一种高效快速的HPLC-QQQ-MS方法用于测定药用植物中托烷类生物碱含量

摘要

本研究建立了一种高效液相色谱串联三重四极杆质谱法（HPLC-QQQ-MS），用于鉴定和定量分析唐古特山莨菪（Anisodus tanguticus）中的托烷类生物碱（莨菪碱、山莨菪碱、东莨菪碱）。该方法快速、准确且可靠，适用于药用植物的高通量分析。

摘要

Anisodus tanguticus 是一种重要的藏药植物。其托烷类生物碱（TAs），如莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱，具有显著的镇痛和镇静药理活性，使该物种成为提取这些生物活性成分的重要天然资源。然而，A. tanguticus 的化学成分极为复杂，包含大量结构尚未明确的化合物，因此对其活性成分进行系统的鉴定与结构表征尤为重要。尽管高效液相色谱法（HPLC）已广泛用于该植物提取物的分离，但即使借助光谱数据库比对，许多未知组分仍难以准确鉴定。

本研究建立了一种基于高效液相色谱串联三重四极杆质谱法（HPLC-QQQ-MS）的分析方法，用于测定莨菪烷类生物碱 A. tanguticus该方法包含一系列系统性步骤，包括标准化的样品制备、质谱参数设置、液相色谱预平衡、方法建立、质谱数据采集、多级质谱（MSⁿ）扫描以及人工数据分析。利用该策略，我们成功鉴定出三种具有代表性的托烷类生物碱 A. tanguticus：莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱。此外，该研究验证了所建立的HPLC-QQQ-MS方法的精确性，证实该方法快速、灵敏、可行且准确，适用于托烷类生物碱（TAs）的定量测定 A. tanguticus 已建立的方法具有良好的通用性和可靠性，适用于莨菪烷类生物碱的高通量鉴定与定量分析 A. tanguticus 及其他药用植物。

引言

中药的治疗效果在很大程度上取决于其产生的次生代谢产物，例如生物碱、黄酮类、萜类化合物以及其他活性成分^1,2,3。因此，对这些复杂混合物中特定目标代谢物进行精确且灵敏的定性与定量分析，是确保中药质量、阐明其疗效物质基础并推动现代研究的关键步骤³。然而，中药成分的多样性和复杂性，加之许多关键活性成分的浓度极低，为实现高效且准确的检测带来了巨大挑战。

Anisodus tanguticus (Maxim.) Pascher 是莨菪烷类生物碱（TAs）的重要植物来源⁴，以其富含具有药理活性的莨菪烷型化合物而著称⁵。其主要特征性生物碱包括山莨菪碱、东莨菪碱和莨菪碱，这些化合物具有共同的莨菪烷母核，但在功能基团取代上存在差异（图1），从而表现出不同的药理学特性^6,7,8。尽管其结构相似性给色谱分离带来困难，但也为比较植物化学与代谢研究提供了有价值的模型。近年来，已有研究采用代谢组学与网络药理学方法对 A. tanguticus 的化学成分及其地理变异进行了探讨^9,10。目前针对 A. tanguticus 代谢物的分析方法主要依赖高效液相色谱法（HPLC）¹¹。然而，A. tanguticus 幼苗阶段的莨菪烷类生物碱含量可低至0.01%（万分之一），而传统的HPLC方法常受限于分辨率、灵敏度和分析通量不足。这些局限性阻碍了结构类似生物碱同系物的完全分离，也影响了痕量成分的检测，从而降低了分析准确性，并限制了对更深入科研应用的支持。近年来，高效液相色谱串联质谱技术的进步为解决这些分析瓶颈提供了有力工具。特别是高效液相色谱-三重四极杆质谱法（HPLC-QQQ-MS），在色谱分辨率、分离效率和灵敏度方面均显著提升^12,13,14。该技术已成为中药中次生代谢产物研究的先进平台，能够在复杂的生物基质中高效、准确地定性和定量痕量目标分析物^11,15,16,17。因此，它为 A. tanguticus 等药用植物的全面化学轮廓分析与质量评价提供了坚实的技术基础。本研究针对 A. tanguticus 中莨菪烷类生物碱检测的长期挑战，重点解决痕量成分的准确定性与定量问题。通过系统优化色谱与质谱条件，我们建立并验证了一种新型的HPLC-QQQ-MS方法，用于多种主要莨菪烷类生物碱的 simultaneous 测定。该优化方法显著提高了灵敏度、选择性和方法稳健性，从而克服了传统基于质谱的检测方法中常见的局限性——如灵敏度不足、基质效应和共洗脱干扰——这些问题在痕量生物碱化合物分析中尤为突出。

