利用荧光融合蛋白报告器可视化并定量分析基因毒素诱导的细胞内PARP1/PARP2活化

摘要

本文介绍了一种基于细胞的可视化、亚细胞定位及定量分析固定哺乳动物细胞中多（ADP-核糖）（PAR）富集灶的方法。该检测法能够定量DNA损伤诱导PARP激活的位点，包括与碱基切除修复或单股断裂修复相关的部位，均发生在基因毒素暴露细胞的细胞核中。

摘要

聚（ADP-核糖）（PAR）是一种由ADP-核糖聚合酶家族的四个成员——PARP1、PARP2、PARP5a和PARP5b合成的ADP-核糖聚合物。然而，只有PARP1和PARP2会在DNA断裂时合成PAR。PAR被定义为蛋白质翻译后修饰，但也被证明存在于DNA或RNA修饰中。PAR的水平还由PARG进一步调控，PARG是一种PAR糖水解酶，与PARP1和PARP2一起调节DNA损伤诱导PAR的细胞水平。PAR的动态合成和降解对其在DNA修复及DNA损伤反应中的调控作用至关重要，进而影响染色质的重组、复制、转录和细胞死亡。PARP1/PARP2的活化及PAR的积累可视为持续的碱基切除修复或DNA单链断裂修复的部位;然而，许多PARP1/PARP2激活因子也与复制应激及其他DNA代谢过程相关。一旦形成，PAR链通过其PAR结合结构域（PBD）促进DNA修复和DNA损伤响应（DDR）因子的招募，目标为DNA损伤或基因组损伤部位。十种不同的 PBD 识别 PAR 分子的不同区域，包括 PAR 结合基序、PAR 结合锌指、WWE 结构域和宏域等。为促进细胞对PAR动力学的分析，我们使用融合于增强绿色荧光蛋白（EGFP）的PBDs，优化基于细胞的PAR焦点定量。我们描述了一种检测方法，利用编码PBD/WWE结构域的RNF146片段，与EGFP相关，以可视化和量化基因组损伤及持续BER或SSBR位点的PAR积累。我们描述了实验步骤，包括生成慢病毒颗粒、目标细胞系的转导、对哺乳动物细胞进行基因组损伤处理、获取共聚焦荧光显微照片以及数据的半自动定量。

引言

该方案描述了LivePAR测定法，该方法允许在哺乳^{动物细胞中}基因组损伤部位（主要与碱基切除修复（BER）或单链断裂修复（SSBR）相关的多核糖（ADP-核糖）（PAR）进行可视化和定量分析，^1,2,3。BER是DNA修复途径，可去除DNA中受损或修饰的碱基（关于BER和PARylation的综述，见4,5,6,7）。BER始于DNA糖苷酶，识别并切除修饰碱^基4，留下apurinic/apyrimidin酸（AP）位点，例如甲基嘌呤糖苷酶（MPG），切除甲基化碱^基8,9，^或8-氧鸟嘌呤糖苷酶（OGG1），切除8-氧氧鸟嘌呤糖苷^酶9,10。随后，AP位点被AP内切酶1（APE1）^11,12,13切割，在DNA骨架上形成缺口。聚合酶，即DNA聚合酶β（Polβ）^14,15，利用未受损的链作为模板来调整并填补缝隙，最后DNA连接酶封闭修复链^16,17，例如DNA连接酶I或DNA连接酶III。

BER和SSBR的关键参与者是多（ADP-核糖）聚合酶1和2（PARP1/PARP2）18,19,20，这些酶能在BER或SSBR期间快速检测DNA链断裂。检测到这些断裂后，PARP1/PARP2催化ADP核糖聚合物添加到自身及其他蛋白质中——这一过程称为PARylation（详见综述，见⁶）——通过水解NAD⁺实现。这形成了一个动态的蛋白质支架（PAR），能够招募其他DNA修复因子到损伤部位，从而增强DNA修复的保真度。为管理这一动态PAR支架，多种蛋白质参与PAR链的水解和去除，包括ADP-核糖受体水解酶3（ARH3）、末端ADP-核糖糖基水解酶1（TARG1）、单-ADP-核糖水解酶1/2（MacroD1/2）以及聚（ADP-核糖）糖水解酶（PARG）6,21,22,23,24,25,26 .然而，PARG主要负责这一过程^21,27，并在DNA损伤反应（DDR）^28,29中起着关键作用。

