一个用于低输入CRISPR基因组编辑和mRNA转染的数字微流控电穿孔平台，应用于悬浮T细胞和三维细胞模型

摘要

该方案描述了利用“DMF-ection”——一种数字微流控（DMF）电穿孔平台——对原发性人类T细胞中TCRα/β受体进行微型化CRISPR–Cas9基因组编辑。该方法实现了并行、低输入的基因编辑，具有高存活率，并进一步适用于mRNA向多细胞三维球体递送。

摘要

数字微流控（DMF）电穿孔能够实现哺乳动物细胞的精确、低体积遗传操作，同时将细胞输入减少多达100倍，保持存活能力。本研究提出了一种高通量的基于DMF的转染工作流程，用于CRISPR介导敲除原级人类悬浮T细胞中TRAC位点，以及三维HEK293T球体mRNA转染。利用空间沉积的CRISPR导RNA和卡匣上的核糖核蛋白（RNP）组装，在CD4⁺和CD8⁺ T细胞群体中，每个条件下仅用10,000个细胞，实现了高效的 TRAC 位点破坏，后期编辑的可行性超过85%。利用流诱导和泰勒分散分析进行生物物理表征表明，聚合物添加剂在电穿孔缓冲条件下稳定Cas9–sgRNA复合物，支持亚微升体积的可重复编辑。该工作流程进一步适应三维应用，将EGFP mRNA送入完整的HEK293T球体，实现稳健且空间均匀的荧光，同时不影响球形生长或形态。这些结果共同表明，DMF电穿孔能够高效地在悬浮免疫细胞和多细胞球体中实现基因组编辑和mRNA的递送。该平台为CAR-T细胞疗法、功能基因组学和先进三维细胞模型等应用提供了可扩展且低投入的解决方案。

引言

基因编辑在原级人类细胞中日益成为治疗开发和基础研究的核心，包括免疫工程、罕见病建模和功能基因^组学等领域。尽管电穿孔使基因组编辑效率极高，但传统的基于库维特的系统通常每种病症需要多达数百万个细胞，限制了其在患者来源样本和罕见免疫群体中的应用².此外，由于吞吐量、自动化和试剂消耗的限制，这些系统不适合大规模筛选³.

微流控电穿孔已成为低输入基因^组编辑的有前景方法。然而，大多数现有平台依赖于连续流架构，涉及复杂的流体处理、试剂混合灵活性有限以及相对较高的单条件单元要求。相比之下，数字微流控（DMF）能够主动操作平面电极阵列上的离散纳米级液滴，从而实现对反应组成、时间和空间定位的精确控制。这种即插即用的液滴格式非常适合低量、高通量的工作流程，因为对初级细胞和试剂的保护至关重要⁵.

近期研究已证明基于DMF的细胞内递送可行性，利用三滴电穿孔结构产生局部低电流电场，高效RNP和mRNA递送，同时最小化热和电化学应力^6,7,8。在此基础上，开发了下一代DMF电穿孔平台，称为“DMF电插”，具备48个独立可寻址反应位点、全自动化兼容性以及可^扩展的9级弹匣制造（见图1）。DMF墨盒由底部PCB板和塑料顶板组成，中间由垫圈分隔，通过单一正确方向的对准卡扣组装（见图1A）。48 组布局分为八个相同的家族（图1A–H），每个家族包含六个独立可寻址的电穿孔位点，支持每个磁头最多48种并行编辑条件（见图1B）。导RNA文库在装配匣前使用声学分配器沉积到底物表面。所有48个站点均确认沉积位置精度，滴落位置偏离电极中点的亚毫米级偏移（见图1C），支持可靠的套筒内RNP组装。装载后，电池和液态电极液滴被驱动于卡匣上，形成三滴电孔几何形状（见图1D）。电穿孔后，细胞被卸入培养板中进行回收和后续分析，包括流式细胞术、测序和显微镜检查（见图1E）。该系统使得比标准基于库维特的方法少用多达100倍的细胞进行高效基因组编辑，显著扩大了基因组工程在低输入和高通量应用中的可及性。

本研究通过递送多种生物分子货物，包括mRNA和CRISPR–Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物，评估平台性能，实现高效的转染和基因破坏。除了原发T细胞外，DMF提取还提供了一个可推广的框架，将核酸输送到复杂的多细胞结构中。三维球体和类器官模型因其结构和脆弱性对试剂穿透造成重大障碍，而传统的电穿孔方法常常破坏形态或产生异质递送。为评估用于T细胞编辑的微型电穿孔原理是否适用于结构组织，DMF工作流程应用于三维HEK293T球体。这些实验表明，基于DMF的电润法可以温和地将完整球体置于三滴几何结构中，支持mRNA均匀递送，同时保持结构和生长。尽管这些结果超出了本文主要的T细胞方案，但它们展示了可编程DMF电穿孔在新兴三维细胞系统中与药物发现和疾病建模相关的更广泛应用性。

