本研究建立了一种高效液相色谱串联三重四极杆质谱法（HPLC-QQQ-MS），用于鉴定和定量分析唐古特山莨菪（Anisodus tanguticus）中的托烷类生物碱（莨菪碱、山莨菪碱、东莨菪碱）。该方法快速、准确且可靠，适用于药用植物的高通量分析。
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本文内容
摘要
摘要
Anisodus tanguticus 是一种重要的藏药植物。其托烷类生物碱（TAs），如莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱，具有显著的镇痛和镇静药理活性，使该物种成为提取这些生物活性成分的重要天然资源。然而，A. tanguticus 的化学成分极为复杂，包含大量结构尚未明确的化合物，因此对其活性成分进行系统的鉴定与结构表征尤为重要。尽管高效液相色谱法（HPLC）已广泛用于该植物提取物的分离，但即使借助光谱数据库比对，许多未知组分仍难以准确鉴定。
本研究建立了一种基于高效液相色谱串联三重四极杆质谱法（HPLC-QQQ-MS）的分析方法，用于测定莨菪烷类生物碱 A. tanguticus该方法包含一系列系统性步骤，包括标准化的样品制备、质谱参数设置、液相色谱预平衡、方法建立、质谱数据采集、多级质谱（MSⁿ）扫描以及人工数据分析。利用该策略，我们成功鉴定出三种具有代表性的托烷类生物碱 A. tanguticus：莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱。此外，该研究验证了所建立的HPLC-QQQ-MS方法的精确性，证实该方法快速、灵敏、可行且准确，适用于托烷类生物碱（TAs）的定量测定 A. tanguticus 已建立的方法具有良好的通用性和可靠性，适用于莨菪烷类生物碱的高通量鉴定与定量分析 A. tanguticus 及其他药用植物。
引言
中药的治疗效果在很大程度上取决于其产生的次生代谢产物，例如生物碱、黄酮类、萜类化合物以及其他活性成分1,2,3。因此，对这些复杂混合物中特定目标代谢物进行精确且灵敏的定性与定量分析，是确保中药质量、阐明其疗效物质基础并推动现代研究的关键步骤3。然而，中药成分的多样性和复杂性，加之许多关键活性成分的浓度极低，为实现高效且准确的检测带来了巨大挑战。
Anisodus tanguticus (Maxim.) Pascher 是莨菪烷类生物碱（TAs）的重要植物来源4，以其富含具有药理活性的莨菪烷型化合物而著称5。其主要特征性生物碱包括山莨菪碱、东莨菪碱和莨菪碱，这些化合物具有共同的莨菪烷母核，但在功能基团取代上存在差异（图1），从而表现出不同的药理学特性6,7,8。尽管其结构相似性给色谱分离带来....
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方案
1. 样品制备
- 标准溶液的制备
- 使用万分之一分析天平，分别精确称取10.0 mg的莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱和氢溴酸山莨菪碱对照品，置于不同的10 mL容量瓶中。
- 加入色谱级甲醇至刻度线，通过超声处理充分溶解，配制成浓度为1.0 mg/mL的单一标准储备液。
- 将储备液转移至棕色试剂瓶中，于4 °C避光保存。
注意：所用生物碱具有高毒性，操作标准品时需采取安全防护措施。所有溶液均在使用前新鲜配制，并于4 °C避光保存，以避免降解。
- 混合工作溶液的制备
- 用移液器吸取上述每种储备液各100 µL，置于10 mL容量瓶中，用色谱级甲醇稀释至刻度线，配制成浓度为10 µg/mL的混合标准中间溶液。
- 根据线性范围要求，用甲醇将中间溶液逐级稀释，得到一系列混合工作溶液。
- 分别取50 µL、200 µL和500 µL，获得浓度为0.5 µg/mL、2 µg/mL、5 µg/mL和10 µg/mL的工作液。使用前新鲜配制。
- 取100 µL浓度为10 µg/mL的中间溶液，置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1 µg/mL的稀释液。
- 再取100 µL浓度为1 µg/mL的溶液，转移至另一个1 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
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结果
HPLC-QQQ-MS 分离与鉴定萜类生物碱
由标准混合物分析获得的典型 MRM 色谱图及一个 A. tanguticus 根提取物被展示于 图3 和 图4在优化的HPLC条件下，三种目标托烷生物碱——莨菪碱（hyoscyamine）、东莨菪碱（anisodamine）和山莨菪碱（scopolamine）均在20分钟内实现有效分离，表明所建立方法具有高效率。山莨菪碱与东莨菪碱之间的分离度（Rs）为8.67，东莨菪碱与莨菪碱之间的分离度达到11.58。所有分离度数值均显著高于基线分离标准（1.5），表明无色谱干扰，证实该方法适用于准确定量分析。所有化合物均呈现尖锐且对称的峰形，显示出优异的色谱性能及极低的基质干扰。每种托烷生物碱（TA）的鉴定均基于两个标准：（1）保留时间与对照标准品一致（±0.1 min以内）；（2）至少存在两个特异性的MRM跃迁（定量离子和定性离子）。
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讨论
随着人们对植物次生代谢物的兴趣日益增长，生物碱检测的分析技术受到了广泛关注。尽管用于分析托烷类生物碱（TAs）的基础色谱体系已经建立18，但近年来的新进展——例如毛细管电泳（CE）的应用、GC–MS 和 HPLC–MS 仪器性能的提升，以及对旋花素（convolvine）和类似托品酮毒素等新型结构化合物的鉴定——凸显了对当前这些生物碱色谱分析方法进行系统综述的必要性11,19,20,21,22。TAs 的分析需求因应用场景而异：在植物组织分析中（如植物育种、生物碱生物合成及提取研究），分析方法必须具备高选择性和高灵敏度，以区分结构相似的次生代谢物并检测痕量成分23,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到四川省中医药管理局（编号：2024MS562）和成都中医药大学杏林人才计划（编号： MPRC2022035）的资助。我们衷心感谢成都中医药大学中医药创新研究院提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 安捷伦 MassHunter 软件 | Agilent Technologies | ||
| 安捷伦 ZORBAX SB-C18 色谱柱 | Agilent Technologies | 880975-902 | C18 反相色谱柱，4.6 × 250 mm，5 μm |
| 氢溴酸山莨菪碱 | 成都格利普生物科技有限公司 | 101-31-5 | HPLC>98% |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich | 5.33002 | |
| 冷冻干燥机 | EYELA，日本东京 | FDU-2110 | |
| 高速万能粉碎机 | 天津市泰斯特仪器有限公司 | 6010210100 | FW-100，24,000 rpm，100 g 容量，80 目 |
| 莨菪碱 | 成都格利普生物科技有限公司 | 55449-49-5 | HPLC>98% |
| 甲醇 | 赛默飞世尔科技 | 022909.K2 | |
| 0.22 μm 微孔滤膜 | Millipore | SLGV033RB | |
| Milli-Q Direct 8 纯水系统 | MilliporeSigma，美国马萨诸塞州伯灵顿 | ZRQSVP0JP | |
| 氢溴酸东莨菪碱 | 成都格利普生物科技有限公司 | 114-49-8 | HPLC>98% |
参考文献
- Ji, P., Yang, X., Zhao, X. Application of metabolomics in quality control of traditional Chinese medicines: a review. Front Plant Sci. 15, 1463666(2024).
- Li, S. -S., et al. Phytochemical variation ....
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