因此，PARG与PARP1和PARP2的功能密切相关。PARP1和PARP2合成PAR聚合物，PARG则作为“清理”酶，水解这些聚合物，有效逆转PARylation30,31。这一过程对于完成BER和SSBR以及允许PARP1/PARP2被回收以应对新的DNA损伤至关重要。因此，PARP1、PARP2、PARylation和PARG协同工作，确保通过BER和SSBR ^4,6实现高效且可逆的DNA修复。

PA调节的程度受多种因素影响，并在整体DNA损伤反应中起着关键作用³²。这些因素包括暴露于在DNA碱基中添加加合物的杰诺毒素，如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基鸟苷（MNNG）、甲基甲烷磺酸盐（MMS）、过氧化氢（H₂O₂）或叔丁基过氧化氢（tBuOOH）。此外，PARylation的程度还可能受到调节PARylation过程的分子影响，如二氢烟酰胺核苷（NRH），它是NAD⁺的前体，通过增加NAD⁺水平增强PARP激活;或FK866（NAMPT抑制剂，能降低NAD⁺水平并负向调控PARP激活³）.最后，PARP1/PARP2、PARG或其他DNA修复蛋白（如BER缺陷或同源重组因子如BRCA1/BRCA2）的遗传突变或小分子抑制，可以改变PARP的激活^33,34,35,36。

LivePAR检测利用无名指蛋白146（RNF146）的一段，该片段编码WWE结构域（氨基酸100–182），并与增强绿色荧光蛋白（^EGFP）3相连。WWE结构域是一个球状结构域，以其结合位^点37中保守的色氨酸（W）和谷氨酸（E）残基命名。WWE结构域结合异-ADP-核糖，PAR链中最小的内部结构单元^38,39。RNF146是一种E3泛素连接酶，识别iso-ADP-核糖^38,40，据报道能靶向与BER（XRCC1、DNA连接酶III和PARP1）相关的蛋白酶降解蛋白酶⁴¹。将该WWE结构域与EGFP连接，使得哺乳动物细胞中由GENOTOXIN诱导的PARylation位点的可视化和检测成为可能。在本协议中，我们描述了表达LivePAR报告蛋白的稳定细胞系的生成（见图1A）、诱导DNA损伤以激活PARP1/PARP2、PAR的产生，以及共聚焦荧光显微镜数据的获取和分析（见图1）。

pMD2.g（VSVG）质粒提供病毒包膜糖蛋白（VSVG），使病毒可感染的细胞范围相较于原生的焦病毒包膜蛋白更广泛。pRSV-REV质粒提供调控元件（REV）蛋白，这是一种关键的转激活因子，能结合病毒RNA并激活病毒基因的转录;它对于病毒复制的高效至关重要。pMDLg/pRRE质粒提供若干关键的内部包装成分，即gag，编码基质（MA）、衣壳（CA）和核衣壳（NC）蛋白;pol，编码病毒复制和整合入宿主细胞基因组所需的酶;以及RNA调控元件（RRE），这是一种增强病毒RNA翻译和基因组RNA包装效率的RNA元素。pLV-EF1A-LivePAR-Hygro质粒（图1A）含有编码增强绿色荧光蛋白（EGFP）的cDNA，该蛋白与RNF146（氨基酸100–182）WWE结构域的C端融合，该蛋白结构域结合多（ADP-核糖）链，载体还编码一个抗性菌素盒。病毒从细胞培养上清液中分离出来，可在-80°C下储存，或立即用于转导（见图1B）。

方案

1. 慢病毒的产生

注意：该方案采用第三代慢病毒包装系统^42,43，生成表达遗传编码PAR报告蛋白的细胞。在293FT细胞中，利用由包膜、调控和包装组成的四质粒系统，以及编码EGFP标记的RNF146 WWE结构域的pLV-EF1A-LivePAR-Hygro构造体，该结构结合多（ADP-核糖）链。所得病毒用于生成稳定细胞系，用于PAR积累的可视化和定量化。

