使用24孔架进行中通量柱DNA提取

摘要

该方案描述了一种具有成本效益的加速质粒DNA提取方法。通过使用与标准摆动铲斗板转子兼容的定制3D打印机架，研究人员可以同时处理多达48根带盖的离心柱，或最多116个无盖的离心柱，相比手动微离心法显著缩短了处理时间。

摘要

二氧化硅膜离心柱萃取是高质量DNA纯化的标准方法，但人工繁重且难以手工扩展至小批量以上。现有的自动化液体处理机器人通常仍对中小型实验室来说价格过高。本文提出了一种简化的半自动化方法，采用定制设计的3D打印机架，这些机架适合标准离心板转子。

建议的系统允许并行处理多达116根标准商业旋转柱。机架设计采用“嵌套”配置，实现在单一离心步骤中同时进行裂解物澄清（通过过滤柱）和DNA结合（通过硅基柱）。此外，设计采用共享废水槽，避免在清洗步骤中丢弃单个管子的流水。

该方法在DNA产量和纯度上可与标准手工协议相当，但对于样本批次超过24个（60–90分钟而非120–180分钟）的总处理时间减少约50–70%。无论处理样品数量多少，包括裂解液过滤、洗涤和废弃物等步骤所需的总时间均可减少5至10分钟。这种开源硬件方法弥合了手工迷你准备与昂贵自动化之间的鸿沟。

引言

1979年，Vogelstein和Gillespie首次阐明了利用硅基质分离核酸的原理，他们确立了在高浓度混异性盐（特别是碘化钠¹）存在下，将DNA片段吸附到玻璃粉末上的基础原理。这一突破为当时主导的有毒酚氯仿提取和繁琐的氯化铯梯度超离心方法提供了一种更安全、更高效的替代方案。随后，Boom及其合作者通过引入硫氰酸镍（GuSCN）作为主要混肽剂²，显著优化了该方法。这一创新具有关键作用，因为GuSCN既是溶解细胞的强效蛋白质变性剂，也是RNase和DNase的强抑制剂，从而在初期提取阶段保持核酸完整性。

自诞生以来，这种固相提取技术——广称为“Boom法”——经过了广泛的改进。它已被适应用于从日益复杂的生物矩阵中分离核酸，范围从细菌质粒³ 和基因组^DNA4 到真核线粒体⁵ 和高分子量基因组DNA。此外，该技术已扩展应用于临床和法医领域，包括从血浆^中分离无细胞循环DNA、提取富含多酚^的难治植物DNA和RNA，以及病毒核酸⁸的纯化。市面上也有许多使用离心柱的商业套件。

这一过程背后的物理化学机制依赖于混动离子对水结构的破坏。在高离子强度和低pH值下，环绕核酸磷酸骨架和二氧化硅表面的水合壳层被剥离（脱水）。这促进了阳离子桥的形成——通常由Na⁺ 或混异性阳离子介导——连接在二氧化硅表面带负电的硅醇基团与核酸的磷酸基团之间。通过对缓冲液化学的精确调控，实现了核酸类型（DNA与RNA的选择性）和片段长度的选择性。例如，特定的盐浓度和pH值可以促进长基因组链相较于短寡核苷酸的结合，或区分RNA和DNA。此外，现代技术版本常采用改良的二氧化碳表面，以增强特定核酸物种的差异吸附等温线。

基于硅的核酸纯化流程通常分为四个阶段：（1）裂解阶段，即生物起始物均质化并分解细胞结构，通常使用碱性条件或洗涤剂（SDS/Triton）;（2）澄清，去除细胞残渣、沉淀蛋白和多糖，以防止柱塞;（3）结合，即用调水盐和乙醇调节上清液，促进对硅膜的吸附;以及（4）洗涤，即在低离子强度缓冲液中洗脱前，用酒精缓冲液冲洗膜结合的核酸，去除残留的盐分和抑制剂。

尽管该工艺化学结构坚固，单个离水柱的机械处理仍是中等通量（24–100个样品）工作流的重要瓶颈，造成手工处理与昂贵自动液体处理系统之间的差距。现有简化手动柱基核酸提取的方法包括真空歧管和自动纯化机器人工作站9^{、10、11、12}。

