷紧皮肤。使用无菌手术刀沿右膝关节内侧做一条0.5–1 cm的纵向切口。
    注意：以下所述所有手术操作均在手术显微镜下进行。
  2. 牵开皮肤，钝性分离下方筋膜，充分暴露关节囊，并观察髌韧带。
  3. 使用细注射针探查并切开覆盖在内侧副韧带（MCL）上方的筋膜。
  4. 在放大镜下使用显微剪刀横断内侧副韧带（MCL）。
  5. 用针头移开髌韧带以暴露关节腔，识别内侧半月板。
  6. 切断后使用显微剪刀横断内侧半月板胫骨韧带（MMTL），并用针头轻柔探查组织，确认半月板完全脱离且具有活动性。
  7. 识别并横断前交叉韧带（ACL），注意避免损伤后交叉韧带（PCL）或外侧半月板。术后通常会出现前抽屉试验阳性，证实关节不稳定。
    注意：抽屉试验：在关闭伤口前，一手固定股骨，另一手握住踝关节，保持胫骨与股骨呈垂直方向。手动施加胫骨与股骨之间的前后向相对位移；若观察到明显的平移运动，则为抽屉试验阳性，证实交叉韧带断裂。
  8. 为诱导更严重的骨关节炎，可选择同时横断前交叉韧带（ACL）和后交叉韧带（PCL），并联合行内侧半月板切除术（MMT）（如经典的Hulth模型所示）。
    注意：此步骤为可选操作，可根据需要决定是否实施；若选择执行，则构成经典Hulth模型的建模方法。

3. 术后护理

  1. 使用4-0尼龙缝线关闭切口，并用碘酊对术区进行消毒。
  2. 将小鼠置于温度可控的加热垫上，直至其恢复意识并表现出正常的呼吸和运动活动。完全恢复且无任何痛苦迹象后，将其放回原饲养笼中。
  3. 术后连续3至5天密切监测缝线完整性。若发现缝线断裂，需重新麻醉小鼠并进行再次缝合。
  4. 术后最多连续3天给予肌肉注射抗生素，以预防术后感染。
    注意：抗生素用于预防术后感染。术后镇痛应根据实验目的决定；在骨关节炎研究中，通常在急性期避免使用镇痛药，以防干扰治疗效果的评估。
  5. 每天观察手术部位是否有肿胀、渗出或局部炎症迹象。
  6. 在实验终点按照批准的方案实施安乐死，并解剖膝关节用于组织学或影像学分析。
    注意：本步骤采用过量麻醉法对实验动物实施安乐死，即通过腹腔注射戊巴比妥钠溶液，剂量为>100 mg/kg（小鼠）。

4. 骨关节炎发展的评估

  1. 安乐死前，评估关节肿胀情况，并进行超声检查以评价膝关节的结构变化。通过转棒实验评估小鼠的运动功能。
    注：小鼠超声检查需要使用异氟烷麻醉。
  2. 安乐死后，解剖膝关节，小心去除周围肌肉和筋膜，保留胫骨、腓骨和股骨。
    ​将关节固定后置于10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脱钙，至少30天，每周更换溶液两次，以确保完全脱钙。
  3. 将脱钙后的膝关节包埋于石蜡中，并制备厚度为4 µm的矢状切片8。
  4. 当半月板清晰可见时开始收集切片。使用番红O-固绿染色法观察软骨和软骨下骨的形态。采用OARSI9评分系统评估软骨降解程度。
  5. 番红O-固绿染色步骤（使用商用试剂盒，参见材料表）
    1. 脱蜡与复水
      1. 将切片置于二甲苯中脱蜡3分钟，重复3次。
      2. 通过梯度乙醇（100%、90%、80%）复水以去除残留的二甲苯，每次2分钟。
        注：乙醇梯度必须按浓度由高到低顺序使用。
      3. 用蒸馏水冲洗1分钟，短暂沥干。
    2. Weigert铁苏木素染色
      1. 将Weigert工作液滴加至切片，染色5分钟。
      2. 用蒸馏水冲洗1分钟，短暂沥干。
    3. 酸性分化
      1. 将酸性分化液滴加至切片，作用15秒。
      2. 用水冲洗10分钟，沥去多余水分。
        注：分化时间至关重要——过度分化会阻碍固绿染色，而分化不足则导致固绿染色过深且番红O着色不良。
    4. 固绿染色
      1. 将固绿溶液滴加至切片，染色5分钟，短暂沥干。
      2. 使用弱酸溶液去除残留的固绿染料，作用15秒，然后短暂沥干。
    5. 番红O染色
      1. 将番红O溶液滴加至切片，染色4.5分钟。
      2. 迅速将切片转移至90%乙醇中以去除多余的番红O，2–3秒。
        注：此步骤可根据番红O染色强度适当延长。
    6. 脱水与透明
      1. 将切片在100%乙醇中脱水1分钟。
      2. 用二甲苯透明以完成脱水，每次2分钟，重复3次。
        注：本步骤所用二甲苯不得与第4.5.1节中使用的二甲苯混合；交叉污染可能影响切片质量。
    7. 中性树胶封片
      1. 将切片置于通风橱中，使多余二甲苯挥发。
      2. 取出切片，滴加适量中性树胶，小心加盖盖玻片。
      3. 在光学显微镜下检查是否存在气泡，并小心排除。
      4. 将切片放入载玻片盒中，置于60 °C烘箱内24小时，以确保中性树胶完全固化。

