本方案全面描述了一种可同时记录多个与记忆相关脑区中神经元和星形胶质细胞钙信号的方法，并展示了其在学习与记忆行为范式中的应用。
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本文内容
摘要
摘要
学习与记忆在很大程度上依赖于分布在不同脑区的神经元与星形胶质细胞之间的协调作用。星形胶质细胞通过调节突触传递和神经元兴奋性，参与记忆相关环路中信息的编码与巩固过程。星形胶质细胞与神经元在脑内各区域内部及区域之间的相关性，对于理解记忆与认知障碍至关重要。然而，在记忆行为过程中同时监测多个脑区的星形胶质细胞和神经元活动仍面临技术挑战。本文介绍了一种可在多个记忆相关脑区同时记录星形胶质细胞和神经元钙信号的方法。该策略结合了细胞类型特异性的双色遗传编码钙指示剂（GECIs）、多通道光纤光度系统以及同步化的行为追踪技术，实现了对内侧前额叶皮层（mPFC）、海马CA1区以及内侧内嗅皮层（MEC）中神经元和星形胶质细胞活动的实时监测。代表性结果表明，在物体识别任务期间，不同脑区和细胞类型之间存在协调的钙动力学变化。该方法为研究学习与记忆过程中星形胶质细胞–神经元相互作用提供了一个可重复且高效的实验框架。
引言
学习和记忆是基本的认知过程，涉及信息的获取、存储与提取，对适应性行为的形成至关重要。这些过程支撑着多种复杂功能，例如空间导航、物体识别、情境关联以及决策。此外，包括阿尔茨海默病、年龄相关性认知障碍和创伤性脑损伤在内的认知功能障碍疾病，均表现出记忆形成异常1,2,3。因此，要全面理解学习与记忆的神经基础，必须阐明不同细胞类型之间在信息编码和提取过程中，于脑区内部及脑区之间发生的动态相互作用。
传统上，记忆的形成被认为主要由神经元活动决定。然而，大量研究表明，星形胶质细胞在信息编码、巩固和提取过程中发挥着重要的调控作用。星形胶质细胞通过调节突触传递、调控神经元兴奋性、释放胶质递质以及提供代谢支持来实现这些功能4,5,6,7,8。星形胶质细胞与神经元之间存在动态相互作用，这种双向通信通常被称为"星形胶质细胞-神经元网络"9<....
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方案
所有动物实验均经第三军医大学动物护理和使用委员会批准（动物伦理批准编号：AMUWEC20230126），并依照第三军医大学《实验动物护理和使用指南》进行，以确保动物的伦理待遇。所用试剂和设备列于材料表中。
为确保实验人员的安全，所有涉及活体动物和病毒载体的实验操作均需穿戴防护服、无菌手套和口罩后进行。所有器械在使用前均经过彻底灭菌，实验台面在每次实验前后均用70%乙醇清洁。剩余材料根据机构的废弃物处理规定进行处置。所有试剂和设备的操作均应避免与皮肤或眼睛直接接触。
1. 动物准备与病毒处理
- 将4个月大的C57BL/6小鼠（雌雄均有）饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下 随意摄取 食物和水的获取
- 使用前立即将AAV5-GfaABC1D-GCaMP6f或AAV9-hSyn-jRGECO1a的分装样品置于0–4 °C冰上解冻。
- 将拉制的玻璃微量移液管（尖端直径 15–25 μm）连接至注射器，并安装在显微注射泵上。
- 将小鼠置于无菌手术台上，并使用70%乙醇对所有器械进行消毒。
2. 立体定位病毒注射
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结果
根据上述方案，对4月龄C57小鼠的mPFC、CA1和MEC区域进行了双色多部位光纤记录。在本研究中，我们采用两步病毒注射策略，依次引入两种指示剂。在本实验条件下，该策略可稳定、可靠地实施，所得表达模式与预期的细胞类型特异性启动子谱一致。
在第0天，将AAV5-GfaABC1D-GCaMP6f注射至三个脑区；在第14天，于相同坐标位置注射AAV9-hSyn-NES-jRGECO1a，随后立即植入光纤（图1）。经过3周的病毒表达后，在自由活动的小鼠中，同时记录其在开放场探索和新物体识别任务期间的星形胶质细胞和神经元钙信号。
为了验证病毒表达的细胞类型特异性，对所有三个脑区进行了免疫组织化学染色。共聚焦成像显示，GCaMP6f 荧光信号与星形胶质细胞标志物 S100β 存在强烈重叠，jRGECO1a 与神经元标志物 NeuN 也表现出显著的共定位（图 2A–C）。这些结果证实，本实.......
