一种用于悬浮T细胞和三维细胞模型中低量CRISPR基因组编辑与mRNA转染的数字微流控电穿孔平台

摘要

本方案描述了使用“DMF-ection”（一种数字微流控（DMF）电穿孔平台）对原代人T细胞中的TCRα/β受体进行微型化的CRISPR–Cas9基因组编辑。该方法可实现并行、低样本输入的高效基因编辑，并保持高细胞活力，还可进一步适用于将mRNA递送至多细胞3D球状体。

摘要

数字微流控（DMF）电穿孔技术能够在显著减少细胞用量（最多减少100倍）并保持高细胞活性的同时，实现对哺乳动物细胞的精确、低体积遗传操作。本研究展示了一种基于DMF的高通量转染工作流程，可用于CRISPR介导的原代人悬浮T细胞中TRAC位点的敲除，以及三维HEK293T球状体的mRNA转染。通过空间定位沉积的CRISPR向导RNA和在芯片上组装核糖核蛋白（RNP）复合物，仅使用每组10,000个细胞，即可在CD4⁺和CD8⁺ T细胞群体中实现高效的TRAC位点破坏，编辑后细胞存活率超过85%。通过流致扩散和泰勒扩散分析进行的生物物理表征表明，在电穿孔缓冲液条件下，聚合物添加剂可稳定Cas9–sgRNA复合物，从而支持在亚微升级体积下的可重复基因编辑。该工作流程进一步被优化用于三维应用，通过将EGFP mRNA递送至完整的HEK293T球状体，实现了强烈且空间分布均匀的荧光表达，同时不影响球状体的生长或形态。综上所述，这些结果表明，DMF电穿孔技术可高效实现悬浮免疫细胞和多细胞球状体的基因组编辑与mRNA递送。该平台为 CAR-T细胞治疗、功能基因组学以及先进的三维细胞模型等应用提供了可扩展且低样本输入的解决方案。

引言

原代人类细胞中的基因编辑在治疗开发和基础研究中正变得越来越重要，包括在免疫工程、罕见病建模和功能基因组学中的应用¹。尽管电穿孔技术能够实现高效的基因组编辑，但传统的基于比色皿的系统通常每个实验条件需要 多达数百万个细胞，限制了其在患者来源样本和稀有免疫细胞群体中的应用²。此外，由于通量、自动化程度和试剂消耗方面的限制，这些系统也不适合大规模筛选³。

微流控电穿孔已成为一种有前景的低样本量基因组编辑方法⁴。然而，大多数现有平台依赖于连续流动架构，涉及复杂的流体操作，试剂混合灵活性有限，且每实验条件所需的细胞数量相对较多。相比之下， 数字微流控 (DMF) 能够在平面电极阵列上主动操控离散的纳升级液滴，实现对反应组分、反应时间和空间定位的精确控制。这种即插即用的液滴式平台非常适合需要节约原代细胞和试剂的低体积、高通量实验流程⁵。

近期研究已证明，基于数字微流控（DMF）的三液滴电穿孔结构可用于细胞内递送，该结构可产生局部、低电流的电场，实现高效的核糖核蛋白（RNP）和信使RNA（mRNA）递送，同时最大限度地减少热效应和电化学应力

方案

本方案中使用的人源原代T细胞来自商业供应商，在供体知情同意下获取，并符合相关机构、伦理和监管规定。所有人源生物材料的操作均按照机构生物安全规程进行。实施本方案的研究人员有责任确保其使用人源原代细胞的行为符合当地机构审查委员会（IRB）或伦理委员会的要求、适用的生物安全法规，以及任何与人类生物材料使用相关的国家或地区法律法规。本研究中所用细胞材料未包含任何可识别患者身份的信息。

1. 初始人T细胞的制备与激活

1. 将冻存的原代人CD3⁺ T细胞在37 °C水浴中快速解冻。将细胞转移至预热的基础T细胞培养基中，于180 × g 离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于新鲜培养基中。
2. 使用自动细胞计数仪测定细胞浓度和活率。
3. 将细胞重悬于T细胞培养基中，调整密度为1 × 10⁶ 个细胞/mL，并添加可溶性四聚体抗体CD3/CD28 T细胞激活剂（按照试剂供应商说明书）以及200 IU/mL IL-2。于37 °C、5% CO₂条件下培养72小时。
   注意：激活期间维持细胞密度在0.5–2 × 10⁶ 个细胞/mL之间。使用U型底96孔板进行激活，以优化细胞与激活剂的接触及激活效率。

2. 在数字微流控基底上制备向导RNA点样（声波分配器点样....