方案

本方案中使用的原发人类T细胞均在知情供体同意下，并符合相关机构、伦理和监管指南，从商业供应商处获得。所有人类来源生物材料的处理均遵循机构生物安全规范。实施本方案的研究人员有责任确保其初级人类细胞的使用符合当地机构审查委员会（IRB）或伦理委员会的要求、适用的生物安全法规，以及任何相关的国家或地区性人体生物材料使用相关立法。本研究所用细胞材料未关联患者可识别信息。

1. 原级人类T细胞的制备与激活

1. 在37°C的水浴中快速解冻原发人类CD3⁺ T细胞。将细胞转移到预热的基础T细胞培养基，并以180 ×克 离心10分钟。丢弃上清液，将沉淀液重新悬浮在新鲜介质中。
2. 使用自动细胞计数器测定细胞浓度和存活能力。
3. 将细胞以1×10⁶ 细胞/mL的T细胞培养基重新浮起，配合可溶性四聚体抗体CD3/CD28 T细胞激活刺激剂（根据厂商说明）和200 IU/mL的IL-2。在37°C、5%二氧化碳下孵育细胞72小时。
   注意：活化期间保持细胞密度在0.5–2×10⁶ cells/mL之间。在U底96孔板中进行激活，以优化细胞与激活剂的接触和激活效率。

2. 导RNA点的制备在DMF底物上（声学分配器点测）

1. 在无核酸酶水中将冻干的sgRNA重建至100 μM的库存浓度。在一个独立的管子中，在无核酸水中制备100 mg/mL的聚L-谷氨酸（PGA，钠盐，MW 15,000–50,000 Da）。将sgRNA和PGA库存以5：4体积比（sgRNA：PGA）结合，最终sgRNA浓度为55.6 pmol/μL，最终PGA浓度为44.4 mg/mL，适用于无核酸酶水中。短暂旋转并以1000 克 离心×30秒，分割为一次性体积，未用的分量在−80°C下储存最长6个月。
   注意：避免反复冻融循环。
2. 将导向-矿加混合液加入低死容声源板，安装在对应所需反应位点布局的阱中。
3. 使用校准声学分配器将40 nL（相当于2.2 pmol sgRNA）导向PGA混合物的导向-GPA混合物向DMF底物的每个靶点区域传递。
   注意：在55.6 pmol/μL时，40 nL每个位点可输出2.2 pmol sgRNA（55.6 × 0.040 = 2.22 pmol）。干涸的导轨在弹匣上液滴合并时会重新合成;通过各站点一致的编辑效率确认了完全的暂停。
4. 在生物安全柜中，让斑点滴在室温下完全自然风干，直到无可见液体残留（约5分钟）。
   注意：不要使用强制气流或加热，因为这可能会使导RNA脱落或降解。
5. 组装DMF卡带。
   1. 在生物安全柜中，将顶板与斑点基底对齐，方法是将顶板上的不对称塑料扣合特征与底板上的缺口对齐。沿短边均匀同时施加压力，直到感受到明显的机械断裂声，确认锁定功能完全啮合。
      注意：该弹药设计为单一正确方向;组装错误不会产生卡扣。始终握住基材边缘，以避免污染或损坏功能表面，并避免基材相互滑动，以免划伤表面涂层。
   2. 检查点：通过机械卡扣确认正确组装。
      注意：没有预运行的涂层完整性电气指示器;任何因组装不当导致的功能性失败都会被自动检测，并在运行后的质量控制报告中报告。
      暂停点：将未使用的组装烟弹与干燥剂（硅胶包）密封保存，室温保存最长48小时。

3. 细胞制备

1. 每次使用前，将DMF兼容的电穿孔缓冲液与提供的非离子界面活性剂以20：1（v/v）比例（电穿孔缓冲液：表面活性剂）结合，准备1毫升完整转染缓冲液，最终界面活性剂浓度为0.05%（v/v）。轻轻搅拌，保持冰镇。
   注意：此处使用的DMF兼容转染缓冲液为低导电率等渗缓冲液（电导率：3.5 mS/cm，渗透压：305 mOsm/L）。使用替代缓冲液的研究人员应验证其与DMF驱动和细胞存活能力的兼容性。生物相容性非离子表面活性剂起到减少液滴钉扎的作用;如果未使用提供的表面活性剂，则采用合适的替代剂。
2. 用无界面活性剂的转染缓冲液清洗活化T细胞一次。在180 × g 离心5分钟，抽取上清液，并将细胞沉淀重新悬浮于含表面活性剂的完全转染缓冲液中，浓度为1.0×10个⁷ 细胞/mL，总体积为每筒100微升。保持冰敷。
3. 在装入筒前，直接将Cas9核酸酶加入100微升T细胞悬浮液中，并通过轻柔移液混合;保持冰敷。
   注意：对于原发T细胞，Cas9的装载量为每100微升卡带42 pmol（0.42 pmol/μL）。每个电穿孔位点处理约1微升细胞悬浮液，每次编辑传递0.42 pmol的Cas9。适应其他免疫细胞类型时，优化该剂量（见 表1）。

