艾 梅里亚 寄生虫中随机转基因整合与表达的验证

摘要

本文提出一种标准化方法，用于验证转基因 Eimeria 寄生虫中外源基因的整合与表达。通过整合基因组和蛋白质层面分析，该工作流程确认了基因插入和表达的稳定。这种方法促进了转基因 艾梅里亚 的研发，用于研究和疫苗应用。

摘要

验证转基因 艾梅里亚 寄生虫对于确认外源基因的稳定基因组整合和表达至关重要。该方案描述了用于验证 Eimeria tenella转基因插入和蛋白质表达的综合工作流程。该程序从孢子化卵囊中提取基因组DNA开始，随后进行PCR扩增以初步验证目标片段的存在。为进一步确认基因组整合，进行了全基因组重测序以识别插入位点并评估寄生虫基因组中整合构念的稳定性。随后通过西方印迹法检测从纯化孢子体制备的裂解液，从而检测目标重组蛋白。此外，通过间接免疫荧光测定（IFA）利用感染宿主细胞进行细胞内定位。这些检测方法共同提供了一个稳健且可重复的框架，用于验证转基因 Eimeria 系。该工作流程能够可靠地确认基因组整合和蛋白质表达，从而支持其在遗传操作、功能基因组学和针对 艾梅里亚 寄生虫的疫苗开发等后续应用。

引言

球虫病由艾梅里属引起，是家禽中经济上最重要的寄生虫病之一，导致体重增加减少、饲料转化不良，以及每年估计全球数十亿美元的经济损失 ^1,2,3。对艾梅里亚寄生虫的基因操作已成为基础研究和^{疫苗开发的}强大工具 ^4,5,6。稳定转染实现了外源基因的整合和表达，如荧光报告蛋白或保护抗原，实现寄生虫发育的实时可视化和疫苗候选物^7,8,9的靶向评估。

段等人之前发表的一篇论文提供了转基因 艾梅里亚细胞核接和体内繁殖的标准化方案，建立了高效生成和富集重组寄生虫系^的方法10。然而，目前尚无统一的工作流程用于确认转基因的稳定基因组整合和功能表达。此类验证对于确保用于下游生物学研究或疫苗应用的转基因系的真实性、稳定性和可重复性至关重要。

本文提出了一个完整的分步骤方案，用于验证Eimeria tenella中转基因整合和表达，使用表达传染性滑囊病病毒（IBDV）VP2抗原（Et-VP2）作为模型¹¹的转基因E. tenella系。表达质粒p5′AMic2linkerVP2m3′A携带VP2基因和mCherry报告器，被转染到野生E. tenella孢子体（Et-WT）中。红色荧光卵囊通过荧光激活细胞分选（FACS）分离，并在无球虫鸡中连续传递。该工作流程展示了基因组DNA提取、基于PCR的初步整合分析、全基因组重测序以识别插入位点、西方墨迹法验证蛋白质表达，以及间接免疫荧光分析（IFA）以可视化重组蛋白的细胞内定位等程序。这些方法共同提供了可重复且全面的框架，用于确认转基因艾梅里亚系的真实性，使其能够可靠地应用于功能基因组学研究和疫苗开发。

方案

所有涉及鸡的动物实验均获得中国农业大学机构动物护理与使用委员会批准（批准号：CAU20160628-2）。所有饲养和实验均遵循中国农业大学机构动物护理与使用委员会的指导方针，并遵循《涉及动物的国际生物医学研究指导原则》。本研究使用了七天龄的雄性无病原体（SPF）白来亨鸡。在试验期间，这些鸟只在标准饲养条件下饲养，并自由获得饲料和饮水。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 从 Eimeria spp.的孢子化卵囊中提取基因组DNA