结果

预期结果
每种条件下对 10,000 个活化 T 细胞进行电穿孔通常可导致 >85% TRAC 敲除效率与 >转染后72小时存活率为95%。流式细胞术显示TCR明显丢失α/β 在TRAC靶向条件下，相对于非靶向sgRNA对照（NTC）以及未施加任何电场的对照组，观察到染色情况的变化。除非另有说明，n代表在不同日期进行的独立DMF电转实验次数。来自同一芯片的多次技术重复在统计分析前已取均值，不单独计入n值。本文报道的所有T细胞实验均使用来自单一健康供体的冻存细胞进行。相同平台下不同供体间的变异情况将在后续进一步表征。⁹.

由于阴离子聚合物添加剂的存在，Cas9–sgRNA核糖核蛋白在电穿孔条件下的稳定性得到提升
数字微流控技术的一项核心设计要求是具备高度疏水的表面，以使液滴在电润湿过程中能够自由滑动。尽管这一特性对于液滴运动和精确操控至关重要，但它给试剂加载带来了挑战。在阵列筛选应用中，必须能.......

讨论

本方案描述了一种微型化的数字微流控电穿孔工作流程，可利用纳升级液滴实现向原代人T细胞的高效细胞内递送。该方法的一个核心优势在于，每个反应仅需10,000个细胞即可完成CRISPR–Cas9基因组编辑，与传统电穿孔相比，显著降低了材料需求。基于液滴的架构支持自动化，确保在多个平行位点上试剂操作和反应体系构建的可重复性。

在先前的研究中，将 DMF-ection 平台与一种广泛使用的系统进行直接对比表明，在每编辑 10,000 个细胞的条件下，传统核转染产生的 GFP 阳性 T 细胞不足 2%，而 DMF-ection 平台在相同低输入条件下实现了 >90% 的转染效率。对于包含 192 个条件的阵列式筛选，DMF 平台每个条件所需的细胞数量比传统方法少 25 倍，Cas9 用量约为传统方法的 50 分之一⁹。这些比较凸显了微型化数字微流控电穿孔技术在低输入量和高通量筛选应用中的材料优势

关键步骤与故障排除
多个步骤对成功至关重要.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 通道 VOYAGER 可调枪头间距移液器	Integra	4732	仪器设备
1× PBS	Gibco		流式缓冲液
96 孔板，Sphera 低吸附表面	Thermo Fisher	174927	类球体实验方案
96 孔圆底板	Sarstedt	82.1583.001	类球体实验方案
Alexa Fluor 647 抗人 CD4 抗体	Biolegend	357421	1:200 稀释，克隆号 A161A1
Attune 流式细胞仪	ThermoFisher		仪器设备
DMEM 培养基	Gibco	10564011	培养基补充剂—类球体培养
适用于 DMF 的缓冲液	DropGenie		转染
DropGenie 转染系统	DropGenie		仪器设备
Echo 声波移液器 650 系列	Beckman Coulter Life Scienes
Echo 认证的 384 孔低残留体积板	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		流式缓冲液
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS 荧光显微镜	ThermoFisher		仪器设备
胎牛血清	Gibco	16000044	培养基补充剂—类球体培养
Fida 1 仪器及 Fida Neo 480 nm 检测器	Fida Biosystems ApS		仪器设备
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T 细胞	ATCC		类球体实验方案
人 IL-2 重组蛋白	Peprotech	200-02 50ug	T 细胞培养基补充剂
人原代泛 CD3+ T 细胞	All Cells		外周血，冷冻保存，泛 CD3+ 辅助 T 细胞，阴性筛选
Immunocult CD3/CD28 激活剂	StemCell Technologies	10970	T 细胞激活培养基
Immunocult 扩增培养基	StemCell Technologies	10981	T 细胞激活培养基
Incucyte 活细胞分析系统	Sartorius		仪器设备
INTEGRA ASSIST PLUS 移液机器人	Integra	4505, 4 位竖直支架（货号 4521）	仪器设备
非靶向合成向导 RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE 抗人 TCR α/β 重组抗体	Biolegend	380805	1:200 稀释，克隆号 QA20B12
PE-Cy 7 抗人 CD8	BD Pharmingen	557750	1:200 稀释，克隆号 RPA-T8
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	培养基补充剂—类球体培养
聚-L-谷氨酸（PGA）	Sigma Aldrich	P4761-100MG	使用浓度为 100 mg/mL
Prism 版本 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		软件
sNLS-SpCas9-sNLS 核酸酶	IDT	10017687
类球体微孔板	Corning	3830	类球体实验方案
表面活性剂 F	DropGenie		转染—在 DMF 兼容缓冲液中以 1:20 比例使用，配制完整的转染缓冲液
TRAC 合成向导 RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红	Gibco	25-300-062	类球体实验方案