组成部分	每次编辑的最终浓度
Cas9	0.42 pmol 在 ~1 μL 液滴中
sgRNA	2.1 pmol（来自40 nL点）
PGA	44.4 mg/mL 的点滴液高汤
界面活性剂	0.05% （v/v）
单元输入	~10,000个细胞

表1：每个转染滴最终浓度的汇总表。

4. DMF-ection 平台上的转染

1. 使用多通道移液器，分别向8个单元装载口中各注入10微升T细胞/Cas9混合物，向16个液体电极装载口注入10微升完整转染缓冲液（如 图 1所示）。
2. 将 电压 设置为 500伏，脉冲持续时间为3毫秒，脉冲数为2。按照平台说明启动电穿孔序列。
   1. 检查点：运行后立即查看赛后质检报告。零星性失败（<10%）无需干预。如果故障是系统性的，请用附带的质控板更换墨盒，运行系统健康检查（约2分钟），如果问题持续，请联系技术支持。

5. 编辑T细胞的卸载与恢复

1. 利用液体处理机，将每个反应位点的电孔细胞转移到96孔U底板，该板内含有150微升预热基础T细胞培养基，并补充200 IU/mL的IL-2。
2. 在37°C、5%二氧化碳下孵育细胞72小时，以促进蛋白质更新和表面受体表达变化。

6. TRAC 敲除的流式细胞术分析

1. 将细胞转移到无菌的96孔锥形底板上，以减少洗涤间细胞流失。用流式细胞术缓冲液（1×PBS，2% FBS，2 mM EDTA）在400 × 克 离心5分钟，并轻轻倒置锥形底板去除上清液，洗细胞两次。细胞仍会沉淀在板内。
2. 在厂商推荐浓度的流式细胞术缓冲液中，制备含有抗CD4、抗CD8和抗TCRα/β抗体的表面染色主混合液。每孔加入25微升主混合液，在4°C下避光下孵育20分钟。用1×PBS（不含FBS）在400× 克 离心5分钟清洗两次。将细胞以1：1,000（v/v）浓度在100微升含可行染料的1×PBS中重新浮起，并在室温下无光培养10分钟。
   注意：锥形底板对沉积细胞有效;检查所有步骤中细胞是否良好地重新浮起。
3. 用流式细胞术缓冲液洗细胞两次，并在每个样品中以150–200微升重新悬浮取样品。
4. 根据所用荧光色素配置合适的激光线和滤光片组（例如，活性染料的488 nm激发;表面标记的405 nm或488 nm，视情况而定）。使用单染色补偿控制和未染色样品设定电压。每个样本至少收集5000个活单重体事件。门控顺序在：散布单粒细胞→活细胞（活性染料阴性）→CD4⁺或CD8⁺→TCRα/β表达。
   注意：在标准条件下，在洗涤和染色过程中失去的样本中，样本获得的活事件总量可从5,000到超过10,000不等，前提是细胞已经有时间增殖。
5. 通过测量CD4⁺和CD8⁺群体中TCRα/β阴性细胞的频率，确定 TRAC 基因破坏。报告敲除效率为TCRα/β阴性细胞相对于活单重态门的百分比。

结果

预期结果
每种病况对1万个活化T细胞进行电穿孔通常能实现>85%的 TRAC 敲除效率，72小时后存活率>95%。流式细胞术显示，TRAC靶向条件下相较于非靶向sgRNA对照（NTC）及未暴露于任何电场的对照，TCRα/β染色明显减少。除非另有说明，n 代表在不同天进行的独立 DMF 运行。同一弹匣连续的技术重复在统计分析前进行平均，且不独立贡献于n。本文报道的所有T细胞实验均使用来自单一健康供体的冷冻保存细胞进行。进一步分析了使用同一平台的捐赠者间变异性，⁹.

通过阴离子聚合物添加剂，Cas9–sgRNA核糖核蛋白在电穿孔条件下的稳定性得到了提升
数字微流控的核心设计要求是高度疏水的表面，使液滴在电润湿过程中能够自由滑动。虽然这一特性对于液滴运动和精确驱动至关重要，但也为试剂加载带来了挑战。对于阵列筛查应用，用户定义的有效载荷库必须能直接存放在卡带表面。这使得试剂布局能够镜像用户的库设计，并确保数字微流控工作流程能够无缝执行阵列实验，无需额外的转移或人工干预。纳米分发器配合声学分配器非常适合此任务，因为它能以高位置精度在大型阵列上传输纳升体积，覆盖不同表面。然而，当液滴击中疏水弹壳表面时，常常会弹跳、结珠或无法均匀扩散，导致沉积和回收不均匀。这种变异在液滴中介于40 nL至120 nL的中等体积（见图2A，每项条件n=3，*** p值< 0.01），假设液滴的动能足够高导致回弹，但表面附着力不足以固定液体。因此，在更高有效载荷剂量下，直接沉积在弹匣上，若不需进一步修改，可能不可靠。为减轻这一影响，试剂中补充了生物安全聚合物聚L-谷氨酸（PGA）。PGA是一种可生物降解、带负电荷的多肽，广泛用作药物制剂中的稳定剂，且与活细胞工作流程兼容性极佳。带电主链被认为可以降低液滴接触角，促进更均匀的扩散，减少回弹并改善表面附着力。PGA存在后，沉积的荧光素体积随吸收率线性增长，且不同滤芯间的方差显著减少。统计分析证实，PGA在40、90和120 nL的斑点体积（***p < 0.001，****p < 0.0001）显著提高了复现性，而非常小的液滴（10–20 nL）则变化不大，因为在低动能下反弹较不明显。