真空歧管通常有随机存取配置，配备20–24个Luer插头适配器用于离心柱，或设计用于96孔板。配置为20–24个样品的真空歧管相比离心，加快了DNA纯化过程中的柱洗步骤，因为它们无需从转子上取出柱子。虽然这种方法很方便，但由于柱排水尖端接触到真空歧管的卢尔口，可能会发生交叉污染。如果一柱的DNA进入Luer开口，在后续流管使用时可以转移到另一条样本柱上。为防止污染，制造商建议添加额外附件^10、13;然而，这些设计会使提取装置的组装变得复杂，因此常被省略。

为96孔格式设计的真空歧管结构不同，主要用于不适用于微离心塔，而是兼容的96孔DNA提取板，其中孔内含有硅膜。在这种情况下，DNA提取使用预包装的96孔格式DNA分离试剂盒¹⁴。这些套件提供高通量，但应用范围有限，因为处理少于96个样本通常不切实际。

自动化机器人工作站用于核酸提取无疑是最便捷的DNA纯化方法，因为它们几乎无需操作人员参与，从而节省研究人员时间，并最大限度地减少污染等随机因素。遗憾的是，大多数提取站缺乏通用性，且仅使用专用套件。这些工作站主要用于诊断实验室，但对大多数中小型学术实验室来说并不具成本效益。

因此，实验室中存在中通量DNA提取方法的空白，该方法能在1小时内处理12至96个样本。我们展示了一个24孔机架，允许使用封盖离量柱手动分离最多48个样品，使用无封顶离量柱最多分离116个样品。配备摆轮板转子的离心机和固定角度微型离心机作为额外设备。质粒DNA纯化程序被列为使用24孔架的示例，因为质粒DNA分离包含澄清步骤以去除裂解细胞碎片，这使得自动化过程较为困难。尽管如此，这些架子几乎可用于任何基于柱的核酸提取方法。

方案

1. 准备3D打印设备

1. 使用带有0.4毫米喷嘴的熔丝3D打印机打印机架。使用通用的PLA、PETG或ABS耗材，填充100%。将图层高度设置为0.1毫米，并启用表面平滑。调整打印设置以确保防水性和机械稳定性。
   注意：机架组件的STL文件见 补充文件1。按照基底储液槽指定的打印参数操作。使用前，通过注满70%乙醇并进行离心，进行1、2、5、10和30分钟等逐渐延长的离心时间，以确认无泄漏或结构损伤。
2. 将底座储液罐组件粘合在一起，形成密封单元。

2. 细菌培养与裂解

1. 接种大 肠杆 菌转化为3–5毫升含有适当抗生素的LB培养基。在37°C下摇晃孵育一夜（12–16小时）。
2. 用离心法在2000× 克 下采集细胞，浸泡10分钟。丢弃上清液。
   注意：细胞颗粒在加工前可储存在−20°C。
3. 向沉淀中加入250微升的悬浮缓冲液（含RNase A的缓冲液P1）。通过漩涡或移液完全重新悬浮。
4. 加入250微升裂解缓冲液（缓冲液P2）。搅拌时，轻轻倒置管子4–6次。
   注意：避免剧烈混合，以防止基因组DNA剪切。
5. 加入350微升中和缓冲液（缓冲液N3）。立即通过倒置彻底混合。
   注意：应形成白色沉淀物，表示成功中和。

3. 过滤装置的组装

1. 将DNA结合柱放入架子的柱子夹层。
2. 将柱盖放入指定槽中，以便在离心过程中固定。
3. 将澄清/过滤列直接放在装订列正上方的过滤列图层中。
   注意：如果没有过滤塔，请将裂解液置于微管中离心，并将上清液转移到结合柱。

4. 裂解物清除与DNA结合

1. 将步骤2.5中和的裂解液转移到过滤塔中。
2. 将组装好的货架放入摆动铲板转子中。
   注意：使用质量相同且配置相同的配重架，确保平衡。
3. 在室温下以2000× 克 离心机离心1分钟。
4. 把离心机上的架子拆下来。
5. 去除并丢弃滤波柱层。