1. 在37°C加湿气氛下，293FT低传代293FT细胞，含10%FBS和1%Pen/链球菌，_CO2浓度为5%。确保293FT细胞培养时间不超过3周。
   注意：我们通常使用293FT细胞，传代数在3到10之间。293FT细胞被SV40大T抗原转化并永生化。这些细胞具有高转染效率，这对于重组蛋白生产和基因表达研究至关重要。它们对脂质转染和病毒转导方法均有良好反应。
2. 第1天将1.7×10,5,293英尺的细胞置于60毫米组织培养皿上，最终体积为5.5毫升培养基。将细胞放回孵化器24小时。
3. 在第2天（转染当天），将375微升无FBS和Pen/链球菌的DMEM培养基加入1.5毫升无菌微离心管。然后加入10微升脂质转染试剂、4微克pLV-EF1A-LivePAR-Hygro质粒、2微克pMD2.g（VSVG）质粒、2微克pRSV-REV质粒和2微克pMDLg/pRRE质粒。轻轻敲击微离心管，混合培养基、转染试剂和质粒DNA（避免漩涡）。在室温下培养15–30分钟，以便形成DNA/转染试剂复合物。
4. 将质粒/转染试剂混合物加入包含293FT细胞的60毫米碟中，无需滴滤培养基。将细胞放回孵化器，保存48小时。
   注意：此期间允许慢病毒颗粒产生并释放到培养基中。
5. 第4天，收集转染的293FT细胞培养基以分离慢病毒颗粒。通过无菌0.45微米过滤器过滤，将细胞残渣与慢病毒颗粒分离。
6. 用可用试剂（可选）测定慢病毒滴度。
   注意：该方法通常每毫升产生10⁵ 至10⁶ 感染单位（IFU/mL），当使用时，其感染倍数（MOI）约为~5，如下述转导步骤所述。
7. 将含有慢病毒颗粒的培养基分割成四个无菌冷冻瓶（每管1.0毫升），并在-80°C下储存。

2. 传导

注意：本节概述了将转基因引入细胞系的蚿病毒转导方案（见图1B）。在我们的实验室^{1、3、33、37、44、45}中一直有效。

1. 在适当培养基中培养选择的细胞系（传代数较低），在37°C加湿气温下，_CO2含量为5%。
   注意：从所需细胞类型的早期传代开始。新细胞瓶必须至少解冻并传代一次，才能播种进行转导。
2. 第一天，每个孔将1个×10个⁵–1.5个×10个⁵ 细胞，分别在6孔板的每个孔中，2毫升培养基中播种。将细胞放回孵化器24小时。
3. 在第2天（转导当天），确保细胞的汇合率在20%到40%之间。将1毫升病毒、1毫升培养基和2微升聚布烯（2 mg/mL高汤）加入15毫升锥形管中，轻柔地通过倒转混合（避免涡旋）。
   注：聚甲苯在慢病毒转导过程中用于防止病毒颗粒与细胞膜之间的静电排斥。由于聚溴烯带正电，它与带负电的病毒糖蛋白相互作用，中和其电荷。此外，聚氨基苯还能与细胞培养基中的糖胺聚糖结合，防止其与病毒的相互作用。因此，聚苯大大提升了转导效率。
4. 将6孔培养基取出，将病毒/培养基/聚苯甲烯混合物加入每个孔中。将带有转导混合物的细胞放入含有32 ^°C加湿气氛、5%_CO2 的培养箱中，浸泡16–18小时。
   注意：在慢病毒转导期间，将细胞在32°C夜间孵育是一种常见但非必需的做法，显著提升病毒感染的效能。降低温度会减缓细胞新陈代谢，从而降低细胞防御，增加对病毒感染的易感性。
5. 第3天，用新鲜培养基替换病毒转导细胞培养基，并将其移至37°C的培养箱。孵化48小时。
   注意：这两天足够细胞产生RNF146（100–182）-EGFP转基因，并对霉素产生耐药。
6. 为了开发表达RNF146（100–182）-EGFP转基因的多克隆稳定细胞系，下一步在2.5步指示的孵育2天后开始选择hygromycin。
   1. 或者，在无菌霉素的情况下扩大转导细胞群，并在接下来的10–14天内用于PAR分析（瞬时转导），^如前所述1.
7. 细胞在菌素存在下生长后，将细胞转移到100毫米的板上，并根据需要膨胀。
8. 准备转导细胞的冷冻储备以备未来使用。
9. 通过共聚焦显微镜验证RNF146（100–182）-EGFP转基因的表达，详见第3节所述。RNF146（100–182）-EGFP转基因将在细胞内表达。
10. 通过免疫印迹验证RNF146（100–182）-EGFP转基因的表达，如^{其他文献所述1,37}。