接着，评估了DMF工作流程中使用的聚合物添加剂对电穿孔低体积缓冲条件下Cas9–sgRNA核糖核蛋白（RNP）行为的影响。为此，采用了流诱导色散分析（FIDA）技术。FIDA之所以被选中，是因为它能够精确测量流体动力学半径和结合亲和力，从而在实验环境中的缓冲条件下定量蛋白质-核酸相互作用。FIDA证明游离sgRNA的流体动力半径（Rh）为3.45±0.26纳米，符合一种小型单链RNA物种的特征。Cas9滴定后，RNP复合物的Rh为15.32±0.46纳米，结合亲和力为亚纳摩尔级（KD = 0.70 ± 0.14 nM）（见图2）。

为评估聚合物稳定作用，在RNP形成前向导RNA加入聚L-谷氨酸（PGA）。PGA的存在降低了Cas9与sgRNA之间的表观亲和力（K_D = 67.7 ± 9.5 nM），并使复合体尺寸缩小至约10 nm（右图2A ）。尽管亲和力降低表明配合物关联较为疏远，但更小且更均匀的_Rh 表明PGA阻止了过大RNP组装的形成（见图2B）。

随后，利用泰勒分散分析在电穿孔条件下评估RNP稳定性（见图2C）。在无聚合物情况下，Cas9–sgRNA混合物会产生宽广且拟合不良的泰勒图，表明聚集现象（见图2B）。相比之下，添加0.0025 mg/mL PGA则得到定义明确的单色散色散剖面（R² = 0.999），R_h ~ 9.6 nm。这些结果表明PGA防止聚集并提升RNP均匀性，从而支持可重复的纳米级电穿孔。这种稳定性为下游T细胞实验中观察到的高编辑效率提供了机制依据。

原发T细胞的剂量依赖编辑效率

尽管FIDA实验表明PGA降低RNP组装效率，但功能编辑结果受影响较小，因为电穿孔通常使用导RNA过多，而Cas9则多于Cas9。因此，PGA–RNP输入量评估了对TRAC位点原发人类T细胞敲除效率的影响（见图2D）。在四种唱头中，在40 nL（2.1 pmol）、20 nL（1.05 pmol）和10 nL（0.53 pmol）RNP输入下，编辑效率始终保持在>75–80%），CD4⁺ 和CD8⁺ 子集间差异极小。即使在5 nL（0.26 pmol）下，编辑依然稳健，尽管相比高剂量有适度的减少。在测试的最低剂量（2.5 nL，0.13 pmol）下，编辑效率显著下降，稳定在约~60% TRAC KO水平。对照组确认了编辑的特异性：无电穿孔井（0V）和离滤芯对照组（OCC）仅表现出背景敲除。在非卡匣对照组（OCC）CD8⁺群体中观察到的TCR阴性频率升高，很可能反映了激活后供体特异性TCR的基线下调，与电穿孔或基因编辑无关，因为这些细胞未接触卡带。这些结果共同表明，DMF-ection能够在纳米级RNP输入下实现CRISPR介导的高效编辑。值得注意的是，CD4⁺ 和CD8⁺ T细胞的编辑效果相当，凸显了该平台在T细胞亚群中的适用性，并表明RNP的使用量可以在不影响敲除效率的情况下减少一个数量级以上。

利用微型DMF分离高效破坏原级CD4⁺和CD8⁺ T细胞的基因
为更深入验证DMF脱离工作流的效果，CRISPR–Cas9介导的TRAC基因座敲除在原发人类CD4⁺和CD8⁺ T细胞中，每个条件下仅使用1万个活化细胞进行评估。纳入了三个实验组：TRAC靶向引导条件（TRAC KO）、用于考虑RNP递送非特异性效应的非靶向对照组（NTC）以及用于建立未处理、未操作细胞TCRα/β基线表达的非套筒对照组（OCC）。采用标准门控策略鉴定活单重体，随后检测CD4⁺和CD8⁺亚组及TCRα/β表达（见图3A）。通过40次独立电穿孔运行，在两个T细胞亚组中实现了 TRAC 基因座的高效基因破坏。在CD4⁺ T细胞中， TRAC 的敲除效率达到88.4±4.9%，而NTC为3.2±4.7%，OCC条件下为9.8±5.1%。CD8⁺ T细胞中观察到类似结果，TRAC KO达到89.8±4.2%，而NTC为4.2±7.4%，OCC为20.2±4.9%（见图3B，左）。值得注意的是，电穿孔在不同条件下未产生显著的细胞毒性。所有组的存活率均超过96%，TRAC KO（97.1 ± 1%）、NTC（96.8 ± 1%）和OCC（97 ± 1%）疾病间无显著差异（图3B，右侧）。这些数据共同表明，DMF电穿孔能够实现强健高效的TRAC破坏，同时在多次独立运行中保持细胞存活能力。原发人类T细胞来源于商业来源，获得知情供体同意，并符合机构和供应商的伦理指南。

