本文介绍一种用于固定哺乳动物细胞中聚（ADP-核糖）（PAR）富集灶的细胞水平可视化、亚细胞定位及定量分析的方法。该检测方法可对暴露于基因毒素的细胞核内由DNA损伤诱导的PARP激活位点进行定量分析，包括与碱基切除修复或单链断裂修复相关的激活位点。
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本文内容
摘要
摘要
聚ADP-核糖（PAR）是由ADP-核糖聚合酶家族中的四种成员——PARP1、PARP2、PARP5a和PARP5b——合成的ADP-核糖聚合物。然而，只有PARP1和PARP2能够在DNA断裂时合成PAR。PAR被定义为一种蛋白质翻译后修饰，但也被证实可作为DNA或RNA的修饰形式存在。PAR的水平进一步受到PARG（PAR糖水解酶）的调控，PARG与PARP1和PARP2共同调节由DNA损伤诱导的细胞内PAR水平。PAR的动态合成与降解对其在DNA修复和DNA损伤应答中的调控作用至关重要，进而影响染色质重组、复制、转录以及细胞死亡过程。PARP1/PARP2的激活及PAR的积累可被视为正在进行碱基切除修复（BER）或DNA单链断裂修复（SSBR）的位点；然而，许多PARP1/PARP2激活因素也与复制应激及其他DNA代谢过程相关。一旦形成，PAR链可通过DNA修复因子和DNA损伤应答（DDR）因子所含有的PAR结合结构域（PBDs）将其募集至DNA损伤或基因组损伤位点。目前已发现十种不同的PBDs可识别PAR分子的不同区域，包括PAR结合基序、PAR结合型锌指结构、WWE结构域以及macrodomain等其他PBDs。为了便于对细胞内PAR动态进行分析，我们采用与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合的PBDs，优化了基于细胞的PAR焦点定量方法。本文描述了一种检测方法，该方法利用编码PBD/WWE结构域的RNF146片段与EGFP连接，以可视化并定量基因组损伤位点以及正在进行的BER或SSBR过程中PAR的积累情况。我们详细阐述了实验步骤，包括慢病毒颗粒的制备、靶细胞系的转导、诱导哺乳动物细胞基因组DNA损伤的处理、共聚焦荧光显微图像的采集，以及数据的半自动化定量分析。
引言
本方案描述了LivePAR检测法，该方法可用于在哺乳动物细胞中可视化并定量分析基因组损伤位点处的多聚（ADP-核糖）（PAR），这些位点主要与碱基切除修复（BER）或单链断裂修复（SSBR）相关1,2,3。BER是一种关键的DNA修复通路，负责清除DNA中受损或被修饰的碱基（有关BER和PAR化修饰的综述，参见4,5,6,7）。BER起始于DNA糖基化酶，这类酶识别并切除被修饰的碱基4，留下一个无嘌呤/无嘧啶（AP）位点，例如甲基嘌呤糖基化酶（MPG）可切除甲基化碱基8,9，或8-氧代鸟嘌呤糖基化酶（OGG1）可切除8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）9,10。随后，AP位点被AP内切酶1（APE1）切割
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方案
1. 慢病毒生产
注意：本实验方案采用第三代慢病毒包装系统42,43，以生成表达基因编码的 PAR 报告分子的细胞。慢病毒颗粒在 293FT 细胞中通过四质粒系统产生，该系统包含包膜、调控和包装组分，以及编码 EGFP 标记的 RNF146 WWE 结构域的 pLV-EF1A-LivePAR-Hygro 载体，该结构域能够结合多聚（ADP-核糖）链。所获得的病毒可用于建立稳定细胞系，以实现对 PAR 积累的可视化与定量分析。
- 在37 ˚C、5% CO₂的湿润环境中，使用含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养低传代293FT细胞2确保293FT细胞的培养时间不超过3周。
注意：我们常规使用传代次数在3到10代之间的293FT细胞。293FT细胞通过SV40大T抗原转化并获得永生化特性。这些细胞具有较高的转染效率，对于重组蛋白表达和基因表达研究至关重要。它们对脂质体转染和病毒转导均具有良好的响应性。 方法 - 接种 1.7 × 105 第1天将293FT细胞接种至60 mm组织培养皿中，培养基终体积为5.5 mL。将细胞放回培养箱中培养24小时。
- 第2天（转染当天），向一个1.5 mL无菌微量....
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结果
可通过生成编码RNF146(100-182)-EGFP融合蛋白的慢病毒来获得表达LivePAR探针的细胞（图1A）。转导后，可在短期内进行瞬时表达分析，持续观察长达两周，或经潮霉素筛选后建立稳定细胞系进行检测（图1B）1。经基因毒性药物处理后，可在细胞核内观察到DNA损伤诱导产生的PAR焦点，固定后可通过共聚焦荧光显微镜成像（图1C）。图像显示，对照溶剂处理的细胞呈现全细胞范围的EGFP染色（图2，上图）；而经基因毒性药物处理的细胞则显示出核内焦点的聚集，代表RNF146(100-182)-EGFP与PAR结合的定位（图2，下图）。通过在处理前使用PARP1/PARP2抑制剂维利帕尼（Veliparib）预处理，可观察到PAR焦.......