方案

1. 样品制备

1. 标准溶液的制备
   1. 使用万分之一分析天平，分别精确称取10.0 mg的莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱和氢溴酸山莨菪碱对照品，置于不同的10 mL容量瓶中。
   2. 加入色谱级甲醇至刻度线，通过超声处理充分溶解，配制成浓度为1.0 mg/mL的单一标准储备液。
   3. 将储备液转移至棕色试剂瓶中，于4 °C避光保存。
      注意：所用生物碱具有高毒性，操作标准品时需采取安全防护措施。所有溶液均在使用前新鲜配制，并于4 °C避光保存，以避免降解。
2. 混合工作溶液的制备
   1. 用移液器吸取上述每种储备液各100 µL，置于10 mL容量瓶中，用色谱级甲醇稀释至刻度线，配制成浓度为10 µg/mL的混合标准中间溶液。
   2. 根据线性范围要求，用甲醇将中间溶液逐级稀释，得到一系列混合工作溶液。
   3. 分别取50 µL、200 µL和500 µL，获得浓度为0.5 µg/mL、2 µg/mL、5 µg/mL和10 µg/mL的工作液。使用前新鲜配制。
   4. 取100 µL浓度为10 µg/mL的中间溶液，置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1 µg/mL的稀释液。
   5. 再取100 µL浓度为1 µg/mL的溶液，转移至另一个1 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
3. 样品前处理
   1. 将苦参新鲜材料进行冷冻干燥，随后使用高速粉碎机研磨成均匀粉末。
   2. 用0.25 mm标准试验筛过筛。精确称取20 mg该粉末，转移至100 mL容量瓶中，加入色谱级甲醇至接近刻度线。
   3. 在室温下进行30分钟超声提取。提取完成后取出容量瓶，于室温冷却至25 °C，补加色谱级甲醇至100 mL刻度线，涡旋混匀2分钟。
   4. 吸取上述提取液1 mL，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度（稀释100倍）。充分振摇后作为HPLC进样母液（图2）。
      注意：操作高速研磨机时，必须佩戴防护眼镜和防尘口罩；控制研磨量和时间，防止过热。
4. 样品过滤与保存
   1. 准备1 mL一次性无针头注射器（色谱专用、非吸附型）和0.22 µm有机相微孔滤膜。
   2. 吸取1.2 mL进样母液，缓慢推滤进行过滤。
   3. 将后续滤液收集至带有内插管的2 mL样品瓶中，盖紧瓶盖密封。
      注意：超声清洗机频率固定为40 kHz。提取过程中避免容量瓶瓶盖松动，以防溶剂挥发。根据预实验中样品峰响应情况调整稀释倍数，确保目标峰面积落在标准曲线线性范围内。所有样品必须立即在4 °C冰箱中保存。