1. 将1毫升卵囊悬浮液（≥1 ×^{10 7}/mL）转移到1.5 mL微离心管中。加入等量的1毫米玻璃珠，对应卵囊颗粒。使用组织均质剂以60赫兹剧烈敲击5分钟，直到卵囊壁完全破裂，释放内容物，从而破坏卵囊。
2. 将混合物（不含玻璃珠）收集到新管子中，以12,000 x g 离心1分钟。丢弃上清液，加入500微升CTAB缓冲液和40微升蛋白酶K，并在60°C下培养30分钟。
3. 加入500微升酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），涡旋10秒，离心机温度为12,000 x g ，离心5分钟。将上层水相转移到新的管子中。
   注意：密封并丢弃含有有机层的管子，以防止环境污染。（可选）如果蛋白质污染依然很高，则重复步骤1.3 1–2次。
4. 加入500微升氯仿：异戊醇（24：1），涡旋10秒，离心机在12,000 x g 下离心5分钟。将水相转移到新管子中，加入等量异丙醇。通过倒置混合，直到DNA沉淀出现。
   注意：−20°C降水持续≥1小时或夜间，可提升产量。
5. 在12,000 x g 离心机下离心10分钟，沉淀DNA。用70%乙醇清洗沉淀，以12,000 x g 离心5分钟，然后丢弃上清液。用真空泵小心去除残留液体，并在室温或37°C下自然风干沉淀。
6. 将干燥的DNA沉淀溶解在含有RNase的_ddH-2-O或TE缓冲液中。在37°C下孵育≥1小时，或在4°C过夜以去除残留RNA。将纯化后的DNA储存在−20°C。
   注意：为了长期保存，未溶解的DNA沉淀可以直接储存在−20°C或−80°C。 在下游应用前，通过琼脂糖凝胶电泳评估DNA的完整性和浓度。

2. PCR验证寄生虫基因组中Et-VP2构造体的存在

1. 设计引物对（见表1）以验证Et-VP2构造体的基因组整合性。
   注：引子序列采用引子-BLAST设计，典型参数为引子长度为18–24碱基对，熔点约为55–60°C，二级结构形成极少。进一步对每个引物对的特异性与 Eimeria tenella 基因组进行比对，以避免非特异性扩增。
2. 制备一个50微升的反应混合物，含25微升2×Taq主混合液、21微升ddH₂O、各1微升正向和反向引物，以及2微升DNA模板。
3. 使用以下热循环条件进行放大：在95°C下初始变性5分钟;30个周期，分别是95°C持续30秒，55°C持续30秒，72°C持续1分钟;随后在72°C下进行最后一次延长，持续10分钟。
   注意：确保所有试剂在热循环前充分混合。使用新鲜制备的DNA模板以实现最佳扩增效率。

3. 转基因寄生虫系（Et-VP2）的重新测序

1. 样本提交与库构建
   1. 将1毫升卵囊悬浮液（≥1 ×^{10 7}/mL）提交给商业测序服务提供商进行次世代测序分析。
   2. 在基因组DNA质量评估后，利用超声机械破坏对DNA进行切割。纯化碎片DNA，进行末端修复，向3′末端添加腺嘌呤（A）碱基，并连接测序适配器。
   3. 通过琼脂糖凝胶电泳选择所需大小的DNA片段，并进行PCR扩增以构建测序文库。
   4. 对建成的图书馆进行质量检查。在Illumina NovaSeq平台上使用150碱基对的读长进行成对端测序。保持测序深度为100×以确保数据准确性，生成至少6 GB原始数据，最低质量评分为Q20 >90%。
      注意：所有试剂和DNA样本均使用无菌技术处理，以防止污染。在进行数据分析前，请核实测序参数是否符合所需的深度和质量指标。
2. 数据分析
   1. 使用Fastp软件（v0.23.2）根据以下标准过滤原始测序数据，¹²：
      1. 移除适配器序列。
      2. 将低质量阈值设为Q20，并移除低质量碱基占总读长30%以上的读取序列。
      3. 去除低于50碱基基的读段。
   2. 使用Bowtie2软件（v2.4.5）将质量控制的读段比对至 E. tenella 参考基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1）¹³。下一代测序数据的随机性基于覆盖深度和均匀性进行评估。
   3. 确保测序读段与转基因载体序列对齐。去除那些不映射T-DNA区域的读段，获得嵌合读段，其中一端映射T-DNA，另一端映射E . tenella 参考基因组。
   4. 基于嵌合读序列，使用ToxoDB（64版）进行比对，确定潜在T-DNA插入位点的具体位置。使用Mosdepth软件（v0.3.3^）分析载体与艾梅里亚基因组之间同源区域（即5′和3′调控区）的测序深度。
   5. 识别转基因质粒在 E. tenella 基因组中的潜在整合位点，并通过步骤2.1中描述的反应系统通过PCR进行验证。
      注意：确保在整个分析过程中一致使用软件版本和参数设置，以保持数据的准确性和可重复性。

