一种由两种小分子组成的新型无血清二维和三维培养体系用于培养小鼠泪腺上皮细胞

Baihui Zeng; Shurong Wang; Cheng Li

doi:10.3791/70438

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方法文章

一种由两种小分子组成的新型无血清二维和三维培养体系用于培养小鼠泪腺上皮细胞

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DOI：

10.3791/70438

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2026年2月10日

Baihui Zeng¹^,² , Shurong Wang¹ , Cheng Li²^,³^,⁴

¹Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, ²Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, ³Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, ⁴Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

本文内容

摘要

介绍了一种使用小分子组合2C（Y27632和SB431542）的新型无血清培养系统，可高效扩增泪腺上皮细胞（LGECs），适用于二维和三维培养，能够精确调控其增殖与分化。

摘要

泪腺（LG）功能障碍是水样缺乏型干眼病的主要病因，基于细胞和组织工程的治疗方法对此类疾病具有显著潜力。然而，在无血清条件下培养获得足够数量的种子细胞仍存在困难，限制了这些疗法的广泛应用。本研究建立了一种新型无血清培养体系，利用两种小分子Y27632和SB431542（2C），可高效扩增泪腺上皮细胞（LGECs）。在LGECs的二维原代培养中，从小鼠（6–8周龄）分离泪腺组织，使用Dispase II和Collagenase A进行酶消化。将所得细胞悬液以7,500个细胞/cm²的密度接种于培养皿中。² 并在2C培养基中培养12–14天。当细胞融合度达到80–90%时，以1:2比例进行传代。对于三维（3D）培养，将10,000个P1代LGEC重悬于10 µL 2C培养基和10 µL基质胶中，随后接种于24孔板中央。在37 °C下静置30分钟使其凝固后，加入600 µL 2C培养基继续培养。对于分化诱导，3D球形结构先在2C培养基中培养7天，随后去除2C培养基并继续培养额外7天。在2C培养基中培养的LGEC表现出高增殖能力，干细胞特性及增殖相关标志物表达显著上调（Ki67、K14、P63、K5、K15，P值分别为0.0011、0.0002、0.0012、0.0003、0.0014），且即使经过十次传代仍能维持其形态特征和增殖能力。此外，在3D培养条件下，LGEC可形成具有干细胞/前体细胞特性的球形结构，在去除2C培养基后进一步分化为包含多种LG细胞类型（AQP5、K19、α-SMA阳性）并具备成熟分泌功能的微腺样结构。该方法有望为组织工程提供稳定的种子细胞来源，并提供一种新的体外用于研究LG生理学的模型。

引言

泪腺（LG）对于产生泪膜的水性层至关重要，而泪膜的水性层在维持眼表稳态中起着关键作用¹. LG 的功能障碍（由损伤或炎症引起）可导致水样液缺乏型干眼症（ADDE）。该疾病可引发严重的眼表炎症、慢性角膜病变，严重时可导致永久性视力丧失²目前针对ADDE的治疗方法主要局限于缓解症状，而未能解决潜在的腺体功能障碍，因此其长期疗效有限。¹. 泪腺功能障碍的靶向治疗开发面临若干挑战，包括缺乏长期、简便的方法体外模型限制了对泪腺病理生理学的理解，并阻碍了有效疗法的开发。尽管细胞移植在促进泪腺再生方面展现出一定潜力，但细胞扩增能力有限体外现有培养系统的复杂性给临床应用带来了重大障碍¹^,³因此，建立一种简单且可长期培养的成年小鼠泪腺培养体系，对于深入理解泪腺的生理与病理机制至关重要，同时也可为泪腺损伤修复与再生提供可靠的泪腺干细胞/前体细胞来源。