2. 高效液相色谱预运行、方法建立及质谱采集

1. 流动相的制备
   1. 制备流动相A：量取1000 mL超纯水，加入1.0 mL色谱级甲酸（体积分数：0.1% v/v），用磁力搅拌器搅拌10分钟，混匀。
   2. 制备流动相B：直接使用色谱级甲醇，无需额外处理。
   3. 将流动相A和B分别倒入超声脱气装置中，在40 kHz条件下超声脱气15分钟。
   4. 将脱气后的流动相立即转移至溶剂瓶中，密封后连接至高效液相色谱系统相应的A相和B相溶剂管路。
      注意：所有溶剂均为色谱纯，必须经0.45 μm滤膜过滤。 µm有机相微孔膜，使用前需进行处理。定期监测系统压力，若压力波动超过 ±±5%，检查色谱柱是否可能堵塞或管路中是否存在气泡。
2. 高效液相色谱条件的设置
   1. 使用C₁₈ 色谱柱（2.1 mm × 100 毫米，2.7 µm）进行色谱分离。使用前以甲醇:水 = 80:20（v/v）平衡色谱柱30分钟，平衡期间流速为0.3 mL/min。将色谱柱柱温箱温度设置为30 °C，并提前10分钟开始预热。
   2. 优化梯度洗脱程序如下：0–10.0 分钟，5% 到 10% B；10.0–15.0 分钟，10% 到 35% B；15.0–20.0 分钟，35% 到 60% B；20.0–25.0 分钟，60% 到 95% B。设定流速为 0.60 mL/min，进样体积为 2 µL，检测波长设为210 nm。
3. 质谱条件
   1. 使用配备电喷雾离子源（ESI）的三重四极杆（QQQ）质谱仪，在正离子模式（ESI+）下进行质谱（MS）检测。
   2. 设定操作参数如下：雾化器压力：15 psi；毛细管电压：4000 V；气体温度：300 °C；气体流速：11 L/min。
   3. 系统优化每种分析物的二级质谱参数。
      1. 首先，通过直接进样各标准品溶液来鉴定前体离子 MS2 扫描 模式。
      2. 使用前体离子的碎片电压优化，以获得最大信号强度 MS2 SIM模式.
      3. 随后，采用 产物离子扫描 模式以确定特征性产物离子。系统优化前体离子的碰撞能量（CE），以最大化产物离子的信号强度。
      4. 选择强度最高的产物离子用于定量，次强的产物离子用于定性确认。
         注意：通过在 MS2 扫描模式下直接进样各标准溶液来鉴定前体离子。确保标准溶液浓度适当，以避免信号饱和。定期校准仪器，防止参数漂移。
4. 方法验证
   1. 专一性
      1. 分别注入空白溶剂（甲醇）、混合标准工作溶液和样品提取液，并比较色谱图。
      2. 确保满足以下要求：空白溶剂中无干扰峰；样品中目标成分的保留时间与标准品一致（偏差 ≤ ±±0.1 分钟）；定量离子与定性离子的峰面积比符合标准品的要求（偏差 ≤ ±±10%).
   2. 线性关系
      1. 注入步骤1.1中配制的一系列混合工作溶液（0.1、0.5、2、5、10） µg/mL）下，按照上述HPLC-MS条件依次进行测定，每个浓度进样3次。
      2. 以浓度（x， µg/mL) 为横坐标，以定量离子的平均峰面积 (y) 为纵坐标，进行线性回归分析，要求相关系数 (R²) ≥ 0.995.
   3. 精密度与准确度
      1. 日内精密度（重复性）：在三个浓度水平（2）下，对6份质量控制（QC）样品进行分析 µ微克/毫升，5 µ微克/毫升，和10 µg/mL）内，计算相对标准偏差（RSD%）。
      2. 日间精密度（中间精密度）：取同一批干燥植物原料独立制备质控样品，由不同操作人员在连续三天内分别进行分析，计算相对标准偏差（RSD%）。要求两者 RSD% 均 ≤ 10%。
      3. 采用加标回收试验评估准确性，并以回收率（%）表示。确保低、中、高浓度的平均回收率范围为85%至115%，相对标准偏差（RSD%）≤ 5%。
         注意：线性范围必须涵盖实际样品中目标成分预期浓度范围（包括低、中、高浓度水平），以反映方法的实际适用性。所有验证实验均设三个重复，结果以平均值表示。