4. 转基因 Eimeria 蛋白的西方墨迹法

1. 收集含有至少5×10个⁶ 孢子体的PBS悬浮液，置于1.5毫升离心管中，离心机温度为2500 x g ，持续5分钟。将沉淀重新悬浮于100微升RIPA裂解缓冲液中，并在冰上培养1小时。加入20微升6×蛋白质加载缓冲液，并在100°C下加热混合物10分钟。
2. 使用1.5毫米玻璃板制备SDS-PAGE凝胶。根据目标蛋白的分子量调整丙烯酰胺浓度。聚合过程中，先用蒸馏水覆盖分离胶，确保表面均匀，然后再加入堆积胶。
3. 将裂解液以10,000 x g 离心5分钟，并向每个样品通道装注40微升上清液。将10微升蛋白质标记加载到独立通道，剩余通道则用40微升1×加载缓冲液作为对照。
4. 在1×运行缓冲液中以70伏电泳20分钟，随后120伏冲动60–90分钟，直到染料前端到达凝胶底部。
5. 根据预期的蛋白质大小切除凝胶。在甲醇中预激活PVDF膜1分钟，然后按以下顺序组装转移夹层：海绵、滤纸、凝胶（阴极侧）、PVDF膜、滤纸、海绵。去除所有气泡，并在转移缓冲液中以70伏电压转移蛋白3小时。
6. 用PBST清洗膜三次（每次5分钟），并用5%脱脂牛奶在室温下定型1小时，或在4°C下过夜。 用PBST清洗膜两遍以去除残留的阻隔液。
7. 将膜与稀释于抗体缓冲液中的原级抗体一起孵育：小鼠多克隆抗Flag抗体（1：2000）和小鼠单克隆抗GAPDH（1：2000）。在室温下孵育1小时，或在4°C下过夜并轻轻摇晃。收集抗体溶液，用PBST清洗膜五次（每次5分钟）。
8. 在室温下与HRP结合的山羊抗小鼠IgG（1：2000）培养该膜1小时。用PBST清洗膜五次（每次5分钟）。
9. 通过混合等量溶液A和溶液B来制备ECL底物。将底物均匀地贴在膜上，并利用化学发光成像系统检测蛋白质信号。
   注意：除非另有说明，所有涉及蛋白质样本的步骤均需在冰上进行。在排风柜内处理甲醇和ECL基底时，佩戴手套和防护眼镜。