5. 洗涤

1. 将水库的流水抛入废物容器。用装订柱重新组装架子。
2. 使用多通道移液器向每个结合柱添加500–700微升洗涤缓冲液。
3. 离心机在2000克下×1分钟。
4. 丢弃水库的流动。
5. 重复洗涤，向每根柱加入洗涤缓冲液，并以2000 ×克 离心1分钟。
   注意：柱可存放于室温或清洗后4°C。

6. 干燥与洗脱

1. 从机架上取出结合柱，转移到2毫升收集管中。
2. 用>10,000克离心机×1分钟，使膜干燥。
3. 转移柱以清洁1.5毫升管。
4. 直接向膜中加入50微升洗脱缓冲液或水。在室温下孵育1分钟。
5. 在>10,000 g 离心机×1分钟以洗脱DNA。

7. 可选：与二氧化钛共沉降

1. 将裂解缓冲液与二氧化钛粉末混合，体积与质量比为2：1。
2. 向裂解液中加入250微升的二氧化钛悬浮液。通过倒置混音。
3. 加入350微升中和缓冲液，彻底混合。
4. 离心机在2000 × g 下运行1分钟。
5. 收集上清液时不扰动沉淀物。
6. 将上清液转移到结合柱。

结果

机架变体
我们开发了四种适用于各种离心机型号的机架，允许利用不同实验室环境中可用的资源，并满足用户偏好。所有机架均采用24孔结构，但根据不同版本，还增加了柱子的座位位置。详细尺寸和兼容性见补充文件2。 补充图S1提供了组装机架的高分辨率图像。

基本机架版本（见图1）是最高效的配置。它由四个部分组成，尺寸为88×130×77毫米。当使用带大写的列时，它允许同时使用最多48列，使用无大写列时最多可同时使用116列。机架组件设计简便，并尽量减少离心过程中的不良影响。旋转柱被放置在柱层中，该层带有用于插入盖板的槽;这些凹槽也可以容纳无盖柱。柱层位于水库上。柱子的排水口位于水库切口上方，有助于减少相邻柱子之间的飞溅。液体通过切口底部的开口流入储液槽。储液容量约为100毫升，可容纳两个高塔载量的洗涤步骤。过滤列层可以在需要时放置在列层之上，滤波列位于绑定列上方并与其接触。盖子密封含有过滤器或结合柱的层，限制离心机旋转时的气流。基础机架版本兼容A-2-DWP铲斗转子（如Eppendorf 5804）、转子1770（如HETTICH Rotina 380）或同等系统。

迷你机架版本（见图2）适用于各种离心斗转子。它由三部分组成，最小尺寸为82.5毫米×128毫米×58毫米（含滤芯层）。它允许使用最多48列带大写字母，或最多90列无大写字母。该版本的几何形状与基础机架相似，但外排列位置被去除，改为用于列帽的槽。储量因印刷版本而异。最小的储液槽（20毫升）可容纳约30根柱的一次洗涤步骤;更大的储层可以提高通量。过滤塔层边缘圆润，便于转子斗在较小离心机中移动。迷你机架版本兼容UC-124铲斗转子（如Accumax iFuge UC02）或同等系统。当不使用滤网柱层时，机架兼容A-2-MTP桶转子（如Eppendorf 5430）或其同类产品。

无储液槽（无盖）版本（图3）适合3D打印经验有限的用户，因为储液槽被外部容器（如移液器尖端盒）替代。该版本由三部分组成，尺寸为79×115×61.5毫米。它允许使用最多48列带大写，或最多78列无大写。几何结构与之前版本相似，但缺少集成储罐。相反，使用合适的容器进行废物收集。柱层和滤芯层的座位位置较少，滤芯层包含锥形座座以避免干扰转子运动。底座设计为可容纳标准容器，并可通过侧面垫片进行稳定。兼容性取决于所选容器，但包括A-2-DWP铲斗转子（例如Eppendorf 5804）、转子1770（例如HETTICH Rotina 380）和UC-124铲斗转子（例如Accumax iFuge UC02）。

帽架版本（图4）是最简单的配置，与5 mL或10 mL的24孔深孔板一起使用。它由一个单元组成，尺寸为73 × 109×4毫米，最多可使用48根柱子。该版本兼容任何支持相应板式的离心机转子。