3. 数据采集

1. 采用多反应监测（MRM）模式进行数据采集。每种分析物的优化MRM参数（包括前体离子、产物离子跃迁、碎裂电压和碰撞能量（CE））详见表1。
2. 计算驻留时间，以确保每个色谱峰在每个跃迁通道上获得足够数量的数据点，同时保持适当的循环时间。

4. 数据分析

1. 启动定性分析软件，点击 文件 > 导入数据， 并导入所有采集的数据文件（.d 格式）。
2. 提取提取离子色谱图（EICs）：在 定量分析 模块，选择 MRM 转换输入各组分的前体离子-产物离子对，并提取相应的提取离子色谱图（EIC）。
3. 峰验证与积分：检查峰形对称性及保留时间的一致性（偏差 ≤ ±±每个EIC中目标峰的保留时间（与标准品相比，相差0.1分钟）。
4. 软件默认执行自动积分；若存在基线漂移或干扰峰，需手动调整积分参数（积分起始点和结束点），以确保积分准确。
5. 使用标准曲线计算未知样品中各组分的浓度。点击 报告 > 生成报告，选择 Excel 导出报告的格式。报告包含化合物名称、保留时间、峰面积、浓度、相对标准偏差（RSD%）等信息。

结果

HPLC-QQQ-MS 分离与鉴定萜类生物碱
由标准混合物分析获得的典型 MRM 色谱图及一个 A. tanguticus 根提取物被展示于 图3 和 图4在优化的HPLC条件下，三种目标托烷生物碱——莨菪碱（hyoscyamine）、东莨菪碱（anisodamine）和山莨菪碱（scopolamine）均在20分钟内实现有效分离，表明所建立方法具有高效率。山莨菪碱与东莨菪碱之间的分离度（Rs）为8.67，东莨菪碱与莨菪碱之间的分离度达到11.58。所有分离度数值均显著高于基线分离标准（1.5），表明无色谱干扰，证实该方法适用于准确定量分析。所有化合物均呈现尖锐且对称的峰形，显示出优异的色谱性能及极低的基质干扰。每种托烷生物碱（TA）的鉴定均基于两个标准：（1）保留时间与对照标准品一致（±0.1 min以内）；（2）至少存在两个特异性的MRM跃迁（定量离子和定性离子）。

讨论

随着人们对植物次生代谢物的兴趣日益增长，生物碱检测的分析技术受到了广泛关注。尽管用于分析托烷类生物碱（TAs）的基础色谱体系已经建立¹⁸，但近年来的新进展——例如毛细管电泳（CE）的应用、GC–MS 和 HPLC–MS 仪器性能的提升，以及对旋花素（convolvine）和类似托品酮毒素等新型结构化合物的鉴定——凸显了对当前这些生物碱色谱分析方法进行系统综述的必要性^{11,19,20,21,22}。TAs 的分析需求因应用场景而异：在植物组织分析中（如植物育种、生物碱生物合成及提取研究），分析方法必须具备高选择性和高灵敏度，以区分结构相似的次生代谢物并检测痕量成分^23,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
安捷伦 MassHunter 软件	Agilent Technologies
安捷伦 ZORBAX SB-C18 色谱柱	Agilent Technologies	880975-902	C18 反相色谱柱，4.6 × 250 mm，5 μm
氢溴酸山莨菪碱	成都格利普生物科技有限公司	101-31-5	HPLC>98%
甲酸	Sigma-Aldrich	5.33002
冷冻干燥机	EYELA，日本东京	FDU-2110
高速万能粉碎机	天津市泰斯特仪器有限公司	6010210100	FW-100，24,000 rpm，100 g 容量，80 目
莨菪碱	成都格利普生物科技有限公司	55449-49-5	HPLC>98%
甲醇	赛默飞世尔科技	022909.K2
0.22 μm 微孔滤膜	Millipore	SLGV033RB
Milli-Q Direct 8 纯水系统	MilliporeSigma，美国马萨诸塞州伯灵顿	ZRQSVP0JP
氢溴酸东莨菪碱	成都格利普生物科技有限公司	114-49-8	HPLC>98%