5. 转基因Eimeria的细胞内间接免疫荧光测定（IFA）

1. 利用色谱柱纯化孢子体
   1. 将色谱柱连接到蠕动泵，并将流量调整为50–60 Hz。用蒸馏水和甘氨酸溶液清洗色谱柱。
   2. 在连续添加甘氨酸溶液的同时，向柱中加入DE-52纤维素悬浮液，直到纤维素床达到约1厘米高。
   3. 将通过Percoll法纯化的孢子体装入柱子。使用甘氨酸溶液保持30–40赫兹的流量，并在50毫升离心管中收集流水。
   4. 通过将洗脱液滴落在玻璃载玻片上进行显微观察来监测洗脱液。当没有孢子体检测到时，停止泵。将收集的分馏液以2500 x g 离心5分钟，丢弃上清液，再将沉淀液重新置于PBS中。
      注意：所有步骤均在无菌条件下进行，以防止微生物污染。根据机构生物安全法规处理甘氨酸和Percoll废弃物。
2. 孢子体感染HFF细胞
   1. 将1个孢子子体×10个6个孢子子体种子，种子为24孔板，含有HFF细胞单层。将青霉素-链霉素加入最终浓度1×（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素），轻柔混合，并在37°C下培养4–6小时以供浸润。取出培养基，用1毫升PBS洗涤一次，然后丢弃上清液。
   2. 用无菌产钳小心取下玻璃盖片，转移到新的24孔板上。将样品固定在1毫升4%对甲醛中30分钟，用1毫升PBS洗涤一次，丢弃上清液。
   3. 用1毫升0.25%的Triton X-100渗透细胞，浸泡30分钟。用1毫升PBS洗涤一次，丢弃上清液。
   4. 用1毫升3%BSA封闭样品30分钟。用1毫升PBS洗涤一次，丢弃上清液。
   5. 稀释小鼠单克隆抗Flag抗体（1：200），3% BSA。将稀释抗体滴在密封膜上，并将盖片（细胞面朝下）倒置在滴液上。将盖层浸置在37°C加湿的室内孵育1小时。用1毫升PBS洗三次（每次5分钟）。
   6. 稀释FITC结合的山羊抗小鼠IgG（1：200）和Hoechst 33258（1：100），3%BSA。将染色混合物滴在密封膜上，并将封套倒置在滴剂上。在37°C加湿舱中孵育1小时，然后用1毫升PBS洗涤五次（每次5分钟）。
   7. 通过在玻璃滑片上放置5微升防褪入装介质来安装盖片。将盖片（细胞面朝下）倒置在滴落物上，避免气泡，并密封边缘。将安装好的载玻片存放在4°C的加湿室中，直到成像结果。
      注意：在化学排气罩内使用对甲醛和Triton X-100时，请佩戴手套和护目镜。该程序中使用的试剂配方列于 表2。

结果

基因组PCR分析确认转基因寄生虫中存在目标片段，而野生型对照组未检测到相应的带状物（见图1A）。全基因组重测序进一步证明线性质粒稳定地整合进寄生虫基因组，预测整合位点通过交叉区的PCR扩增得到验证（见图1B）。

蛋白质表达通过Western印迹法验证，显示出一条对应转基因菌株融合蛋白预期分子量的显著条带。野生型对照组未观察到信号（见图2）。

间接免疫荧光测定进一步揭示了表达该转基因的孢子体细胞内信号，确认其表达和定位，而对照组则保持阴性（见图3）。

这些发现表明，目标构造存在于寄生虫基因组中，且编码的蛋白质在转基因 E. tenella中在细胞层面上表...

讨论

该方案建立了全面的工作流程，用于验证转基因E . tenella中外源基因的基因组整合、蛋白质表达及细胞内定位。该方法不依赖单一检测，而是结合基因组和蛋白质层面证据，确保转基因插入既在结构上得到确认，又在功能上表达。