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讨论
本研究建立了一种方法，可在小鼠学习与记忆相关行为过程中，同步记录多个与记忆相关脑区中星形胶质细胞和神经元的钙活动。与单脑区成像28或电生理技术不同，多脑区同步记录能够捕捉分布式的记忆网络之间的协调动态，因而成为研究学习与记忆的有力工具9,29,30。该方法结合细胞类型特异性的双色基因编码钙离子探针（GECIs）、多通道光纤光度系统以及与行为同步的数据采集技术，实现了跨脑区和细胞类型的群体活动的长期稳定记录。该平台可用于绘制参与学习与记忆行为的星形胶质细胞–神经元环路中不同空间范围内的功能连接图谱。
共注射已被报道为一种实用的方法，可协调荧光指示剂的表达时间进程31,32。在本研究中，我们采用了一种顺序式的两步病毒注射策略，作为与实验流.......
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披露
作者声明不存在任何利益冲突，无论是经济方面还是其他方面。
致谢
感谢楼佳女士提供的技术协助，以及Sai Te Xin Si（AI工具）在语言编辑方面提供的帮助。本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：82371485、82588301、32400932）和中国重庆市自然科学基金（项目编号：CSTB2024NSCQ-JQX0024、2024NSCQ-MSX1104）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 75 RN 5 μL 注射器（无针头） | Hamilton | 7634-01 | 连接微量移液器以进行病毒注射 |
| AAV5-GfaABC1D-GCaMP6f | Addgene | 52925 | 星形胶质细胞特异性 GCaMP6f 表达 |
| AAV9-hSyn-NES-jRGECO1a | Addgene | 100854 | 神经元特异性红移钙离子指示剂 |
| Bepanthen 眼鼻软膏 | Bepanthen | MA0008 | 防止角膜干燥 |
| 带陶瓷套管的光纤束 | Inper | BFO-1x3-W1.25 | 将植入式光纤连接至光度测量系统 |
| 相机 | 心灵之眼 | MV-SUA502C-T | 与钙信号同步的行为视频 |
| 牙科粘固剂 | NISSIN | Super-Bond C&& B | 用于将套管固定在颅骨上 |
| 套筒夹持器 | Inper | SCH-1.25 | 在植入过程中牢固固定陶瓷套管 |
| 异氟烷蒸发器 &和麻醉系统 | RWD生命科学 | R510-29 | 用于麻醉诱导与维持 |
| 多通道光纤光度系统 | RWD生命科学 | R821 | 用于双色记录 |
| OFRS 软件 | RWD生命科学 | 分析记录的钙信号 | |
| 光纤 | RWD生命科学 | R-FOC-BL200C-39N | 植入目标脑区 |
| 立体定位仪 | RWD生命科学 | 68801 | 用于精确的病毒注射和光纤植入 |
| 注射泵 | KD Scientific | 788130 | 以可控速率递送病毒 |
| 组织胶 | 3M 动物护理产品 | 1469SB Vetbond | 用于切口闭合 |
参考文献
- Eichenbaum, H. Memory: Organization and Control. Annu Rev Psychol. 68, 19-45 (2017).
- Kamatham, P. T., Shukla, R., Khatri, D. K., Vora, L. K. Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics for Alzheimer’s disease: Breaking the memory barrier. Ageing Res Rev.....
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