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结果

采用微型超声系统（扫描步长为 4 mm，轴向分辨率为 0.04 mm）对膝关节进行纵向扫描8。术后第 7 天，三维重建结果显示，与假手术组相比，模型组关节腔体积显著增加（图 2A、B）。转棒疲劳试验10,11 进一步证实了这一结果，显示在相同时间点，模型组小鼠的跑步耐力显著下降（图 2C）。

术后第28天，取膝关节，沿矢状面包埋于石蜡中，并切成4 µm切片8。切片采用藏红O-快绿染色，并根据OARSI组织病理学评分系统进行分级9。与假手术组相比，模型组关节面明显更为粗糙，可见局灶性及垂直性软骨裂隙。部分切片显示全层软骨缺失（5级），并伴有软骨下骨重塑（

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讨论

与其他手术建模方法（如内侧半月板失稳模型（DMM）和前交叉韧带切断模型（ACLT））相比，改良Hulth模型通过联合韧带和半月板损伤诱导骨关节炎。特定的结构破坏决定了关节在不同平面上的生物力学改变。ACLT4损害了旋转稳定性（内旋和外旋），并降低前后稳定性，导致抽屉试验阳性。DMM3破坏内侧半月板胫骨韧带（MMTL），使内侧半月板失稳，并削弱其在胫股运动中抵抗冲击力的能力，同时联合内侧副韧带切除，消除了对内收力的抵抗作用。改良Hulth模型结合了上述两种方法的生物力学变化，导致更快速且更严重的关节软骨破坏。内侧半月板切除术（MMT）12模型——经典Hulth手术的关键组成部分——完全移除内侧半月板，造成内侧间室应力分布不均，并通过关节面摩擦直接导致软骨磨损。经典Hulth模型7进一步破坏后交叉韧带（PCL），导致多个平面（内旋、外旋和内收）的完全结构失效，并引发相对较严重的骨关节炎。通常情况下，经典Hulth模型在约2周内即可产生严重的骨关节炎。然...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本研究由上海市科技创新行动计划（23YF1447900，项目负责人：CJM）、上海教育发展基金会和上海市教育委员会晨光计划（23CGA53，项目负责人：CJM）以及国家自然科学基金（U24A6013，项目负责人：XH）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器//规格：30 G × 0.13 mm
3D 超声 Vevo 3100 成像系统OpticVevo 2100一种高频超声成像系统，集成 Vevo LAB 软件用于数据分析。
4-0 尼龙缝合线//
75% 乙醇上海 titan 科学有限公司G73537O
C57BL/6J 雄性小鼠（6–8 周龄）上海杰思洁实验动物有限公司/
脱毛膏Veet批号：C021123001
碘酊//
异氟烷RWD R650-IE
显微镊子RWD F12013-10
显微剪刀RWD S11035-08
改良番红O-快绿染色试剂盒SolarbioG1371
持针器RWD F21001-12
手术刀片（10#）RWD S31010-01
手术显微镜OlympusSZ61

参考文献

  1. Sharma, L. Osteoarthritis of the Knee. N Engl J Med. 384 (1), 51-59 (2021).
  2. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Res. 5, 16044(2017).
  3. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  4. Zhou, X., et al. Antioxidant taurine inhibits chondrocyte ferroptosis through upregulation of OGT/Gpx4 signaling in osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection. J Adv Res. 77, 551-567 (2025).
  5. Jal Janusz, M., et al. Moderation of iodoacetate-induced experimental osteoarthritis in rats by matrix metalloproteinase inhibitors. Osteoarthritis Cartilage. 9 (8), 751-760 (2001).
  6. Meng, X., et al. An impaired healing model of osteochondral defect in papain-induced arthritis. J Orthop Translat. 26, 101-110 (2021).
  7. Rogart, J. N., Barrach, H. J., Chichester, C. O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 7 (6), 539-547 (1999).
  8. Xu, H., et al. Utilization of longitudinal ultrasound to quantify joint soft-tissue changes in a mouse model of posttraumatic osteoarthritis. Bone Res. 5, 17012(2017).
  9. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  10. Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the Cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. Int J Mol Sci. 23 (19), 11342(2022).
  11. Piel, M. J., Kroin, J. S., van Wijnen, A. J., Kc, R., Im, H. J. Pain assessment in animal models of osteoarthritis. Gene. 537 (2), 184-188 (2014).
  12. Obeidat, A. M., et al. A standardized approach to evaluation and reporting of synovial histopathology in two surgically induced murine models of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (10), 1273-1282 (2024).

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