现有体外 LG的培养系统已取得显著进展，但仍面临明显局限。许多此类方法依赖添加血清的培养基，这会引发一系列问题，如批次间差异、成分不明确，以及成纤维细胞或间充质细胞污染的风险。⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸此外，基于血清的体系不适用于研究LG疾病的发生机制，并且由于存在免疫排斥风险，给细胞移植治疗带来挑战⁹针对这些局限性，已开发出多种无血清方法用于培养小鼠和人类的泪腺上皮细胞（LGECs）。例如，Ueda 等人成功采用无血清方法培养了新生小鼠的 LGECs¹⁰然而，该方法受限于无法对细胞进行传代培养，且需要大量新生小鼠唾液腺以获得足够的唾液腺上皮细胞。类似地，Kobayashi 等人开发了一种含霍乱毒素的无血清培养体系，但在传代过程中维持细胞形态方面遇到了困难。¹¹最近的进展包括 Zhang 等人开发的小鼠 LG 干细胞三维培养系统，以及 Bannier-Hélaouët 等人建立的小鼠和人类 LG 类器官培养系统¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵然而，这些系统依赖于包含多种小分子、生长因子和添加剂的复杂培养基，使培养过程复杂化，并限制了其可扩展性。这些挑战凸显了建立一种简化且高效的无血清培养体系的必要性，该体系能够在维持LGECs增殖能力及干/祖细胞特性的同时，促进其高效扩增，从而推动其在治疗应用和科学研究中的进一步发展。

近年来，小分子介导的化学重编程技术的快速发展为成体原代细胞的维持与扩增提供了新的策略体外¹⁶通过调控细胞内信号通路、细胞-基质相互作用和细胞黏附，小分子显著促进细胞增殖和可塑性，从而提高细胞扩增效率和命运调控能力¹⁷由于其可调控的制备过程、低免疫原性以及非基因组整合特性，小分子非常适用于构建体外用于扩增成体上皮细胞的系统¹⁶不同小分子的组合已被证明可有效维持体外多种原代细胞类型的扩增，包括皮肤、角膜和结膜上皮干细胞¹⁸^,¹⁹^,²⁰因此，开发基于小分子的LGEC扩增策略，在未来的研究和治疗应用中具有广阔潜力。

本方案中开发了一种简单高效的无血清培养体系，利用两种小分子Y27632和SB431542（2C）支持LGECs的扩增。通过结合这两种分子的优势，建立了适用于二维（2D）和三维（3D）培养的无血清体系。使用2C培养的LGECs表现出高增殖能力以及干细胞/前体细胞特性，在连续传代至少10次后仍维持典型的上皮细胞形态关键词：无血清培养体系，小分子，Y27632，SB431542，2C，LGECs，二维培养，三维培养，增殖能力，干细胞特性，前体细胞特性，上皮细胞形态体外在三维培养中，LGECs不仅保留了干细胞/祖细胞特征，还表现出在去除2C后进一步分化为具有分泌功能的微腺体结构的能力。该无血清体系适用于体外 LG生理学与病理学模型，同时也为泪腺组织工程和再生应用提供了充足的细胞来源。然而，本方案仅对三维培养进行了初步探索，长期三维培养在现阶段尚未纳入本研究的范围。需要特别指出的是，该方法专为成年小鼠LGECs设计，若用于其他物种，可能需要进一步优化才能适用。

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方案

所有实验均遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）以及吉林大学和厦门大学实验动物伦理委员会的规定进行。

