介绍了一种使用小分子组合2C（Y27632和SB431542）的新型无血清培养系统，可高效扩增泪腺上皮细胞（LGECs），适用于二维和三维培养，能够精确调控其增殖与分化。
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摘要
摘要
泪腺（LG）功能障碍是水样缺乏型干眼病的主要病因，基于细胞和组织工程的治疗方法对此类疾病具有显著潜力。然而，在无血清条件下培养获得足够数量的种子细胞仍存在困难，限制了这些疗法的广泛应用。本研究建立了一种新型无血清培养体系，利用两种小分子Y27632和SB431542（2C），可高效扩增泪腺上皮细胞（LGECs）。在LGECs的二维原代培养中，从小鼠（6–8周龄）分离泪腺组织，使用Dispase II和Collagenase A进行酶消化。将所得细胞悬液以7,500个细胞/cm²的密度接种于培养皿中。2 并在2C培养基中培养12–14天。当细胞融合度达到80–90%时，以1:2比例进行传代。对于三维（3D）培养，将10,000个P1代LGEC重悬于10 µL 2C培养基和10 µL基质胶中，随后接种于24孔板中央。在37 °C下静置30分钟使其凝固后，加入600 µL 2C培养基继续培养。对于分化诱导，3D球形结构先在2C培养基中培养7天，随后去除2C培养基并继续培养额外7天。在2C培养基中培养的LGEC表现出高增殖能力，干细胞特性及增殖相关标志物表达显著上调（Ki67、K14、P63、K5、K15，P值分别为0.0011、0.0002、0.0012、0.0003、0.0014），且即使经过十次传代仍能维持其形态特征和增殖能力。此外，在3D培养条件下，LGEC可形成具有干细胞/前体细胞特性的球形结构，在去除2C培养基后进一步分化为包含多种LG细胞类型（AQP5、K19、α-SMA阳性）并具备成熟分泌功能的微腺样结构。该方法有望为组织工程提供稳定的种子细胞来源，并提供一种新的 体外 用于研究LG生理学的模型。
引言
泪腺（LG）对于产生泪膜的水性层至关重要，而泪膜的水性层在维持眼表稳态中起着关键作用1. LG 的功能障碍（由损伤或炎症引起）可导致水样液缺乏型干眼症（ADDE）。该疾病可引发严重的眼表炎症、慢性角膜病变，严重时可导致永久性视力丧失2目前针对ADDE的治疗方法主要局限于缓解症状，而未能解决潜在的腺体功能障碍，因此其长期疗效有限。1. 泪腺功能障碍的靶向治疗开发面临若干挑战，包括缺乏长期、简便的方法 体外 模型限制了对泪腺病理生理学的理解，并阻碍了有效疗法的开发。尽管细胞移植在促进泪腺再生方面展现出一定潜力，但细胞扩增能力有限 体外 现有培养系统的复杂性给临床应用带来了重大障碍1,3因此，建立一种简单且可长期培养的成年小鼠泪腺培养体系，对于深入理解泪腺的生理与病理机制至关重要，同时也可为泪腺损伤修复与再生提供可靠的泪腺干细胞/前体细胞来源。
现有 体外 LG的培养系统已取得显著进展，但仍面临明显局限。许多此类方法依赖添加血清的培养基，这会引发一系列问题，如批次间差异、成分不明确，以及成纤维细胞或间充质细胞污染的风险。4<....