3. 共焦显微镜与分析

注意：本节详细说明了覆盖片的制备、LivePAR表达细胞的播种、暴露于处理方法（tBuOOH、MNNG、PARGi、PARPi和/或NRH），以及在显微镜载玻片上制备固定细胞以进行共軛焦成像和PAR焦点分析（见图1C）。它还描述了ImageJ软件和自定义宏用于半自动量化PAR焦点的方法。该方案可用于研究多种因素（如小分子、BER蛋白敲除）对DNA损伤依赖性PARy化的影响，并已在我们实验室成功应用，^34,37。

1. 套滑准备
   1. 将20×20毫米盖套浸入二乙醚中，置于玻璃容器中，置于排气柜中20分钟。
      注意：使用二乙醚时应使用排气罩，因其易燃性和潜在危险。
   2. 去除二乙醚，并以逐渐降低浓度的乙醇清洗盖片（100%、70%、50%，然后0%（ddH₂O）]。
   3. 去除水，将盖片浸泡在1 N HCl中，轻轻搅拌20分钟。
   4. 去除盐酸，用DDH₂0清洗盖片三次。
   5. 将盖片保存在70%乙醇中，4°C，直到使用。
2. 电池的电镀
   1. 将两张20毫米×20毫米的无菌盖片放在60毫米细胞培养皿中并排放置。准备实验所需的菜肴。在加入装有盖片的容器前，确保所有乙醇都蒸发了。通过在盘子中加入无菌PBS洗涤10至15分钟，去除残留的乙醇;在播种细胞前去除PBS。
   2. 每个细胞培养皿种子20万个表达LivePAR细胞。让细胞在覆盖层上附着24–36小时，调理培养基，开始复制（生长）。
3. PAR焦点的诱导
   1. 将表达LivePAR的细胞暴露于100 μM NRH、10 μM PARGi和10 μM MNNG或40 μM tBuOOH中。此外，为检测PARP1/PARP2依赖性PAR形成，可通过添加10 μM PARPi抑制PARP1/PARP2。将化合物直接加入含有细胞的培养基中，并在培养皿中轻轻旋转培养基以分布化合物。将60毫米的盘子在37°C下孵化60至90分钟。
      注：NRH用于确保细胞内有足够的NAD⁺水平，以实现最佳PARP1/PARP2介导的PARylation 33,46,47。PARGi用于防止PARP1/PARP2合成的PAR链被PARG分解。MNNG或tBuOOH用于诱导DNA碱基修饰以启动BER，从而激活PARP1/PARP2。PARPi用于确认信号（焦点）是否由PARP1/PARP2激活产生。
4. 细胞固定与盖片安装
   1. 去除媒介液，用PBS洗涤。
      注意：用PBS清洗一到两次很重要，因为培养细胞所用的培养基含有高浓度的血清蛋白。用PBS洗涤还能去除介质中残留的MNNG或tBuOOH。
   2. 在室温下，将4%甲醛浸泡在PBS中，浸泡15分钟。用PBS洗细胞3次。
   3. 通过向细胞中加入3毫升冷（-20 ^°C）甲醇（丙酮，7：3）定型。将盘子放在-20 ^°C下9分钟。
   4. 去除甲醇：丙酮。用PBS洗3次。
   5. 移液器在玻璃载玻片上放置15微升含DAPI的抗衰变介质。轻轻地将盖套装在装载介质的位置，使细胞朝内，减少气泡。
   6. 通过在盖片两侧涂抹少量透明指甲釉，将封面套片的两侧置中、固定并密封。将玻片放在黑暗中，让顶油指甲釉质干燥（~10分钟）。将幻灯片在4°C的黑暗中保存，直到准备成像。
5. 成像细胞
   1. 使用共焦显微镜拍摄所有切片至少10倍，放大倍率为63×。使用488纳米激光检测PAR焦点，使用405纳米激光检测核染色（DAPI）（例如，见 图2）。
6. 共焦图像分析
   1. 创建一个包含以下文本的文本文件，并将其命名为“LivePAR_Macro”。该宏观促进了LivePAR表达细胞核中PAR焦点的“自动”定量：
      宏“DAPI正染色[1]” {
      tit=getTitle（）;
      run（“重复...”，“title=DAPI复制”）;
      selectWindow（“DAPI”）
      run（“8-bit”）;
