药物处理后肝细胞癌类器官的生成及单细胞转录组学分析

摘要

本方案概述了一种简化的方法，用于生成肝细胞癌类器官，施加药物处理，并在处理前后进行单细胞RNA测序，以表征与治疗相关的转录变化。

摘要

肝细胞癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其特征是显著的瘤内异质性，这导致治疗反应差异、肿瘤复发和疾病进展。因此，深入理解肿瘤细胞在药物治疗前后转录水平的变化，对于改进治疗策略至关重要。然而，目前将类器官药物处理与后续单细胞转录组分析相结合的实用实验流程仍较为有限。本研究建立了一种标准化的工作流程，用于生成肝细胞癌类器官、施加特定药物处理，并对处理前后采集的样本进行单细胞RNA测序。该方案包括类器官复苏与扩增、治疗前质量评估、药物暴露、类器官单细胞解离前准备、文库构建以及单细胞转录组数据的基本比较分析。文中提供了关键的技术注意事项，以提高实验的可重复性和样本质量。该工作流程能够并行表征肝细胞癌类器官中与药物处理相关的细胞组成变化和转录组改变。该方案具有良好的稳健性、可扩展性，并适用于不同的类器官系统，为在单细胞分辨率下研究治疗相关的基因表达变化提供了实用平台。

引言

肝细胞癌（HCC）是成人中最常见的原发性肝癌，也是全球癌症相关死亡的主要原因之一^1,2,3。其临床预后较差，主要归因于显著的瘤内异质性，导致治疗耐药和复发⁴。最近一项研究表明，由关键转录程序（如FOXM1/CEBPB轴）驱动的发育多样性及细胞状态可塑性，是HCC治疗耐药的重要机制⁵。这些发现凸显了理解肿瘤细胞群体在持续治疗压力下如何适应并发生状态转换的必要性。然而，大多数临床前模型未能充分反映这些治疗相关状态转换的动态性和连续性，从而限制了对肿瘤适应机制及治疗失败机理的深入研究。

患者来源的类器官（PDOs）为此目的提供了一个有用的平台，因为它们保留了原始肿瘤的重要基因组改变和细胞异质性⁶。肝细胞癌（HCC）类器官可在长期培养中维持关键的组织学特征⁷，使其特别适用于治疗反应研究。此外，基于类器官的研究已证明利用肝癌类器官进行药物筛选以及捕捉个体间和瘤内治疗敏感性差异的可行性，支持其作为治疗反应研究的临床前模型的价值^8,

方案

本研究使用的人体组织经广州医科大学研究伦理审查委员会审核并批准（批准号：GYZL-2024-KY31）。所有涉及人体样本的操作均遵循机构关于人类研究的指导方针。所有患者均已签署书面知情同意书，同意将其临床样本用于医学研究。所用试剂和设备列于材料表中。

该实验流程包括冷冻保存的肝细胞癌类器官的复苏与扩增，并针对下游的治疗干预和单细胞RNA测序进行了少量优化。目的是获得质量足够高且一致性良好的类器官培养物，用于后续的药物处理实验¹²。

1. 建立并扩增肝细胞癌患者来源类器官

1. 类器官的解冻与复苏
   1. 解冻前准备
      1. 将水浴锅预热至 37 °C。将 24 孔板置于 37 °C 培养箱中至少预平衡 1 小时，以备接种使用。
      2. 提前配制完全类器官培养基，并将基底膜提取物（BME）置于冰上直至使用。完全类器官培养基的组成见补充表 1。
   2. 类器官解冻
      1. 从液氮储存中取出含有冷冻肝细胞癌（HCC）类器官的冻存管，立即放入 37 °C 水浴中。
      2. 轻轻摇动冻存管，当仅剩少量冰晶时停止解冻。
      <....

结果

图1概述了肝细胞癌（HCC）类器官的建立与表征过程。图1A显示，采用患者来源的肿瘤组织建立类器官培养体系，用于组织学分析和治疗研究。图1B展示了类器官在复苏后第1天和第6天的明场图像，表明其在标准三维培养条件下具有存活能力并可扩增。第1天时，类器官呈小而致密的结构，至第6天则体积增大，形态清晰且结构完整。图1C展示了扩增期间类器官的明场图像及苏木精-伊红染色结果，以及EPCAM、AFP、SOX9、HNF4A和ALB的免疫染色结果，证实其具有肝细胞谱系特征。上述结果表明HCC类器官已成功建立并实现有效扩增，表现为持续生长、形态保持良好以及表达肝细胞谱系标志物。