数字微流控技术HEK293T球体的处理
接着，评估了数字微流控电穿孔工作流程在多细胞三维结构应用中的应用。空心HEK293T球体通过在低附着微板中每孔播种约100个细胞，并培养24小时以促进球状形成形成（见图4A）。成形的球体随后被收集、重新悬浮，并装入数字微流控筒进行电穿孔。处理后，球体卸入96孔板中进行下游成像和生长分析。

为了实现电穿孔后每孔平均回收一球体，故意在弹筒上装载过多的球体，以补偿搬运和转移过程中的材料损失。大约192个球体被重新悬浮在100微升的电穿孔缓冲液中，并装载到弹匣上。每个反应家族获得~9.3微升的悬浮液，相当于~18个球体，单个液滴含~1微升（每滴1–2个球体）。由于约有一半球体在弹药装填口内仍留有弹药，这种装填策略平均每个三滴电穿孔点能有~1个球体。

球体回收分析显示，电穿孔后每孔通常卸载0至1个球体，约对应每个反应族回收4至6个球体（图4B 左侧面板）。该回收率低于理论最大值，反映了洗涤过程中的损失、上清液吸入以及装载口球体滞留。这些损失归因于球体直径较小（~100微米）以及在悬浮中维持非单细胞结构均匀分布的固有难度。因此，一些球体分布不均，或未能进入三液滴区域。装载过多球体确保大多数电穿孔位点至少存在一个球体，从而实现下游分析的一致性，如对微流控卡匣中DAPI染色球体的显微镜成像所示（图4B，右面板）。进一步的工艺优化可能减少实现等效回收所需的球体数量。尽管有这些处理损失，该工作流程仍使完整球体能够温和地定位在三滴电穿孔几何结构中。

EGFP mRNA在HEK293T球体中的递送与可存活性
在电穿孔（每球体50 ng GFP mRNA）后，观察到EGFP mRNA高效地输送到HEK293T球体中。电穿孔后24小时进行的荧光显微镜显示，电穿孔球体中GFP表现稳健且空间均匀，而在0伏或非套筒控制条件下则未观察到可检测的荧光（图4C，左面板）。对每个球体面积的归一化平均荧光强度（MFI）定量分析证实，在测试的两个电穿孔参数组下均实现成功转染（图4C，中间面板）。具体来说，以500伏、2毫秒、2脉冲电穿的球体MFI为6.96×^10-5 ±3.50×^10-5;而以375伏、6毫秒、1脉冲电穿的MFI为5.05×^10-5 ±3.29×^10-5。在对照条件下（0±0）未检测到可测量的荧光。两种电穿孔条件均产生显著更高的荧光（p < 0.05），脉冲参数间无统计学显著差异。为评估电穿孔是否对球体生长或结构完整性产生不良影响，治疗后5天内每日测量球体直径。电穿孔球体表现出与未处理对照组相当的生长动力学，表明mRNA转染不会影响球体存活率或增殖能力（图4C，右侧面板）。这些结果共同证明，数字微流控电穿孔能够高效地将mRNA输送到完整的多细胞球体中，同时保持结构完整性和生长，支持将该平台扩展到三维细胞模型的可行性。

数据以均值±标准差表示。统计显著性通过单向方差分析结合Tukey事后修正确定，显著性阈值为p < 0.05。N个值代表独立的生物复制体（独立供体或独立的样本运行），如图中所述。

图1。DMF电穿孔平台架构与工作流程。（A） DMF弹药的照片。（B）组装后的48-plex墨盒布局注释示意图（中图），展示了八个相同族的（A–H）组织，每个族包含六个独立可定位的电穿孔位点，标注了液体电极加载端口、电池加载端口、阳极、阴极和纳米点区域（左侧插图）。关键特征包括装卸口、卸载口和装配卡扣，均有标注。该弹药通过将两片板以一个正确方向卡扣组装，直到感受到明显的机械啮合。右图：液体处理机分配图，显示装载口（红色）、卸货口（粉色）和目标区域（蓝色）的颜色编码位置。（C） 左图：显示声学分配在所有48个位置的位置精度（n = 48），滴落位置相对于电极中点（毫米）绘制。紧密的聚集确认了亚毫米沉积的精度。右图：代表性图片，显示细胞液滴在补水前（上方）和重新水化过程中，液滴在导向器所在处被往复移动以重新懸浮（下方，红色箭头）处。（D）离散电穿孔区域的俯视图，显示从（i）通过沉积导RNA来回输送液滴来补水，（ii）向阳极和阴极之间的电孔位点移动，细胞液滴与两侧液体电极液滴连接并脉冲， 以及（iii）在液体处理机回收前，将整个三滴水移动到卸载口。（E）端到端工作流程示意图。导RNA通过声学分配器沉积到卡带底材上。电池和有效载荷通过自动液体处理机准备并装载到弹匣上。电穿孔在DMF平台上进行。细胞被卸载到96孔板中，并转移到培养箱进行回收。下游分析则通过流式细胞术、显微镜、下一代测序或其他合适的读数进行。请点击此处查看该图的放大版本。