注意：所有细胞培养操作均在细胞操作室的紫外灭菌生物安全柜中进行。

1. 涎腺上皮细胞原代培养

LG 组织的分离
1. 通过颈椎脱位法处死已麻醉的 C57BL/6J 小鼠（6–8 周龄），并用 75% 乙醇对耳部区域（围绕 LG 的区域）进行消毒，以避免污染。
2. 从外眦处开始，沿耳下皮肤做切口以暴露 LG。在解剖显微镜下，使用无菌平头镊子和剪刀小心地将 LG 从周围组织（腮腺和结缔组织）中分离出来，获得完整的 LG 组织。
3. 将 LG 置于预冷的组织收集液（含 10% 青霉素-链霉素-两性霉素的 DMEM）中，放入 1.5 mL 微量离心管内，并保持组织处于冰上，以最大限度减少降解。
组织准备
1. 将 LG 转移至 3.5 cm 培养皿中的新鲜冷组织收集液中。
2. 去除残留的小鼠毛发，然后剥离包裹 LG 的结缔组织被膜。使用平头镊子去除小叶之间的结缔组织，分离腺体组织。
  注意：确保彻底去除 LG 表面的被膜以及小叶之间的结缔组织，以暴露小叶间的导管结构，这将有助于后续消化过程中消化液的充分渗透。
3. 将组织转移至新的收集液中，清洗 5–10 分钟，防止污染。
酶消化
1. 将 LG 放入含有消化液（无血清培养基中添加 2 mg/mL Dispase II 和 2 mg/mL Collagenase A）的 1.5 mL 微量离心管中。（补充表 1）
  注意：每 4 个 LG 需要 1 mL 消化液。
2. 在管内使用显微剪将 LG 组织精细剪切成小块（约 0.5–1 mm³）。
3. 将微量离心管置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 2.5–3 小时。每隔 30–60 分钟轻轻混匀组织与消化液，以确保酶消化充分进行。
LGECs 的分离与收集
1. 消化完成后，多次振荡微量离心管。用移液器反复吹打消化液，使组织分散为单细胞或小细胞团。在显微镜下观察以确认消化程度。
  注意：当消化液中无可见颗粒，且显微镜下观察到大量单细胞及类似导管结构的细胞聚集体时，停止消化过程。
2. 在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，弃去消化液。
3. 用 1 mL 无菌 DPBS 重悬细胞沉淀，并在室温下以 1000 x g 再次离心 3 分钟，以去除残留的消化酶。
4. 重复步骤 1.4.3，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 500 µL 无血清培养基中。
LGECs 的接种与原代培养
1. 通过在无血清培养基中添加 1% 青霉素-链霉素和 2C（10 µM Y27632 和 10 µM SB431542）配制 LGECs 培养基。（补充表 1）
2. 使用无血清 2C 培养基，以 7.5 x 10³ 个细胞/cm² 的密度将细胞接种至标准未处理的 24 孔培养板中。
3. 接种后，轻轻敲击培养板边缘，确保细胞分布均匀。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中。
4. 首次换液时间为接种后 72 小时，之后每 2–3 天更换一次培养基。
  注意：前 72 小时内避免扰动培养物。首次换液时无需用 DPBS 洗涤细胞，直接吸除旧培养基并加入新鲜培养基即可。

2. LGECs 的传代培养

注意：当细胞融合度达到80-90%时进行传代培养，通常在原代培养后约14天发生。

移除培养基，并用无菌 DPBS 轻轻洗涤细胞两次。
加入 250 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 10–15 分钟。当紧密连接解离且细胞变圆时，加入等体积的确定型胰蛋白酶抑制剂溶液以终止消化。
注意：若在原代培养过程中观察到扁平且较大的贴壁细胞，可先用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 处理 5 分钟以去除这些异质性细胞；随后再次使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 处理额外 5 分钟，进一步消化以获得更纯的 LGEC 群体，用于后续传代。
用 1 mL 移液器吹打混匀细胞悬液，转移至 1.5 mL 离心管中，在室温下以 1000 x g 离心 3 分钟，弃去上清液。
用无菌 DPBS 洗涤细胞，再次离心以收集 LGEC。
将 LGEC 重悬于 2C 培养基中，并按 1:2 比例进行传代培养。轻轻晃动培养板使细胞混匀，置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。
注意：1:2 传代比例是指当细胞融合度达到 80–90% 时，将一个培养孔板中的 LGEC 消化后均匀分配至两个新的培养孔板中。
接种后第 3 天更换培养基，之后根据细胞状态每 2–3 天更换一次培养基。
每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态，并拍照记录。

