Method Article

药物治疗后肝细胞癌类器官的生成及单细胞转录组分析

DOI:

10.3791/70511

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May 26th, 2026

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1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

In This Article

Summary

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该方案概述了一种简化的肝细胞癌类器官生成方法，应用于药物治疗，并在治疗前后进行单细胞RNA测序，以表征治疗相关的转录变化。

Abstract

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肝细胞癌是全球癌症相关死亡率的主要原因之一，其特征是肿瘤内异质性显著，导致治疗反应多样、肿瘤复发和疾病进展。因此，深入了解肿瘤细胞在药物治疗前后转录层面的变化，对于改善治疗策略至关重要。然而，将类器官类药物治疗与下游单细胞转录组谱连接起来的实际实验流程仍然有限。本研究开发了一套标准化的流程，用于生成肝细胞癌类器官、应用定义的药物治疗，以及对治疗前后采集的样本进行单细胞RNA测序。该方案包括类器官复活与扩增、治疗前质量评估、药物暴露、单细胞解离类器官制备、文库构建以及单细胞转录组数据的基础比较分析。为提高重复性和样本质量，提供了关键的技术预防措施。该工作流程能够并列表征肝细胞癌类器官中与药物治疗相关的细胞组成和转录变化。该方案稳健、可扩展且可适应不同类器官系统，为单细胞分辨率下研究处理相关基因表达变化提供了实用平台。

Introduction

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肝细胞癌（HCC）是成人最常见的原发性肝癌，也是全球癌症相关死亡的主要原因之一 1,2,3。其临床预后较差是由于肿瘤内异质性显著，导致治疗耐药性和复发率4.一项最新研究表明，由关键转录程序如FOXM1/CEBPB轴驱动的发育多样性和细胞状态可塑性，对HCC5的治疗耐药性有贡献。这些发现凸显了理解肿瘤细胞群体在持续治疗压力下如何适应和转换状态的必要性。然而，大多数临床前模型未能充分捕捉这些治疗相关状态转变的动态、连续性特性，限制了对肿瘤适应和治疗失败机制性的探究。

患者来源类器官（PDOs）为此提供了有用的平台，因为它们保留了原始肿瘤的重要基因组变异和细胞异质性6。HCC类器官可以在长期培养中保留，同时保留关键组织特征7，使其特别适合治疗反应研究。此外，基于类器官的研究已证明，利用肝癌类器官进行药物检测以及捕捉患者间和肿瘤内治疗敏感性差异的可行性，支持其作为治疗反应研究前临床模型的价值

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Protocol

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使用人体组织的研究经广州医科大学研究伦理审查委员会审核并批准（批准号为GYZL-2024-KY31）。所有涉及人体标本的程序均按照人体研究的机构指南进行。所有患者均获得了书面知情同意，允许其临床样本用于医学研究。所用试剂和设备详列于 材料表中。

该工作流程包括冷冻保存的肝细胞癌类器官的回收和扩增，并对下游治疗扰动和单细胞RNA测序做少量适应。其目标是生成足够质量和一致性的类器官培养物，以便后续药物治疗实验12.

1. HCC患者来源类器官的建立与扩展

  1. 冷冻保存类器官的解冻与回收
    1. 解冻前的准备
      1. 预热水浴至37°C。 在进行压板前，将24孔的培养板置于37°C培养箱中至少1小时。
      2. 提前准备完整的类器官培养基，并将基底膜提取物（BME）冰藏保存，直到使用。完整类器官培养基的组成见 补充表1。
    2. 类器官的解冻
      1. 将含有冷冻HCC类器官的冷冻瓶从液氮储存中取出，立即放入37°C的水浴中。
      2. 轻轻搅动小瓶，只剩下一小块冰晶时停止解冻。

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Results

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图1 概述了肝细胞癌（HCC）类器官的生成和表征过程。 图1A中，患者来源的肿瘤组织用于建立类器官培养，用于组织学分析和治疗研究。 图1B 显示了恢复后第1天和第6天类器官的明场图像，展示了在标准三维培养条件下的存活和扩展。在第一天，类器官呈现为小型、致密的结构，而到第六天时，它们的体型增大且形态清晰。 图1C 展示了类器官在扩增过程中的明场染色和赤木精和伊丝蛋白染色，以及EPCAM、AFP、SOX9、HNF4A和ALB的免疫染色，确认了肝细胞谱系特征。这些观察表明HCC类器官的成功建立和扩展，体现在持续生长、形态保存及肝细胞谱系标记表达等方面。

图2 展示了处理相关的形态变化及类器官在单细胞RNA测序中的制备过程。 <.......