图2.聚合物补充剂对沉积和RNP组装的影响。 (A聚合物补充剂提升声学沉积的保真度。在四个独立试剂盒中沉积和重组后的荧光素吸收率，无论是否使用聚L-谷氨酸。在PGA存在下，中体积（40–120 nL）的方差会降低。
(B） PGA对Cas9–sgRNA组装的影响。FIDA亲和力结合曲线，测量PGA缺失（左面板）或有无（右面板）水动力半径（Rh）的曲线。游离sgRNA的Rh为3.45±0.26纳米，而Cas9滴定的RNP复合物大小为15.32±0.46纳米（Kd = 0.70±0.14 nM）。添加PGA会以浓度依赖性的方式减小复合体大小并减弱结合亲和力。加入0.005 mg/mL PGA后，游离sgRNA的Rh为4.31±0.07 nm，而Cas9滴定的RNP复合体大小为10.21±0.38 nm（K）_d = 67.7 ± 9.5 nM）。实验在含有0.05%Pluronic F-68的低电导率电穿孔缓冲液中进行。通过集成LED模块，荧光波段在480纳米波段被检测到。所有实验均采用永久涂层毛细管（Ø 75 μm，L = 100 cm）。为测试多阴离子聚合物对RNP组装的影响，PGA被添加到测定混合物中，浓度分别为0.0025 mg/mL和0.005 mg/mL。这些条件被选中用于模拟数字微流控、电润和电穿孔缓冲器所使用的范围。直接结合分析中，使用10 nM FAM标记的sgRNA作为荧光指示剂，靶向TRAC位点。通过CapMix测定法，Cas9核酸酶浓度增加（最高可达500 nM）以对指示剂进行滴定，以生成复杂形成的色散曲线。所有实验均在25°C下进行，每个数据点消耗40 nL指示剂和~12 μL分析物（Cas9）。实验顺序如下：（1）在3,500毫巴下用0.1%磷酸冲洗30秒;（2）在3500毫巴的测定缓冲液下冲洗30秒;（3）以3,500毫巴注入分析物，循环20秒;（4）以50毫巴注入指示器10秒;（5）在400毫巴尔下动员并用分析物测量180秒。流体动力半径通过利用在峰高一半处提取的峰宽和解离常数（K）计算_D）通过非线性回归拟合到1：1绑定模型确定。(CPGA对RNP稳定性的影响。利用500 nM Cas9核酸酶和50 nM FAM标记sgRNA进行的Cas9–sgRNA复合物的泰勒分散谱，结合PGA和PGA。在没有PGA的情况下，未观察到稳定复合物，这一点从大型聚集体的形成增加以及配合物信号随时间递减（左图）可见一斑。添加0.0025 mg/mL PGA后，得到定义明确的单分散泰勒图，聚集最小，测量为R。_h ~ 9.6 nm （R² = 0.999，右）。在标准电穿孔条件下（500 nM Cas9 + 50 nM sgRNA）下评估了复合物稳定性，无论是否使用0.0025 mg/mL PGA。样本在入口样品托盘中预混合并保持在4°C，注射间隔10分钟，持续数小时。实验顺序如下：（1）在3,500毫巴下用0.1%磷酸冲洗30秒;（2）在3500毫巴的测定缓冲液下冲洗30秒;（3）以3,500毫巴浓度注满分析物（分析缓冲液），持续20秒;（4）以50毫巴注入指示器10秒;（5）在400毫巴尔下动员并用分析物测量180秒。不稳定复合体形成通过形成大型聚集体（泰勒图中的尖峰）和信号递减表现出来。稳定复形通过拟合良好的单色散泰勒图（R）识别² > 0.99），以及 R_h 从拟合的剖面中提取数值。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3。TCR α/β敲除在原代人类T细胞中的效率和存活率。（A） 代表性流式细胞术门控策略，适用于活单重体、CD4⁺和CD8⁺ T细胞亚组，以及TCRα/β表达，在对照组（非靶向sgRNA）和实验性（TRAC sgRNA）条件下。在评估TCRα/β表面表达之前，细胞在FSC/SSC、单重体、存活率以及CD4⁺或CD8⁺群体上依序进行门控。 （B） 左图：CD4⁺和CD8⁺ T细胞子集的TCRα/β敲除效率，涵盖三种条件：TRAC KO、非靶向控制（NTC）和离弹控制（OCC）。CD4⁺：TRAC KO = 88.4 ± 4.9% （n = 40），NTC = 3.2 ± 4.7% （n = 24），OCC = 9.8 ± 5.1% （n = 18）。CD8⁺：TRAC KO = 89.8 ± 4.2% （n = 40），NTC = 4.2 ± 7.4% （n = 24），OCC = 20.2 ± 4.9% （n = 18）。右图：电穿孔后在所有条件下的可行性，采用单体检测。可行性：TRAC KO = 97.1 ± 1% （n = 40），NTC = 96.8 ± 1% （n = 24），OCC = 97 ± 1% （n = 18）。单个数据点以平均值和标准差表示。n代表跨多个弹匣和多天的独立电穿孔运行。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4。利用DMF连接高效地将mRNA输送到HEK293T球体中。（A）描述球状体形成和执行球状体转染过程的工作流程图。每孔装载100个HEK293T细胞，装入专用球状微板，培养24小时，形成直径100微米的球体。球状体（192）卸载并重新悬浮到100微升的转染缓冲液中。该悬挂系统在适当载荷下，以每系列9.3微升的容量装载到导向斑点DMF提取弹匣上。电穿孔完成后，样品被卸载到96孔板中进行下游分析。（B） 左：与手动移液分离滤芯对比，每家族卸载的球体数量。中图：三滴的荧光图像，较大的红方框勾勒出三角形，红色椭圆环绕球体。右图：荧光图像，显示装载端口和已加载的球体（蓝色圆圈）。（C） 左侧面板：电穿孔前完整HEK293T球体的明场图像，以及EGFP mRNA电穿孔后24小时球体的荧光图像，与0伏和离盒对照组进行对比。（D） 顶面板：在两种电穿孔条件下（500 V，2毫秒，2脉冲;375 V，6毫秒，1脉冲）下，平均荧光强度归一化为球面面积。电穿孔条件之间无显著差异，但所有电孔条件与0 V和离套管控制有显著差异（500 V 2 ms 2脉冲：6.955 × ^10-5 ± 3.502 × 10-5,375 V 6 ms 1 脉冲：5.045 × ^10-5 ± 3.294 × ^10-5,0 V：0 ± 0，离芯控制：0 ± 0（*p < 0.05）。图像采用FIJI图像处理软件¹⁰进行处理。（500 V，2毫秒，2脉冲：n = 6;375 V，6毫秒，1脉冲：n = 4;离弹控制：n = 3;0 V 控制：n = 3）。（D） 底板：电穿孔后球体直径，历时5天，跨条件。直径通过FIJI通过倒置显微镜以20倍率拍摄的相位约束图像进行测量。（500 V，2毫秒，2脉冲：n = 6;375 V，6毫秒，1脉冲：n = 4;离弹控制：n = 3;0 V 控制：n = 3）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