3. 涎腺上皮细胞的三维（3D）培养

注意：三维培养实验使用第1代LGEC。当第1代LGEC在含2C的培养基中培养7天并达到80-90%融合度时，可用于三维培养。

准备步骤
1. 将基质胶（补充表 1）从 -20 °C 冰箱转移至 4 °C 冰箱中，过夜解冻。
2. 将所需移液器吸头放入 -20 °C 冰箱中，确保充分预冷。
3. 在开始三维培养前 2 小时，将 24 孔培养板置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中预热。
4. 准备一个冰盒，并将若干 1.5 mL 微量离心管放入其中进行预冷。使用前在生物安全柜中对冰盒进行灭菌处理。
LGECs 的三维培养
1. 按照步骤 2.1 至 2.4 所述方法获取第 1 代 LGECs。
2. 用 2C 培养基重悬细胞沉淀，并调整细胞密度至每 10 µL 含 1 × 10⁴ 个细胞。
3. 从 4 °C 冰箱中取出已解冻的基质胶，从 -20 °C 冰箱中取出预冷的移液器吸头，并将其置于生物安全柜内的冰盒中。
4. 从培养箱中取出预热的 24 孔培养板，放入生物安全柜中。
5. 使用预冷的移液器吸头，取适量细胞悬液与基质胶按 1:1 体积比混合，轻柔混匀以确保分布均匀。
6. 小心吸取步骤 3.2.5 中的混合液 20 µL，滴加至预热的 24 孔板每孔中央。
7. 将培养板倒置，于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 30 分钟，使基质胶充分凝固。
8. 待基质胶凝固后，向每孔加入 600 µL 2C 培养基。
9. 将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中继续培养 14 天。接种后第 3 天更换培养基，之后每 2–3 天更换一次，具体频率根据细胞状态调整。
10. 每日在倒置相差显微镜下观察三维球状体形成情况，并拍照记录。
三维 LGEC 球状体的分化
1. 按照步骤 3.2 所述方法培养三维 LGEC 球状体。
2. 培养 7 天后，吸除 2C 培养基，用 DPBS 轻柔洗涤细胞两次，以去除残留的 2C 成分。操作时注意避免扰动基质胶。
3. 加入不含 2C 的无血清培养基（Null），继续培养 7 天以诱导分化。
4. 在培养期间每 2–3 天更换一次培养基。
5. 每日在倒置相差显微镜下观察诱导后三维球状体的形态变化，并拍照记录。

4. 分化后的3D LGEC球体的包埋与冷冻切片

注意：3D 类球体的分化诱导方法如第 3.3 节所述。分化 7 天后，请按照以下步骤对已分化的 3D 类球体进行最佳切割温度（OCT）包埋及冷冻切片。

沿孔板边缘吸除培养基。用无菌 DPBS 轻柔洗涤已分化的类球体三次。
在生物安全柜或通风橱中向孔内加入 1 mL 4% 多聚甲醛（PFA），于室温固定类球体 10 分钟。
用无菌 DPBS 轻柔洗涤类球体三次，每次洗涤持续 10 分钟，以去除固定剂。
使用刮匙小心刮取 3D 类球体-基质胶呈圆顶状的结构，并将其转移至含有 20% 蔗糖溶液的 5 mL 微离心管中。
将离心管于 4 °C 过夜孵育，直至圆顶状结构沉降至管底。
从蔗糖溶液中取出圆顶状结构，小心去除残留的蔗糖，将其包埋于 OCT 包埋剂中。在液氮中速冻后，于 -80 °C 保存。
染色前，使用冷冻切片机制备 10 µm 厚的切片。