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方案
所有实验均遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）以及吉林大学和厦门大学实验动物伦理委员会的规定进行。
注意：所有细胞培养操作均在细胞操作室的紫外灭菌生物安全柜中进行。
1. 涎腺上皮细胞原代培养
- LG 组织的分离
- 通过颈椎脱位法处死已麻醉的 C57BL/6J 小鼠（6–8 周龄），并用 75% 乙醇对耳部区域（围绕 LG 的区域）进行消毒，以避免污染。
- 从外眦处开始，沿耳下皮肤做切口以暴露 LG。在解剖显微镜下，使用无菌平头镊子和剪刀小心地将 LG 从周围组织（腮腺和结缔组织）中分离出来，获得完整的 LG 组织。
- 将 LG 置于预冷的组织收集液（含 10% 青霉素-链霉素-两性霉素的 DMEM）中，放入 1.5 mL 微量离心管内，并保持组织处于冰上，以最大限度减少降解。
- 组织准备
- 将 LG 转移至 3.5 cm 培养皿中的新鲜冷组织收集液中。
- 去除残留的小鼠毛发，然后剥离包裹 LG 的结缔组织被膜。使用平头镊子去除小叶之间的结缔组织，分离腺体组织。
注意：确保彻底去除 LG 表面的被膜以及小叶之间的结缔组织，以暴露小叶间的导管结构，这将有助于后续消化过程中消化液的充分渗透。
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结果
建立使用2C的无血清LGECs培养体系
在本实验方案中，目标是建立一种更简单、更高效的培养体系，用于扩增原代小鼠LGECs。经过广泛筛选，成功开发出一种无血清的2C组合，仅包含Y27632和SB431542，可实现长期培养 体外 LGECs的扩增。经过混合酶消化后，原代LGECs在含2C的培养条件下培养3天后开始贴壁并形成多个细胞克隆（数据未显示）。前3天是LGEC培养的关键时期，应避免干扰，因为此阶段的扰动会显著影响克隆形成，导致LGEC扩增失败。在含2C的培养条件下培养12天后，细胞克隆逐渐融合，细胞呈现有序的上皮样形态，细胞间连接紧密。相比之下，对照组（Null，不含2C）仅见少量贴壁细胞，形态不规则。 (图1A与Null组相比，2C显著增强了LGECs的增殖能力和干性特征，表现为Ki67阳性细胞比例升高以及K14表达增加 (图1B，C）。此外，qRT-.......
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讨论
如引言所述，近年来已开发出多种用于LG细胞的无血清培养体系10,11,12,13然而，这些方法中的许多都存在局限性，包括细胞增殖能力差以及无法实现大规模扩增 体外10,11此外，近期针对LG干细胞和类器官的无血清培养系统依赖于包含多种添加剂的复杂配方，使得培养条件变得不必要地复杂12,13,14,15例如，Zhang 等人采用 EGF、FGF10、Wnt3A 和 Y27632 联合多种细胞培养添加.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（82471048，82271045）；深圳市科技创新委员会项目（JCYJ20240813145510014）；吉林省卫生健康科研人才专项项目（2023SCZ63，2024SCZ53，2025SCZ65）；以及吉林省科技发展计划项目（YDZJ202601ZYTS389）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| -20°C 超低温冰箱 | Haier | ||
| -80°C 超低温冰箱 | Haier | ||
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Kirgen | KG2211 | RNase-free |
| 35 mm 细胞培养皿 | LABSELECT | 12111 | |
| 4 °C 冰箱 | Haier | ||
| 4% 多聚甲醛（PFA） | Servicebio | G1101 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Yeasen | 708939ES03 | 于 -20 °C 保存，储存液浓度为 1 mg/mL（500×），使用时用 1× PBS 稀释至 1× |
| 5 mL 离心管 | ACMEC | AC17457 | |
| 50 mL 离心管 | LABSELECT | CT-002-50-SS | |
| 抗α-平滑肌肌动蛋白兔抗体 | Abcam | ab5694 | 用抗体稀释缓冲液按 1:100 稀释 |
| 抗AQP5兔抗体 | ABclonal | A9927 | 用抗体稀释缓冲液按 1:100 稀释 |
| 抗角蛋白14兔抗体 | Abcam | ab181595 | 用抗体稀释缓冲液按 1:200 稀释 |
| 抗角蛋白19 兔抗体 | Abcm | ab52625 | 用抗体稀释缓冲液按 1:400 稀释 |
| 抗Ki67兔抗体 | Abcam | ab16667 | 用抗体稀释缓冲液按 1:200 稀释 |
| 生物安全柜 | SterilGARD | ||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Yeasen | 36101ES60 | 于 4°C 保存 |
| C57BL/6J 小鼠 | 厦门大学实验动物中心 | ||
| 细胞培养板 | LABSELECT | 11312 | 24孔 |
| 细胞培养箱 | Eppendorf | ||
| 离心机 | Eppendorf | ||
| 氯仿 | HUSHI | 10006818 | 注意：操作时需在通风橱中进行 |
| CO2 恒温培养箱 | Eppendorf | ||
| 胶原酶A | Roche | 10103586001 | 于 -20 °C 保存，储存液浓度为 200 mg/mL（100×） |
| 定义型胰蛋白酶抑制剂溶液（DTI） | Gibco | R007100 | |
| DermaLife K 角质形成细胞完全培养基（无血清培养基） | Life Line | LL-0007 | 于 4 °C 保存 |
| D-Hanks | Biosharp | BL559A | 用于稀释Dispase II |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D4540 | 用于稀释Y27632和SB431542 |