图2展示了治疗相关的形态学变化以及类器官用于单细胞RNA测序的制备过程。图2A

讨论

为确保可重复性、高效性以及高质量的单细胞转录组分析，该实验流程中的多个技术步骤需要严格控制。在复苏和扩增患者来源的肝细胞癌类器官时保持一致性至关重要，因为接种密度、基底膜基质成分和培养时间的差异可能会影响类器官的形态、生长特性以及后续治疗反应^13,14。此外，解离过程中保持高细胞活力对单细胞RNA测序（scRNA-seq）尤为关键，因为剧烈的酶消化或过度的机械剪切可能引入与应激相关的转录偏差，并降低数据质量。优化的解离策略（如低温或使用冷活性酶处理条件）有助于在敏感的类器官样本中维持原有的细胞组成¹⁵。

该方案可根据实验需求进行策略性调整。对于生长缓慢或冻存后复苏率不稳定的类器官品系，延长扩增时间或优化基质浓度与培养基成分，可提高培养的稳定性和实验的一致性。药物处理时间可根据预期的治疗反应进行调整。该工作流程的优势在于，将常规类器官培养、药物处理和标准单细胞文库制备整合为一个易于实施的实验设计。该方案适用于已熟悉类器官.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
[Leu15]-胃泌素 I 人	默克	G9145
1.5 mL 微量离心管	默克	AXYMCT150LC
1X 红细胞裂解缓冲液	赛默飞世尔科技	00-4333-57
2.0 ml 内螺纹冷冻小瓶	巢	607001
A8301（TGFb 抑制剂）	Tocris Bioscience	2939
AFP 多克隆抗体	Proteintech	14550-1-AP
抗白蛋白抗体 [ALB/2144]	abcam	ab236492
抗HNF-4α抗体 [EPR16885] - ChIP级	abcam	ab181604
抗前白蛋白抗体 [EPR3219]	abcam	ab92469
抗SOX9抗体 [EPR14335-78]	abcam	ab185966
B27 补充剂（503），不含维生素 A	赛默飞世尔科技	12587010
细胞回收溶液，100 mL	康宁	354253	用于在重新接种或下游处理前溶解基底膜基质并回收类器官的试剂
CellTiter-Glo® 三维细胞活力检测	Promega	G9681
CHIR99021	默克	SML1046
Chromium Next GEM 单细胞 3' GEM，文库 & 凝胶微珠试剂盒 v3.1	10x Genomics	CG000227
康宁细胞滤筛，40 μ米，蓝色，S，IND，1/50	康宁	431750
Corning 24孔透明平底超低吸附多孔板，单个包装，无菌	康宁	3473
Cultrex 减少生长因子基底膜提取物，2 型 PathClear（BME）	默克	3533-005-02	用于支持三维类器官培养和圆顶结构形成的细胞外基质
DMSO	默克	C6164	用于配制药物储备液和空白对照的溶剂
Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F-12	赛默飞世尔科技	12634028	高级DMEM/F-12
E7080（乐伐替尼）	Selleck	S1164	用于类器官治疗及治疗性干预的酪氨酸激酶抑制剂
胎牛血清价值 FBS	Gibco	A5256701
福斯科林	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX 补充剂	赛默飞世尔科技	35050061
苏木精和伊红染色试剂盒	Beyotime	C0105S
HEPES，1 M	赛默飞世尔科技	15630080
Leica DM6 B 荧光电动显微镜	Leica	N/A
N2 补充剂（1003）	赛默飞世尔科技	17502048
N-乙酰半胱氨酸	默克	A0737-5MG
烟酰胺	默克	N0636
Nunc 15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管	赛默飞世尔科技	339651
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）	赛默飞世尔科技	15140122
磷酸盐缓冲液	基因组生物	GNM20012	用于清洗类器官及制备下游处理样品的缓冲液
重组人EGF	Peprotech	AF-100-15
重组人 FGF10	Peprotech	100-26
重组人HGF	Peprotech	100-39
重组人Noggin	Peprotech	120-10C
Rho 激酶抑制剂 Y-27632 二盐酸盐	默克	Y0503	ROCK抑制剂，用于提高类器官在解冻或传代后的存活率
R-spodin1 条件培养基	（Broutier 等）	N/A	细胞系的分泌
0.4% 台盼蓝染液，经0.85%生理盐水配制，膜过滤	Gibco	15250061
TrypLE Express 酶（1x），无酚红	赛默飞世尔科技	12604013	胰蛋白酶替代物
Wnt-3a 条件培养基	（Broutier 等）	N/A	细胞系的分泌作用