5. 分化后三维LGEC球体的分泌功能检测

样品采集
1. 按照第3.3节所述方法诱导3D类球体分化。
2. 分化7天后，移除培养基，并用DPBS清洗3D类球体三次。
3. 加入500 µL不含2C的无血清培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。
4. 收集培养基，转移至1.5 mL微量离心管中，作为基线样品用于检测毛果芸香碱刺激前的乳铁蛋白（LTF）浓度。
5. 用无菌DPBS轻柔清洗3D类球体三次。
6. 加入500 µL含有1 µg/mL毛果芸香碱的无血清培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。
7. 孵育结束后，将培养基收集至1.5 mL微量离心管中（用于检测毛果芸香碱刺激后的LTF浓度）。
8. 将收集的培养基样品在4 °C、1000 × g条件下离心20分钟。收集上清液并储存在-80 °C以备后续使用。
样品稀释
1. 从-80 °C冰箱中取出样品，在室温下完全解冻。
2. 取5 µL样品，加入495 µL酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒中的样品稀释缓冲液，配制100倍稀释样品。
试剂准备
1. 使用前20分钟将ELISA试剂盒中所有试剂恢复至室温。
2. 配制洗涤缓冲液：根据样品数量计算所需体积，将浓缩洗涤缓冲液用蒸馏水稀释（1:24）。
3. 配制标准品工作液：
  1. 将冻干标准品在10,000 × g条件下离心1分钟。加入1 mL参考标准品和样品稀释液，静置10分钟，并轻轻颠倒混匀数次。
  2. 待其完全溶解后，用移液器充分混匀。此重悬过程得到浓度为2000 pg/mL的工作液。
4. 根据试剂盒说明书进行系列稀释，配制以下标准品浓度梯度：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/mL。
5. 配制生物素化检测抗体工作液：
  1. 计算实验所需体积（50 µL/孔）。将浓缩的生物素化检测抗体在800 × g条件下离心1分钟，然后用生物素化检测抗体稀释液将50×浓缩液稀释至1×工作液。
  2. 使用前现配，配制量略多于计算值，通常多加100–200 µL。
6. 配制辣根过氧化物酶（HRP）偶联物工作液：
  1. 计算实验所需体积（50 µL/孔）。将浓缩的HRP偶联物在800 × g条件下离心1分钟，然后用HRP偶联物稀释液稀释至1×工作浓度。
  2. 使用前现配，配制量略多于计算值，通常多加100–200 µL。
ELISA检测步骤
1. 确定稀释标准品、空白孔和样品的加样孔位，每组设三个重复。向相应孔中加入25 µL标准品工作液、空白液或稀释后的样品溶液。用试剂盒提供的封板膜覆盖酶标板，在37 °C孵育90分钟。
  注：加样时应将溶液加至微孔底部，尽量避免接触孔壁内侧或产生气泡。
2. 倾去孔内液体，无需洗涤。立即向每孔加入50 µL生物素化检测抗体工作液。用新的封板膜覆盖酶标板，在37 °C孵育60分钟。
3. 倾去孔内液体，向每孔加入350 µL配制好的洗涤缓冲液。浸泡1分钟后，吸去或倾去液体，并用洁净的吸水纸拍干。重复此洗涤步骤3次。
  注：洗涤过程中切勿让孔内干燥。
4. 向每孔加入50 µL配制好的HRP偶联物工作液。用新的封板膜覆盖酶标板，在37 °C孵育30分钟。
5. 倾去孔内液体，按照步骤5.4.3所述方法，用洗涤缓冲液重复洗涤5次。
6. 向每孔加入50 µL底物试剂。用新的封板膜覆盖酶标板，在37 °C避光孵育15分钟。
7. 向每孔加入25 µL终止液以终止反应。确保终止液的加入顺序与底物试剂一致。
8. 立即使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的光密度（OD值）。

6. RNA 提取