产量与纯度
DNA提取在大肠杆菌培养中同时采用标准手动微离心法和架式方法进行。分光光度分析显示，使用支架提取的DNA质量与标准方法相当。两种进近方式的典型A260/A280比值在1.8至1.9之间。总质粒产率（μg）显示，传统方法与使用机架结构提取之间无显著差异（见图5）;原始数据提供于补充文件2。质粒构象也得以保留，分布有松弛、线性化和超螺旋形态（见图6）。

交叉污染分析
为评估潜在交叉污染，进行了棋盘格实验。柱子交替装入高浓度溴化乙胺溶液（模拟高滴度DNA）和水。在2000× 克离心后，染料分布仅限于装载塔下方的废物区，邻近井或邻近塔尖未检测到可见信号（见图7）。这些观察表明，机架设计在测试条件下减少了飞溅和横柱转移的可能性。

为进一步评估污染情况，使用扩增子作为污染剂进行实时PCR检测（见 补充文件2）。仅在加入增幅子的柱中检测到放大（见图8）。在测试条件下，未检测到交叉污染;然而，性能可能因工作流程和样品类型而有所不同。

图1：机架组件基本原理图。 爆炸CAD视图，显示（A）盖，（B）滤波塔层，（C）塔架层，（D）基底储层。机架由四个部分组成，尺寸为88×130×77毫米，允许同时使用最多48列带盖柱，或最多116列无盖柱。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：机架组装示意图的迷你版。爆炸CAD视图，显示（A）滤波塔层，（B）塔架层，（C）基底储层。该版本几何结构与基础版相似，但两侧的柱座被移除，改为柱盖槽。它由三部分组成，最小尺寸为82.5毫米×128×58毫米（含滤波列层），允许使用最多48列带盖柱，或最多90列无盖柱。请点击此处查看该图的更大版本。

图3：无储槽（无盖）版本的机架组件示意图。 爆炸CAD视图，显示（A）滤纸柱层、（B）柱夹层、（C）底座和（D）移液器尖端盒。该版本用外部容器（如移液器尖端盒）取代了集成的储液槽。该图由三部分组成，尺寸为79×115×61.5毫米，最多可使用48列带盖柱，或最多78列无柱柱。请点击此处查看该图的更大版本。

图4：24孔机架的帽状版本。 上视图（左）和下视图（右）。这是最简单的机架版本，配合5 mL或10 mL的24孔深孔板一起使用。它由一个尺寸为73×109×4毫米的单一部分组成，允许使用最多48列，带帽或不带帽。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：DNA产量与纯度的比较。 质粒产率（μg/mL）的光谱光度分析。传统方法与机架提取之间未观察到总质粒产量的统计学显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：DNA质量比较。通过琼脂糖凝胶电泳观察到DNA形态。松弛、线性和超螺旋形DNA在标准手动提取和架式提取之间相似。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：交叉污染评估。 离心后废物储藏图，显示无重叠的离散废物池。柱子装载了高浓度溴化乙蓌溶液（模拟高滴度DNA）和水。离心后，在相邻“水井”或邻近柱顶端未观察到染料，表明在测试条件下溅溅和横柱转移减少。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8：利用定量PCR分析交叉污染。含有污染物的样品的放大曲线以红色表示，而仅含水的样品则以绿色表示。仅在含有污染物的样品中检测到扩增。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件1：机架设计的3D模型文件。该文件集包含所有机架配置的STL文件，包括基础机架版本、迷你机架版本（支持多种油箱高度变体）、无油箱版本和盖子机架版本。为3D打印提供了独立组件（如底座储液槽、柱座层、滤芯柱层和盖子）。请点击这里下载此文件。

补充文件2：支持数据和方法。 该文件集包含离心机兼容性表、详细的交叉污染测试程序、原始DNA产率数据集以及与污染分析相关的PCR仪器输出文件。请点击这里下载此文件。