该方案描述了一种微型化的数字微流控电穿孔流程，能够利用纳米级液滴高效地将细胞内输送到原发人类T细胞。该方法的一个核心优势是每次反应只需10,000个细胞即可完成CRISPR–Cas9基因组编辑，相比传统电穿孔大大减少了材料需求。基于液滴的架构支持自动化，确保多个并行站点间的试剂处理和反应组装可重复。

以往研究中，DMF染色平台与广泛使用系统的直接基准测试显示，传统核分离在每次编辑10,000个细胞时GFP阳性T细胞产量低于2%，而DMF染色平台在相同低输入条件下实现了>90%的转染效率。对于192种条件的阵列屏，DMF平台比传统方法⁹少了25倍的单元数，每个条件的Cas9数量也减少了约50倍。这些比较凸显了微型DMF电穿孔在低输入和筛分应用中的材料优势

关键步骤与故障排除
成功的关键步骤有几个。声学液体处理机的精准校准确保导RNA精确沉积在滤芯基底上，这对于RNP组装的一致性至关重要。如果斑点不均匀或液滴未能附着在基底上，请确认导RNA混合物中PGA的浓度（最终5 mg/mL）是否正确，且声学分配器已针对特定的源板几何形状进行校准。中间体积（40–120 nL）上的斑点不均匀，最常见原因是液滴在疏水表面反弹;稍微提高PGA浓度或降低喷发高度可以解决这个问题。

在加载前保持正确的细胞浓度非常重要，因为密度的偏差会影响液滴形成并降低编辑效率。如果编辑效率低于75%，首先确认T细胞活化足够（在电穿孔前通过流式细胞术确认CD25和CD69上调），并确认Cas9和sgRNA在加载前立即结合，而非提前。

聚合物添加剂在电穿孔缓冲条件下稳定Cas9–sgRNA复合物中发挥重要作用¹¹。虽然PGA降低了名义上的结合亲和力，但其稳定作用提高了重复性，并防止纳米级体积的聚集。这代表了一个可调节参数，方便研究人员将工作流程调整到其他蛋白质-RNA复合物。