该方案中的若干关键步骤对转基因系的成功验证有着重要影响。如果这些步骤没有被仔细优化，可能会出现技术问题。从纯化寄生虫材料中提取的高质量基因组DNA对于可靠的PCR扩增和后续测序分析至关重要。卵囊破坏不足或宿主细胞物质污染会降低DNA质量，导致DNA产量低和PCR扩增弱或不一致。这些问题可以通过延长均质时间或增加击珠强度来缓解。准确识别整合位点还需要足够的测序深度和可靠的参考基因组比对。在蛋白质层面，西方墨迹检测的灵敏度依赖于高效的蛋白质提取和用于靶点识别抗体的特异性。当蛋白质表达水平较低或提取效率有限时，可能出现弱目标-蛋白质信号。通过增加寄生虫裂解液量或优化裂解条件，通常可以提升信号强度。此外，适当的固定、渗透和抗体培养条件对于获得清晰的免疫荧光染色和准确的亚细胞定位至关重要。IF...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗褪色安装介质	MCE	HYK1042	防止光漂白的荧光安装介质
BSA (3%)	贝云时	ST023	IFA的封闭缓冲液和抗体稀释液；室温下封闭30分钟
氯仿:异戊醇 (24:1)	Sigma	C0549	基因组DNA提取过程中去除残留苯酚的试剂
无球虫鸡	伯林格-英格尔海姆	SPF	用于转基因株的体内传代和扩增；伦理委员会批准（批准号：CAU20160628-2）
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）	默克KGaA	H5882	基因组DNA提取缓冲液的组分；配方：3 g CTAB + 12.27 g NaCl + 15 mL 1 mol/L Tris-HCl + 6 mL 0.5 mol/L EDTA，最终体积用ddH2O调节至150 mL
DE-52纤维素	索乐宝	C8350	孢子体纯化的离子交换层析介质；先用NaOH、HCl和蒸馏水处理，再用甘氨酸溶液平衡
ECL底物（溶液A + 溶液B）	thermofisher	32106	化学发光检测试剂；使用前将溶液A和B等体积混合
FITC标记的山羊抗小鼠IgG	Sigma	AP124F	IFA的荧光二抗，稀释比例1:200
玻璃珠	Sigma	Z250473-1PAK
甘氨酸溶液	Sigma	67419	用于层析柱的平衡和洗脱缓冲液；配方：0.75 g甘氨酸 + 7.9 g NaCl溶于500 mL蒸馏水中，pH调至7.4-7.6，高压灭菌
Hoechst 33258	Sigma	94403	核染色试剂，稀释比例1:100；用于IFA定位
HRP标记的山羊抗小鼠IgG	Sigma	12-349	蛋白质印迹的二抗，稀释比例1:2000
Illumina NovaSeq测序平台	Personalbio生物科技有限公司（上海，中国）		下一代测序平台；配对末端测序（150 bp读取长度），测序深度100×，产生≥6 GB原始数据（Q20>90%）
低速离心机	北京贝尔力离心机	DT5-2
小鼠单克隆抗Flag抗体	Sigma	F1804	一抗，稀释比例1:200；用于IFA检测Flag标记的融合蛋白
小鼠单克隆抗GAPDH抗体	Sigma	G8795	一抗，稀释比例1:2000；用作蛋白质印迹的装载对照
脱脂奶粉（5%）	贝云时	P0216	蛋白质印迹的封闭缓冲液；室温下封闭1小时或4°C过夜
甲醛（4%）	默克KGaA	30525	细胞固定液；室温下固定30分钟
PBS	索乐宝	P1010
青霉素-链霉素（100×）	Yeasen	60162ES76	细胞培养抗生素；抑制微生物污染
Percoll（DG梯度库存	GE Healthcare	17-0891-09
苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）	默克KGaA	77617	基因组DNA提取过程中蛋白质去除的试剂
蛋白质装载缓冲液（6×）	贝云时	P0015F	蛋白质电泳装载缓冲液；配方：100 mM Tris（pH 6.8），4% SDS，2 mM EDTA，2%甘油，6 M尿素；使用前与50 μL 2 M DTT和50 μL 5%溴酚蓝混合
蛋白酶K	默克KGaA	39450-01-6	200 mg溶于10 mL ddH2O，用于基因组DNA提取过程中的蛋白质消化
PVDF膜	thermofisher	88518	蛋白质转移膜；使用前用甲醇激活1分钟
RIPA裂解液	Yeasen	20101	孢子体蛋白提取的裂解液
RNase A	默克KGaA	9001-99-4	25 mg溶于2.5 mL 0.01 mol/L NaAc，100°C加热10-15分钟，用1 mol/L Tris-HCl将pH调至7.4；用于从DNA样品中去除RNA
SDS-PAGE凝胶试剂（丙烯酰胺，丙烯酰胺二聚体，Tris，SDS，APS，TEMED）	Bio	101	SDS-PAGE凝胶制备试剂；丙烯酰胺浓度根据目标蛋白的分子量进行调整
钠皂酸胆酸水合物	Sigma	T0875
溶液）
Taq Master Mix（2×）	Vazyme	P112-01/02/03	含有Taq聚合酶、dNTPs等的PCR扩增预混液
Triton X-100（0.25%）	默克KGaA	9036	细胞渗透溶液；室温下孵育30分钟
胰蛋白酶	索乐宝	T8150
涡流混合器	北