样本采集
1. 对于泪腺组织
  1. 按照第1.1.2-1.1.2节所述方法，从成年小鼠中分离眶外泪腺（LG）组织。
  2. 将新鲜分离的LG组织浸入PBS中，以洗去血液残留。
  3. 用滤纸吸干LG表面水分，将组织放入含有1 mL RNA提取试剂（补充表1）的1.5 mL微量离心管中，并将管子置于冰上。
    注意：在RNA提取前进行研磨步骤，以确保组织完全裂解。
  4. 向微量离心管中加入两颗洁净的钢制研磨珠，然后将管子放入预冷的高速低温研磨仪中。
  5. 设置研磨参数：频率70 Hz，研磨时间45秒，暂停时间15秒，重复10个循环。拧紧研磨仪盖子手柄后开始研磨。
  6. 研磨完成后，将管子置于冰上或保存于-80 °C，用于后续RNA提取。
2. 对于LG上皮细胞（LGECs）
  1. 当LGECs达到80–90%融合度时，移除培养基，并用无菌DPBS洗涤细胞三次。
  2. 向每个孔（24孔板）加入600 µL RNA提取试剂，在室温下孵育5–10分钟。
  3. 使用1 mL移液器反复吹打每个孔中的RNA提取试剂溶液，以确保细胞完全裂解。
  4. 将溶液转移至1.5 mL微量离心管中。
  5. 将管子置于冰上或保存于-80 °C，用于后续RNA提取。
3. 对于三维LGEC球状体（3D LGEC spheroids）
  1. 收集培养14天的未分化和已分化三维LGEC球状体（如步骤3.2–3.3所述）。向每个孔加入1 mL消化液（含1 mg/mL Dispase II的无血清培养基），确保三维球状体-基质胶形成的穹顶样结构完全被覆盖。在37 °C、5% CO₂条件下孵育30分钟。
  2. 使用1 mL移液器将含有三维球状体的消化液转移至1.5 mL微量离心管中。在1000 × g条件下离心3分钟，收集球状体沉淀。
  3. 用1 mL DPBS洗涤沉淀，并在1000 × g条件下再次离心3分钟，重新收集沉淀。
  4. 按每20 µL基质胶加入600 µL RNA提取试剂，并在室温下孵育5–10分钟。
  5. 使用1 mL移液器充分混匀，以确保三维球状体完全裂解。
  6. 将管子置于冰上或保存于-80 °C，用于后续RNA提取。
RNA提取
注意：穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套、口罩），所有涉及氯仿和异丙醇的操作均应在通风橱中进行。化学废液应按照机构废弃物处理规程，倒入标有“危险废物产生”的指定危险废物容器中。
1. 向含有RNA样本的离心管（来自步骤6.1，管中已含RNA提取试剂）中加入氯仿（体积为RNA提取试剂的1/5）。
  注意：该操作应在通风橱中进行。
2. 使用涡旋振荡器充分混匀，在室温下孵育10分钟，直至出现相分离。
3. 在4 °C条件下，以14,000 × g离心10分钟。
  注意：离心后液体将分为三层，RNA位于最上层透明的水相中。
4. 准备一个新的1.5 mL无RNase离心管，在通风橱中加入异丙醇（体积为RNA提取试剂的1/2）。
5. 小心吸取最上层透明水相（体积为RNA提取试剂的1/2）至新的无RNase离心管中。
  注意：移液时注意避免污染中间层。
6. 轻轻颠倒混匀数次，室温孵育10分钟，然后在4 °C条件下再次以14,000 × g离心10分钟。
7. 弃去上清液，加入500 µL 75%乙醇，通过颠倒混匀洗涤沉淀。在4 °C条件下再次以14,000 × g离心5分钟。
8. 重复步骤6.2.7。弃去上清液，并进行短暂离心以去除残留液体。
9. 将管子置于通风橱中的冰上，打开管盖，静置空气干燥10–20分钟，直至白色沉淀变为半透明。
10. 加入20 µL无RNase水溶解沉淀。使用分光光度计测定RNA浓度和纯度。
  注意：若RNA浓度过高，可用适量无RNase水稀释。
11. 将RNA溶液置于冰上或保存于-80 °C，用于后续逆转录反应。