故障排除
液滴桥接失败
每次实验后，请回顾仪器运行后的质检报告。检测到电流缺失表示桥接失败，可能是由于液滴不足或熔断失败，系统会自动标记。受影响的网站无法在同一次运行中恢复。如果故障是零星的（<10%），则无需采取任何措施;将复制品分布在多个弹匣中以最大限度减少影响。如果故障是系统性的，运行质量控制板和系统健康检查，问题持续时联系技术支持。

sgRNA斑点不一致
分发后，目视确认所有预期的液滴均存在，中心位于电极边界内，且无卫星液滴。在导RNA混合物中加入PGA，以防止多重扩散。如果漏了水珠，请查看分配器运行报告，必要时重新配药。对于半月板形成不良，应保持每孔至少5微升，短暂旋转板材，并在平面上轻轻敲击。在不使用时，使用冰块并密封钢板以防止蒸发。

编辑效率降低
如果观察到编辑效率降低，应按以下顺序排查：（1）在使用 RNP前使用EGFP mRNA验证递送条件;（2）确认测得的QC电流与预期值一致;（3）滴定细胞密度、导RNA和Cas9浓度;（4）在装载前立即确认高细胞活性;（5）验证试剂完整性和储存条件;（6）确认读出方法适合细胞密度和目标。

将平台适应到替代细胞类型和模型
对于其他原级免疫细胞类型，如NK细胞或调控T细胞，电穿孔参数需要优化。细胞大小是决定膜渗透所需电场阈值的重要因素：较小的细胞需要更高的场强，而较大的细胞则在较低电压下实现渗透——这是电穿孔生物物理学中已有充分文献支持的关系。对于活化细胞类型小于活化CD3⁺ T细胞，起始应保持或略微增加电压（500–550伏），同时脉冲持续时间保持较短（2–3毫秒），以避免过多的热应力。对于较大的电池，电压降至350–400伏，并调节脉冲持续时间，不超过10毫秒。此外，供体层面的微观优化在电穿孔中很常见，健康供体细胞验证的参数可能无法直接转化为病变或患者来源的材料。来自血液恶性肿瘤、慢性感染或免疫缺陷的捐献细胞常表现出改变的生物物理特性，尤其是在处理非健康或临床样本时，应重新评估每个新供体的编辑效率和存活性。细胞存活率应在电穿孔后24小时和72小时评估，并反复调整参数。如果RNP递送效率降低×Cas9剂量也可能需要相较T细胞协议增加1.5–2。

对于更大或更密集的三维模型，如直径超过200微米的类器官，盒内垫片可能需要修改以适应更大的结构尺寸和扩散屏障。尝试此类应用的用户应考虑预解离外层细胞层以提高试剂穿透性，或依次施加多种脉冲条件。请联系通讯作者，获取关于如何调整液滴几何和脉冲参数以适应超过此处验证的100微米球面直径结构的指导。

翻译意义
这种工作流程的转化潜力不仅仅是简单的敲除。该平台已应用于原发T细胞中4 kb GFP构造体和功能性抗HER2 CAR的同源导向敲入，以及用于45靶点阵列的CRISPR筛选，识别出CD4⁺ T细胞耗竭9的新调控^因子。这些应用展示了临床相关原一细胞模型中从协议级优化到功能发现的路径。尽管如此，仍存在重要局限性：如测序、细胞因子分泌和 体内 植入等功能性结局未在当前方案中评估，且是治疗转化的必要下一步。此外，虽然平台支持每个卡带48个并行反应，但对于更大的屏幕，需要多卡式并行处理。

局限性
和任何微型化平台一样，应当承认某些实际限制。下游表型分析必须适应小反应尺度;流式细胞术采集可能需要额外的浓度步骤或复制孔的池化，以获得足够的事件计数。平台的电穿孔设置还可能需要针对对电场敏感度高的电池类型进行优化，用户应将已发布的参数视为起始点，而非普遍固定的数值。最后，在电穿孔后较长时间点进行正式的可行染色，未用于此处呈现的球状体工作流程;基于直径的生长追踪被用作结构完整性的替代测量方法，这也是未来表征的重要方向。

总体而言，DMF抽签是一种非病毒转染方法，为低输入高通量环境下的基因组编辑和mRNA递送提供了强大且灵活的方法。其与原发T细胞、结构化三维模型和自动液体处理的兼容性，拓展了细胞疗法工程、多病症CRISPR筛查和微型功能基因组学的可能性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	仪器
1x PBS	Gibco		流动缓冲液
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	球体协议
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	球体协议
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		仪器
DMEM Media	Gibco	10564011	培养基补充剂- 球体培养
DMF compatible buffer	DropGenie		转染
DropGenie Transfection System	DropGenie		仪器
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		流动缓冲液
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		仪器
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	培养基补充剂- 球体培养
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		仪器
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		球体协议
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T 细胞培养基补充剂
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		外周血, 冷冻保存, pan CD3+ 辅助 T 细胞, 负选择
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T 细胞活化介质
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T 细胞活化介质
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		仪器
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	仪器
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	培养基补充剂- 球体培养
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	用于 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		软件
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	球体协议
Surfactant F	DropGenie		转染- 在 DMF 兼容缓冲液中以 1:20 的比例使用, 制备完整的转染缓冲液
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	球体协议