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Discussion

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为了确保单细胞转录组分析的可重复性、效率和高质量，工作流程中的若干技术步骤需要严格控制。患者来源HCC类器官的复活和扩殖一致性至关重要，因为播种密度、基底膜基质组成和培养时间的变化会影响类器官形态、生长及后续处理反应（13,14）。此外，解离过程中细胞高存活率对scRNA测序至关重要，因为剧烈的酶消化或过度机械破坏可能引入应激相关的转录伪影并降低数据质量。优化解离策略，包括低温或冷活性酶条件，可能有助于保持敏感类器官样本中的细胞组成15。

该方案允许根据实验需求进行战略调整。对于生长缓慢或解冻后恢复不变的类器官品系，延长膨胀期或优化基质浓度和培养基组成，可能有助于提升培养稳定性和实验一致性。药物暴露的时间可以根据预期的治疗反应进行调整。该工作流程的优势在于它将常规类器官培养、药物处理和标准单细胞文库制备整合为一个实验可及的设计。它适合已经熟悉类器官培养.......

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Disclosures

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作者没有利益冲突可披露。

Acknowledgements

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该研究得到了中国国家自然科学基金（82303022;82122048;82372714;82203380）、广东省基础应用研究基金会（2023A1515011416）和广州基础应用研究基金会（2024A04J6575）的支持。部分示意元素采用了研究人员之家（https://www.home-for-researchers.com）创建，并由作者进行了调整。示意图使用Figdraw（https://www.figdraw.com）制作，作者进行了改编。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-胃泌素I型人类默克G9145
1.5 mL 微管默克AXYMCT150LC
1X 红细胞溶解缓冲液赛莫飞世尔科学00-4333-57
2.0毫升内线低温小瓶巢穴607001
A8301（TGFb抑制剂）托克里斯生物科学2939
AFP多克隆抗体蛋白质技术14550-1-AP
抗白蛋白抗体 [ALB/2144]ABCAMAB236492
抗HNF-4-α抗体[EPR16885] - ChIP级ABCAMAB181604
抗前白蛋白抗体 [EPR3219]ABCAMAB92469
抗SOX9抗体 [EPR14335-78]ABCAMab185966
B27补充剂（503），去维生素A赛莫飞世尔科学12587010
细胞恢复液，100毫升科宁354253试剂用于溶解基底膜基体并在重新镀层或下游处理前回收类器官
细胞滴度-光光; 三维细胞存活能力测定普罗梅加G9681
CHIR99021默克SML1046
Chromium Next GEM 单胞3' GEM、库与凝珠套件 v3.110倍基因组学CG000227
康宁电池滤网，40和μ;男，蓝，S，独立，1/50科宁431750
Costar 24孔透明平底超低连接多孔板，单独包裹，无菌科宁3473
Cultrex低生长因子BME，2型PathClear（BME）默克3533-005-02用于支持三维类器官培养和穹顶形成的细胞外基质
DMSO默克C6164用于制备药物库存溶液和车辆控制的溶剂
杜尔贝科改装鹰中型/火腿F-12赛莫飞世尔科学12634028高级DMEM/F-12
E7080（朗伐替尼）塞莱克S1164用于类器官治疗和治疗干扰的酪氨酸激酶抑制剂
胎儿牛血清价值FBS吉布科A5256701
福斯科林托克里斯生物科学1099
GlutaMAX补充剂赛莫飞世尔科学35050061
血液素和嗜氨酸染色套件碧昂泰姆C0105S
HEPES，1 M赛莫飞世尔科学15630080
徕卡 DM6 B 荧光电动显微镜徕卡无
N2补充（1003）赛莫飞世尔科学17502048
N-乙酰半胱氨酸默克A0737-5MG
烟酰胺默克N0636
Nunc 15 mL锥形无菌聚丙烯离心管赛莫飞世尔科学339651
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）赛莫飞世尔科学15140122
磷酸盐缓冲生理盐水基因组简介GNM20012用于清洗类器官和准备下游处理样品的缓冲液
重组人类EGFPeprotechAF-100-15
重组人类FGF10Peprotech100-26
重组人类HGFPeprotech100-39
重组人类诺金Peprotech120-10C
Rho激酶抑制剂Y-27632二盐酸盐默克Y0503ROCK抑制剂用于增强类器官解冻或转代后的存活率
R-孢子蛋白1调理介质（Broutier 等人）无细胞系的分泌
锥蓝染色剂，0.4%膜过滤，用0.85%生理盐水制备吉布科15250061
TrypLE表达酶（1x），无酚红赛莫飞世尔科学12604013胰蛋白酶替代
Wnt-3a调制介质（Broutier 等人）无细胞系的分泌

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