7. 定量反转录PCR（qRT-PCR）

反转录
1. 根据制造商说明书，按以下顺序向PCR反应管中加入组分：800 ng总RNA（根据其浓度计算所需体积）、4 µL 5x All-in-One SuperMix for q-PCR、1 µL gDNA去除剂，并用无RNase水补足至总体积20 µL。
2. 轻轻混匀各组分。将PCR仪设置为以下条件：55 °C反应6 min，80 °C反应1 min，随后置于12 °C保存。
3. 反转录反应完成后，将cDNA储存于-20 °C，或置于冰上用于后续qRT-PCR反应。
qRT-PCR
1. 按如下配方配制针对不同基因的qRT-PCR预混液：5 µL 2x Green qPCR SuperMix、0.2 µL正向引物（10 µM）、0.2 µL反向引物（10 µM）以及3.6 µL无核酸酶水。轻轻混匀后置于冰上。
2. 根据实验设计，向qRT-PCR管中加入9 µL qRT-PCR预混液（步骤7.2.1制备）和1 µL cDNA（步骤7.1制备）。
3. 在室温下以1000 × g离心2 min。
4. 将PCR管放入荧光定量PCR仪中进行检测。
  注：根据试剂制造商说明书，采用三步法程序：94 °C预变性30 s，随后进行40–45个循环，每个循环包括94 °C变性5 s、60 °C退火15 s、72 °C延伸10 s。
5. 采用比较CT法（2^-ΔΔCt）进行定量分析。
  注：每组数据应至少独立重复三次，以确保结果的可靠性。

8. 免疫荧光染色

注意：免疫荧光染色在汇合度为70-80%的24孔板培养的LGECs上进行，或在分化后的LGECs三维结构的冷冻切片上进行。

对于LGECs
1. 从孔中移除培养基，并用PBS洗涤细胞三次。
2. 在生物安全柜或通风橱中，向每孔加入500 µL的4%多聚甲醛（PFA），室温孵育15分钟以固定细胞。
3. 用PBS洗涤细胞三次，每次洗涤持续5分钟。
4. 向每孔加入500 µL的0.2% Triton X-100，覆盖细胞，室温孵育20分钟以通透细胞膜。
5. 用PBS洗涤细胞三次，每次洗涤持续10分钟。
6. 移除PBS，使用免疫组织化学标记笔在24孔板的每个孔周围画圈。向每孔加入50 µL的2% BSA，覆盖细胞，室温孵育1小时进行封闭。
7. 移除BSA，向每孔加入50 µL稀释的一抗（补充表1），覆盖LGECs，4 °C孵育16–18小时。
8. 移除一抗，重复步骤8.1.5。
9. 向每孔加入50 µL荧光标记的二抗，覆盖LGECs，室温避光孵育1小时。
10. 重复步骤8.1.5，避免光照。
11. 向每孔加入50 µL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液，覆盖LGECs，在荧光显微镜下观察染色情况。
对于3D LGEC球状体
1. 按照步骤4所述方法制备3D LGEC球状体的冷冻切片。按照步骤8.1.2–8.1.11所述流程进行免疫荧光染色。