| Dispase II | Sigma | D4693 | 于 -20 °C 保存，储存液浓度为 200 mg/mL（100×） |
| DMEM基础培养基（1×） | Gibco | C11995500BT | |
| 驴抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488标记 | Invitrogen | A-21206 | 用抗体稀释缓冲液按 1:300 稀释 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Servicebio | G4200 | |
| 无水乙醇 | HUSHI | 10009218 | 注意：用于配制其他浓度的乙醇溶液 |
| 冷冻切片机 | Leica | ||
| 低温高速研磨仪 | Servicebio | ||
| 倒置荧光显微镜 | Leica | ||
| 倒置显微镜 | Olympus | ||
| 异丙醇 | HUSHI | 80109270 | |
| 激光共聚焦显微镜 FV3000 | OLYMPUS | ||
| 低温高速离心机 | Eppendorf | ||
| 乳铁蛋白（LTF）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒 | Elabscience | E-MSEL-M0047 | 于 -20 °C 保存 |
| 基质胶（Matrigel） | 82703 | Mogengel | 分装后于 -20 °C 保存 |
| 微量移液器 | Eppendorf | ||
| 酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 核酸酶-free水 | Biosharp | BL510B | |
| OCT包埋剂 | Scigen | 4586 | |
| PBS, 1× (pH 7.4) | Servicebio | G4202 | |
| PCR扩增仪 | BIO-RAD | ||
| 青霉素-链霉素 | Biosharp | BL505A | |
| 青霉素-链霉素-两性霉素 | Biosharp | BL142A | |
| PerfectStart Green qPCR SuperMix试剂盒 | TransGen Biotech | AQ601-01-V2 | 于 -20 °C 保存 |
| PerfectStart Uni RT&qPCR试剂盒 | TransGen Biotech | AUQ-01 | 于 -20 °C 保存 |
| 匹鲁卡品 | Aladdin | P424663 | 于 -20 °C 保存，2500× |
| 引物 AQP5 序列： 正向：CATGAACCCAGCCCGATC TT 反向：CTTCTGCTCCCATCCCAT CC | Sangon Biotech | ||
| 引物 K14 序列： 正向：CCCACCTTTCATCTTCC CAATT 反向：AAGCCTGAGCAGCATGTAGCAG | Sangon Biotech | ||
| 引物 K15 序列： 正向：GAGGTGGCGTCTAACACA GA 反向：TCTGAGCCTCCATCTCAC AG | Sangon Biotech | ||
| 引物 K19 序列： 正向：ATTACTGCCCTGAGGAGC CA 反向：TTCAGCTCCTCAATCCGA GC | Sangon Biotech | ||
| 引物 K5 序列： 正向：CTCAGAGCTGAGGAACAT GC 反向：AGCTCCGCATCAAAGAAC AT | Sangon Biotech | ||
| 引物 Ki67 序列： 正向：ACCATCATTGACCGCTCC TT 反向：TTGACCTTCCCCATCAGG GT | Sangon Biotech | ||
| 引物 LTF 序列： 正向：CAGGAGCCAACAAATGTG CC 反向：TTGTACTGGTCCCTTTCG GC | Sangon Biotech | ||
| 引物 P63 序列： 正向：ATGTCACCGAGGTTGTG AAA 反向：GAATTCAGTGCCAACCTGTG | Sangon Biotech | ||
| 引物 SOX10 序列： 正向：ATCAGCCACGAGGTAATG TCCAAC 反向：ACTGCCCAGCCCGTAGCC | Sangon Biotech | ||
| 引物 α-SMA 序列： 正向：CTCCCTGGAGAAGAGCTA CG 反向：CGCTGACTCCATCCCAAT GA | Sangon Biotech | ||
| 实时荧光定量PCR仪 | Roche | ||
| RNA提取试剂（RNA isolater Total RNA Extraction Reagent） | Vazyme | R401-01 | 注意：操作时需在通风橱中进行 |
| SB431542 | Apexbio | A8249 | 于 -20 °C 保存，储存液浓度为 20 mM（2000×） |
| 分光光度计 NanoDrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | 用于测定RNA浓度 | |
| 蔗糖 | Macklin | S818046 | 用蒸馏水溶解 |
| 吐温X-100 | Solarbio | T8200 | |
| 超纯水纯化系统 | Millipore | ||
| 通用抗体稀释缓冲液 | Epizyme | PS119 | 于 4 °C 保存 |
| Y27632 | Apexbio | B1293 | 于 -20 °C 保存，储存液浓度为 20 mM（2000×） |
参考文献
- Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: the unmet challenges and promise for dry eye therapy. Ocul Surf. 25, 129-141 (2022).
- Chen, X., Li, S., Zhang, Y., Ye, L. Pro....
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