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讨论
LivePAR 检测法旨在检测细胞核基因组 DNA 损伤位点，这些位点处 PARP1/PARP2 正在活跃合成 PAR 链。为实现这一目标，将编码 RNF146 WWE 结构域（氨基酸 100–182）的片段与 EGFP 融合1,2,3,37。我们此前描述的其他 PAR 探针包括：EGFP 与 DTX4 的氨基酸残基 1–166、PARP11 的氨基酸残基 22–112 以及 DTX2 的氨基酸残基 1–178 的融合蛋白，这些均编码一个扩展的 WWE 结构域37，可识别 PAR 中的异-ADP-核糖基团。此外，我们近期还报道了一种类似的 PAR 探针，其中 EGFP 与来自 Af1521 的工程化大结构域（macrodomain）融合37，后者最初由 Nowak 等人开发，作为与 IgG.......
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披露
R.W.S. 是 Canal House Biosciences, LLC 的联合创始人，担任科学顾问委员会成员并持有该公司股权，但该公司未参与本研究，相关咨询工作也与本研究无关。作者声明不存在利益冲突。
致谢
特别感谢南阿拉巴马大学的Marie Migaud多年来在NRH供应方面的持续支持以及她提供的专业建议。Sobol实验室在DNA修复、DNA损伤分析以及基因毒性暴露影响方面的研究 & 复制应激研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）[ES029518、ES028949、CA238061、CA236911、AG069740 和 ES032522] 及美国国家科学基金会（NSF）[NSF-1841811] 的资助。R.W.S. 还获得了 Legoretta 癌症中心捐赠基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂、化学品和多肽 | |||
| 0.45 µm Durapore 无菌滤器 | Sigma-Aldrich | Cat# SE1M003M00 | |
| 20 x 20 mm 显微镜盖玻片 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 22-170-371 | |
| 丙酮 | Thermo Fisher Scientific | Cat# A18-1 | |
| 细胞培养皿，100 mm | VWR | Cat# 25382-166 | |
| 细胞培养皿，60 mm | Fisher Scientific | Cat# 430166 | |
| 细胞培养板，6 孔 | VWR | Cat# 62406-161 | |
| 冻存管，2 mL | VWR | Cat# 89499-722 | |
| 乙醚 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 60-29-7 | |
| 二甲基亚砜 | Thermo Fisher Scientific | Cat# BP231-1 | |
| 一次性无菌滤器，0.45 µm | Sigma-Aldrich | Cat# SE1M003M00 | |
| DMEM | Corning | Cat# 15-017-CV | |
| 乙醇，200 证明 | Decon Labs | Cat# 2701 | |
| 玻璃显微镜载玻片 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 12-544-4 | |
| 热灭活胎牛血清 | Atlanta Biologics | Cat# S11150 | |
| 盐酸 | Thermo Fisher Scientific | Cat# A144-212 | |
| 潮霉素 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10687010 | |
| 大号 Kim Wipes 擦拭纸 | Kimberly-Clark | Cat# 34256 | |
| Lenti-X GoStix Plus 试剂盒 | Takara | Cat# 631280 | |
| 甲醇 | Thermo Fisher Scientific | Cat# A452SK-4 | |
| MNNG | Molport | Cat# N493990 | |
| NRH（1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-4H-吡啶-3-甲酰胺） | Marie Migaud 或 NuChem Sciences Inc | ||
| PARG 抑制剂（PDD00017273） | Sigma-Aldrich | Cat# SML1781 | |
| PARPi 抑制剂（Veliparib, ABT-888） | MedChemExpress | Cat# HY-10129 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | Cat# TR-1003-G | |
| tBuOOH | Thermo Fisher Scientific | Cat# 180345000 | |
| TransIT-x2（转染试剂） | Mirus | Cat# MIR-6006 | |
| Triton-X100 | VWR | Cat# 0694 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25200-056 | |
| Vectashield（H-1000）抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | Cat# NC1695563 | |
| 细胞系 | |||
| 293-FT | Thermo Fisher Scientific | Cat# R70007 | |
| （源自经 SV40 大 T 抗原转化的人胚胎肾细胞） | Thermo Fisher Scientific | Cat# R70007 | |
| LN428 | 由 | N/A | |
| （人胶质母细胞瘤肿瘤细胞系） | Dr. Ian Pollack（匹兹堡大学）惠赠 | N/A | |
| RPE-1 | ATCC | Cat# CRL-4000 | |
| （人端粒酶逆转录酶永生化视网膜色素上皮细胞） | ATCC | Cat# CRL-4000 | |
| U2OS | ATCC | Cat# HTB-96 | |
| （人骨肉瘤细胞系） | ATCC | Cat# HTB-96 | |
| 重组 DNA | |||
| pMDLg/pRRE | 实验室库存编号 253 | Addgene, Cat# 12251 | |
| pRSV-Rev | 实验室库存编号 254 | Addgene, Cat# 12253 | |
| pMD2.G | 实验室库存编号 252 | Addgene, Cat# 12259 | |
| pLV-EF1A-LivePAR-Hygro （LivePAR 为 RNF146 的 WWE 结构域，氨基酸残基 100-182，与 EGFP 融合；含有潮霉素抗性盒） | 实验室库存编号 1727 | Addgene, Cat# 176063 | |
| 软件与算法 | |||
| Adobe Illustrator（用于图表制作） | Adobe Systems | 版本 2024 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | 版本 10.5.0 (Mac OS X) | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.net/ij/download.html |
参考文献
- Koczor, C. A., et al. Quantitative analysis of nuclear poly(ADP-ribose) dynamics in response to laser-induced DNA damage. Methods Mol Biol. 2609, 43-59 (2023).
- Koczor, C. A., et al.
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重印与许可