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结果

建立使用2C的无血清LGECs培养体系
在本实验方案中，目标是建立一种更简单、更高效的培养体系，用于扩增原代小鼠LGECs。经过广泛筛选，成功开发出一种无血清的2C组合，仅包含Y27632和SB431542，可实现长期培养体外 LGECs的扩增。经过混合酶消化后，原代LGECs在含2C的培养条件下培养3天后开始贴壁并形成多个细胞克隆（数据未显示）。前3天是LGEC培养的关键时期，应避免干扰，因为此阶段的扰动会显著影响克隆形成，导致LGEC扩增失败。在含2C的培养条件下培养12天后，细胞克隆逐渐融合，细胞呈现有序的上皮样形态，细胞间连接紧密。相比之下，对照组（Null，不含2C）仅见少量贴壁细胞，形态不规则。 (图1A与Null组相比，2C显著增强了LGECs的增殖能力和干性特征，表现为Ki67阳性细胞比例升高以及K14表达增加 (图1B，C）。此外，qRT-...

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讨论

如引言所述，近年来已开发出多种用于LG细胞的无血清培养体系¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³然而，这些方法中的许多都存在局限性，包括细胞增殖能力差以及无法实现大规模扩增体外¹⁰^,¹¹此外，近期针对LG干细胞和类器官的无血清培养系统依赖于包含多种添加剂的复杂配方，使得培养条件变得不必要地复杂¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵例如，Zhang 等人采用 EGF、FGF10、Wnt3A 和 Y27632 联合多种细胞培养添加...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（82471048，82271045）；深圳市科技创新委员会项目（JCYJ20240813145510014）；吉林省卫生健康科研人才专项项目（2023SCZ63，2024SCZ53，2025SCZ65）；以及吉林省科技发展计划项目（YDZJ202601ZYTS389）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
-20°C 超低温冰箱	Haier
-80°C 超低温冰箱	Haier
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL 微量离心管	Kirgen	KG2211	RNase-free
35 mm 细胞培养皿	LABSELECT	12111
4 °C 冰箱	Haier
4% 多聚甲醛（PFA）	Servicebio	G1101
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Yeasen	708939ES03	于 -20 °C 保存，储存液浓度为 1 mg/mL（500×），使用时用 1× PBS 稀释至 1×
5 mL 离心管	ACMEC	AC17457
50 mL 离心管	LABSELECT	CT-002-50-SS
抗α-平滑肌肌动蛋白兔抗体	Abcam	ab5694	用抗体稀释缓冲液按 1:100 稀释
抗AQP5兔抗体	ABclonal	A9927	用抗体稀释缓冲液按 1:100 稀释
抗角蛋白14兔抗体	Abcam	ab181595	用抗体稀释缓冲液按 1:200 稀释
抗角蛋白19 兔抗体	Abcm	ab52625	用抗体稀释缓冲液按 1:400 稀释
抗Ki67兔抗体	Abcam	ab16667	用抗体稀释缓冲液按 1:200 稀释
生物安全柜	SterilGARD
牛血清白蛋白（BSA）	Yeasen	36101ES60	于 4°C 保存
C57BL/6J 小鼠	厦门大学实验动物中心
细胞培养板	LABSELECT	11312	24孔
细胞培养箱	Eppendorf
离心机	Eppendorf
氯仿	HUSHI	10006818	注意：操作时需在通风橱中进行
CO₂ 恒温培养箱	Eppendorf
胶原酶A	Roche	10103586001	于 -20 °C 保存，储存液浓度为 200 mg/mL（100×）
定义型胰蛋白酶抑制剂溶液（DTI）	Gibco	R007100
DermaLife K 角质形成细胞完全培养基（无血清培养基）	Life Line	LL-0007	于 4 °C 保存
D-Hanks	Biosharp	BL559A	用于稀释Dispase II
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D4540	用于稀释Y27632和SB431542
Dispase II	Sigma	D4693	于 -20 °C 保存，储存液浓度为 200 mg/mL（100×）
DMEM基础培养基（1×）	Gibco	C11995500BT
驴抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488标记	Invitrogen	A-21206	用抗体稀释缓冲液按 1:300 稀释
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Servicebio	G4200
无水乙醇	HUSHI	10009218	注意：用于配制其他浓度的乙醇溶液
冷冻切片机	Leica
低温高速研磨仪	Servicebio
倒置荧光显微镜	Leica
倒置显微镜	Olympus
异丙醇	HUSHI	80109270
激光共聚焦显微镜 FV3000	OLYMPUS
低温高速离心机	Eppendorf
乳铁蛋白（LTF）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒	Elabscience	E-MSEL-M0047	于 -20 °C 保存
基质胶（Matrigel）	82703	Mogengel	分装后于 -20 °C 保存
微量移液器	Eppendorf
酶标仪	Thermo Fisher Scientific
核酸酶-free水	Biosharp	BL510B
OCT包埋剂	Scigen	4586
PBS, 1× (pH 7.4)	Servicebio	G4202
PCR扩增仪	BIO-RAD
青霉素-链霉素	Biosharp	BL505A
青霉素-链霉素-两性霉素	Biosharp	BL142A
PerfectStart Green qPCR SuperMix试剂盒	TransGen Biotech	AQ601-01-V2	于 -20 °C 保存
PerfectStart Uni RT&qPCR试剂盒	TransGen Biotech	AUQ-01	于 -20 °C 保存
匹鲁卡品	Aladdin	P424663	于 -20 °C 保存，2500×
引物 AQP5 序列：正向：CATGAACCCAGCCCGATC TT 反向：CTTCTGCTCCCATCCCAT CC	Sangon Biotech
引物 K14 序列：正向：CCCACCTTTCATCTTCC CAATT 反向：AAGCCTGAGCAGCATGTAGCAG	Sangon Biotech
引物 K15 序列：正向：GAGGTGGCGTCTAACACA GA 反向：TCTGAGCCTCCATCTCAC AG	Sangon Biotech
引物 K19 序列：正向：ATTACTGCCCTGAGGAGC CA 反向：TTCAGCTCCTCAATCCGA GC	Sangon Biotech
引物 K5 序列：正向：CTCAGAGCTGAGGAACAT GC 反向：AGCTCCGCATCAAAGAAC AT	Sangon Biotech
引物 Ki67 序列：正向：ACCATCATTGACCGCTCC TT 反向：TTGACCTTCCCCATCAGG GT	Sangon Biotech
引物 LTF 序列：正向：CAGGAGCCAACAAATGTG CC 反向：TTGTACTGGTCCCTTTCG GC	Sangon Biotech
引物 P63 序列：正向：ATGTCACCGAGGTTGTG AAA 反向：GAATTCAGTGCCAACCTGTG	Sangon Biotech
引物 SOX10 序列：正向：ATCAGCCACGAGGTAATG TCCAAC 反向：ACTGCCCAGCCCGTAGCC	Sangon Biotech
引物 α-SMA 序列：正向：CTCCCTGGAGAAGAGCTA CG 反向：CGCTGACTCCATCCCAAT GA	Sangon Biotech
实时荧光定量PCR仪	Roche
RNA提取试剂（RNA isolater Total RNA Extraction Reagent）	Vazyme	R401-01	注意：操作时需在通风橱中进行
SB431542	Apexbio	A8249	于 -20 °C 保存，储存液浓度为 20 mM（2000×）
分光光度计 NanoDrop 1000	Thermo Fisher Scientific		用于测定RNA浓度
蔗糖	Macklin	S818046	用蒸馏水溶解
吐温X-100	Solarbio	T8200
超纯水纯化系统	Millipore
通用抗体稀释缓冲液	Epizyme	PS119	于 4 °C 保存
Y27632	Apexbio	B1293	于 -20 °C 保存，储存液浓度为 20 mM（2000×）

参考文献

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一种由两种小分子组成的新型无血清二维和三维培养体系用于培养小鼠泪腺上皮细胞

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