补充图S1：基础机架版本（完整组装）。 完整组装基础机架配置的高分辨率图像，展示了整体结构和组件排列。请点击这里下载此文件。

讨论

该方案解决了许多分子生物学实验室中的“通量差距”问题。虽然96孔滤板速度更快，但与单个自旋柱相比，其结合能力可能较低或最终浓度较低¹⁴。通过将标准离心柱改为板转子格式，该方法结合了柱的高产率与基于板式工作流程的速度。

机架在处理超过12个样本时最为有利。该方案的主要创新是采用24孔架，通过共享储存上清液和洗涤液，简化并加速了基于柱的核酸提取。使用机架时，执行14–116个样本所需的时间与2–12个样本相当。此外，操作员的工作量也减少了，因为移除单个管子、转移柱子、丢弃洗涤液和打开盖子等重复步骤被最小化。由于原始试剂盒组分（溶液和离旋柱）保持不变，预期DNA质量相当，且结果支持。

24孔机架的3D打印可用标准设备实现，但基础和迷你版本可能需要经验。无槽和盖架版本更为简单，且打印经验较少即可生产。熔融沉积建模的一个关键考虑因素是层间微缝的形成，这可能影响离心过程中的水密性。测试显示，100%填充、7毫米的储层壁厚和0.1毫米的层高能提供足够的防水性。加热打印床并进行表面平滑进一步提升了封闭性能。相比之下，使用环氧树脂或有机溶剂的打印后封闭方法效果不佳，因为离心过程中的变形会导致裂纹和泄漏。壁厚不足还可能导致结构失效和水密性丧失，进而导致离心机失衡。因此，建议对打印部件进行使用前测试。

这四种机架版本适用于多种带斗转子的离心机，允许用户根据设备和吞吐量需求选择最合适的配置。基础机架版本能提供最高通量，但需要更大的离心机和更高的打印质量。迷你版减少了离心机尺寸需求，但也降低了通量。无储罐版本简化了制造过程，并兼容常见的容器如移液器尖端盒，尽管兼容性取决于容器的几何形状。电容机架版本是最简单的配置，但不能与滤波列一起使用。

不结合核酸的过滤柱可能比标准结合柱更难^获得。如果没有这些，可能需要额外的澄清步骤，从而增加整体处理时间。或者，也可以使用滤液移液器（1000 μL）或二氧化钛协议。

提取架作为标准DNA提取工作流程的机械辅助^，不改变 缓冲液成分或柱状化学成分（除二氧化钛变体外）。因此，预计不会对DNA质量产生实质性影响，这与琼脂糖凝胶电泳和产率比较显示质粒形态和数量相较标准方法相近的结果一致。

尽管共用废物储层存在交叉污染风险，但在测试条件下未观察到此风险。一个关键设计特征是柱口的“烟囱”几何形状，保持柱尖与废液表面之间的隔阂。为保持这种分离，水库不应过度注满，建议每次完成流水后排空。

该方法的一个限制是摆斗转子的最大转速（通常为2000× 克）。虽然这对于包边和清洗步骤来说足够，但对于完全膜干燥来说，这种速度不足。因此，定角微离心机需要进行最后的高速离心步骤。尽管有这一额外步骤，超过24个样品的批次整体时间节省依然可观。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D打印机丝	NIT，俄罗斯	-	推荐PETG或PLA
Buffer N3	Qiagen，荷兰	19064
Buffer P1	Qiagen，荷兰	19051
Buffer P2	Qiagen，荷兰	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality，中国
Elution Buffer	Qiagen，荷兰	19086
Eppendorf离心机 5702	Eppendorf，德国	22626001	固定角转子
Eppendorf离心机 5804 R	Eppendorf，德国	22625080	摆篮式转子
Ethidium Bromide	Biolabmix，俄罗斯	EtBr-10
1000 μL滤管吸头过滤器	GenFollower，中国	E-FTB1000	过滤柱的一部分
无滤膜小型制备转杯	JVLAB，中国	-	过滤柱的一部分
Phenol Red	Lenreactiv，俄罗斯	200125
PrusaSlicer	Prusa Research，捷克共和国
QIAprep 2.0小型制备转杯	Qiagen，荷兰	27115
RNase A	Qiagen，荷兰	19101
洗涤液	Qiagen，荷兰	19065