      run（“分频道”）
      selectWindow（“C2-”+“DAPI”）;
      close（）;
      selectWindow（“C1-”+“DAPI”）;
      run（“高斯模糊......”、“Sigma=3”）;
      setAutoThreshold（“默认”）;
      run（“Make Binary”）;
      run（“反转”）
      跑（“填洞”）
      run（“分水岭”）
      run（“分析粒子...”，“尺寸=50.00-无限，循环度=0.00-1.00 show=轮廓添加，排除，包含in_situ”）;
      改名（“DAPI_”+tit）;
      selectWindow（“DAPI_”+tit）;
      close（）;
      }
      宏“PAR [2]” {
      setBatchMode（true）;
      run（“8-bit”）;
      t=getTitle（）;
      run（“复制...”，“title=GB1 duplicate”）;
      run（“复制...”，“title=GB20重复”）;
      selectWindow（“GB20”）
      run（“高斯模糊......”，“半径=20堆栈”）;
      selectWindow（“GB1”）;
      run（“高斯模糊......”，“半径=1堆栈”）;
      imageCalculator（“减去创建栈”、“GB1”、“GB20”）;
      selectWindow（“GB1”）;
      close（）;
      selectWindow（“GB20”）;
      close（）;
      selectWindow（“GB1 的结果”）;
      rename（“Blank_GB1-GB20_”+t）;
      title = getTitle（）;
      run（“分频道”）
      selectWindow（“C1-”+title）;
      close（）;
      selectWindow（“C2-”+title）;
      setThreshold（90,255） //90 值可以根据实验变异性进行调整
      run（“分析粒子...”，“大小=0.00-200 循环度=0.00-1.00 show=掩模总结”）;
      接近（“C2-”+标题）;
      selectWindow（“C2-”掩码+title）;
      接近（）;
      setBatchMode（false）;
      }
   2. 下载并安装ImageJ到电脑上（https://imagej.net/ij/download.html）。
   3. 打开 ImageJ 并通过点击插件 | 安装宏（文本文件：LivePAR_Macro） 宏量营养素 |安装。
   4. 打开ImageJ中的所有共焦点文件，并保存为*.tif文件以保留原始文件。
   5. 打开一个电子表格文档，保存为[日期]_[细胞行]_Foci分析。
   6. 一次分析一个*.tif个文件。按 1 查找原子核;当窗口打开名为 ROI Manager 的窗口时，选择窗口中的所有条目，并按 添加 键将核区域覆盖在原始图像上。删除错误识别的核。使用 自由手绘工具 绘制原子核，按 2 以量化PAR焦点。
      注意：不要包含不完全在参考系内的原子核。
   7. 在 ROI管理器 中逐个选择每个核，然后按 2。会出现计数，表示所选核内的焦点数量。一旦文件所有核心的焦点都被评分好，将信息复制粘贴到打开的电子表格文档中。
   8. 重复步骤3.6.6和3.6.7，所有*文件.tif。
   9. 在所选软件中绘制 每个原子核的PAR焦点 （例如，见 图3）。

结果

表达LivePAR探针的细胞可以通过产生编码RNF146（100-182）-EGFP融合蛋白的慢病毒（见图1A）来生成。细胞可以在转导后短暂表达长达两周后评估，或作为在菌素中选择后稳定的细胞系进行评估（见图1B）¹。在基因毒素处理后，DNA损伤引起的PAR焦点可在细胞核内被观察到，固定后通过共聚焦荧光显微镜进行成像（见图1C）。图像显示车辆控制细胞内的全细胞EGFP染色（见图2，顶部）。然而，基因毒素处理的细胞显示核灶细胞细胞核灶的积累，代表RNF146（100-182）-EGFP与PAR结合的定位（见图2，底部）。PARP1/PARP2依赖性也通过PARP1/...

讨论

LivePAR检测法旨在检测PARP1/PARP2活跃合成PAR链的核基因组DNA损伤位点。为此，编码WWE结构域（氨基酸100–182）的RNF146片段被融合到EGFP 1,2,3,37。我们描述的其他PAR探针编码EGFP，融合于DTX4的氨基酸残基1至166、PARP11的氨基酸残基22至112，以及DTX2的氨基酸1至178，每个探针编码扩展的WWE结构域³⁷，识别PAR的iso-ADP-核糖基团。此外，我们最近描述了一种类似的PAR探针，其中EGFP融合到Af1521³⁷的工程巨结构域，后者最初由Nowak等人开发为与IgG2a的Fc结构域融合蛋白，通过免疫荧光在细胞中检测PARylation效果显著增强，相较...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂、化学品和肽
0.45 和微型;m Durapore steriflip 过滤器	西格玛-奥尔德里奇	猫#SE1M003M00
20 x 20毫米显微镜盖套	赛莫飞世尔科学	猫号#22-170-371
乙酮	赛莫飞世尔科学	猫#A18-1
细胞培养皿，100毫米	VWR	猫#25382-166
细胞培养皿，60毫米	费舍尔科学	猫# 430166
细胞培养板，6孔	VWR	猫号#62406-161
冷冻瓶，2毫升	VWR	猫号#89499-722
二乙醚	赛莫飞世尔科学	猫#60-29-7
二甲基亚砾	赛莫飞世尔科学	编号#BP231-1
一次性无菌滤芯，0.45和微型;m	西格玛-奥尔德里奇	猫#SE1M003M00
DMEM	科宁	目录# 15-017-CV
乙醇，200 proof。	Decon实验室	猫#2701
玻璃显微镜载玻片	赛莫飞世尔科学	猫#12-544-4
热灭活胎牛血清	亚特兰大生物制品	猫号#S11150
盐酸	赛莫飞世尔科学	猫#A144-212
湿霉素	赛莫飞世尔科学	猫# 10687010
大号金氏湿巾	金伯利-克拉克	猫号#34256
Lenti-X GoStix Plus 套件	宝	目录#631280
甲醇	赛莫飞世尔科学	编号#A452SK-4
MNNG	莫尔波特	猫# N493990
NRH（1-[（2R，3R，4S，5R）-3,4-二羟基-5-（羟甲基）四氢呋喃-2-基]-4H-吡啶-3-羧酰胺）	玛丽·米戈，或称;核化学科学公司
PARG抑制剂（PDD00017273）	西格玛-奥尔德里奇	猫# SML1781
PARPi抑制剂（Veliparib，ABT-888）	MedChemExpress	编号# HY-10129
青霉素/链霉素	吉布科	目录#15140-122
聚布林	西格玛-奥尔德里奇	编号# TR-1003-G
不	赛莫飞世尔科学	猫#180345000
TransIT-x2（转染试剂）	米鲁斯	编号# MIR-6006
特里顿-X100	VWR	猫#0694
胰蛋白酶-EDTA	赛莫飞世尔科学	猫号#25200-056
Vectashield（H-1000）防衰落安装介质	赛莫飞世尔科学	猫# NC1695563
<强>细胞系
293-FT	赛莫飞世尔科学	猫号#R70007
（来源于人类胚胎肾细胞，转化为SV40大T抗原）	赛莫飞世尔科学	猫号#R70007
LN428	慷慨赠礼	无
（人类胶质母细胞瘤肿瘤细胞系）	伊恩·波拉克博士（匹兹堡大学）	无
RPE-1	空军交通管制委员会	编号# CRL-4000
（人类hTERT不朽化视网膜色素上皮细胞）	空军交通管制委员会	编号# CRL-4000
U2OS	空军交通管制委员会	Cat# HTB-96
（人类骨肉瘤细胞系）	空军交通管制委员会	Cat# HTB-96
重组DNA
pMDLg/pRRE	实验室库存#253	Addgene，Cat#12251
pRSV-Rev	实验室库存#254	Addgene，目录#12253
pMD2.G	实验室库存#252	Addgene，编号#12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro （LivePAR是RNF146的WWE结构域，氨基酸残基100-182，融合于EGFP;含有Hygromycin抗性磁带）	实验室库存#1727	Addgene，Cat# 176063
<强>软件与算法
Adobe Illustrator（用于准备图表）	Adobe 系统	2024年版本
GraphPad 棱镜	GraphPad	版本 10.5.0 （Mac OS X）
图片J	美国国立卫生研究院	https://imagej.net/ij/download.html