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使用反射光检测脂肪基质血管组分中的衰老现象

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DOI：

10.3791/70588

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2026年6月5日

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

本文内容

摘要

本方案介绍了利用反射光共聚焦显微镜对从人脂肪组织中分离的基质血管组分进行衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的客观、单细胞水平检测。该方法可与免疫细胞化学染色兼容，包含pH对照以实现定量评估，并且相较于传统的SA-β-gal染色，具有更高的灵敏度和更低的主观性。

摘要

细胞衰老是一种应激诱导的状态，其特征是永久性的细胞周期停滞以及特异性分泌谱的形成，进而影响组织功能，并促进衰老和代谢性疾病的发生。衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性被广泛用作衰老细胞的标志物；然而，传统的SA-β-gal检测方法通常依赖主观的视觉评估，且提供的定量信息有限。这些局限性在来源于脂肪组织的基质血管组分（SVF）等原代人类细胞群体中尤为明显，因为SVF包含前脂肪细胞、免疫细胞和内皮细胞等多种异质性细胞。本文介绍一种优化的反射光共聚焦显微镜方法，用于高分辨率、定量检测人SVF细胞中的SA-β-gal活性。该方案可实现对SA-β-gal活性的客观单细胞分析，允许同时进行免疫细胞化学染色以多重检测其他衰老相关或谱系标志物，并包含pH匹配的对照。通过整合上述特点，该方法为研究异质性原代人类细胞群体中的细胞衰老提供了一种灵敏、可重复且定量的手段，是对传统SA-β-gal染色方法的改进替代方案。

引言

细胞衰老是一种多方面的应答反应，可由多种应激引发，包括DNA损伤、端粒缩短以及癌基因激活。它导致细胞周期出现稳定的阻滞，并部分通过诱导抗凋亡蛋白的表达而增强对凋亡的抵抗能力1,2。在需要维持组织完整性的环境中（如组织修复与维持），细胞衰老已被证实有助于提高细胞存活率3,4。除了在组织稳态中的作用外，细胞衰老还通过调控胚胎模式形成参与正常发育5,6，并通过促进受损或潜在恶性细胞的清除，发挥抑制肿瘤形成的作用7,8,9。尽管细胞衰老具有多种有益功能，但多项研究也揭示了其另一面：衰老细胞可获得一种促炎性分泌表型，可能扰乱局部代谢、损伤周围组织，甚至促进肿瘤进展10,11,12,13。

衰老现象已在多种组织的多种细胞类型中被检测到，通常与衰老、疾病、组织功能障碍或癌症相关。在肝脏中，肝星状细胞的衰老已被证明可通过分泌因子改变代谢稳态，从而促进肿瘤进展14,15。针对肝细胞16或整个肝脏活检组织的研究17表明，这些细胞中的衰老可导致代谢性合并症，例如代谢功能障碍相关性脂肪性肝病和代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎。此外，过去十年中，2型糖尿病与细胞衰老之间的关系受到广泛关注，已有证据将细胞衰老与胰腺β细胞、肝细胞16以及脂肪细胞18,19,20,21中的糖尿病相关并发症联系起来。这些发现凸显了在代谢组织中准确识别衰老细胞的重要性，因为这些细胞的积累及其异质性会促进疾病进展并影响治疗靶向性22。

与衰老相关的信号通路和蛋白质表达变化通常具有细胞类型和组织特异性；然而，衰老细胞普遍存在若干共同特征。其中应用最广泛的标志物之一是pH 6.0条件下β-半乳糖苷酶活性的升高，称为衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）23。β-半乳糖苷酶是一种存在于所有细胞中的溶酶体水解酶，通常在酸性pH（约4.5–5.0）下具有活性，参与糖基化底物的降解。SA-β-gal的特征在于其在非最适pH条件下仍能保持β-半乳糖苷酶活性。在经典检测方法中，细胞在pH 6.0条件下与合成底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-gal）共同孵育，此时大多数细胞中酶活性降低，但在衰老细胞中仍可检测到活性。这会导致形成不溶性蓝色沉淀，可在显微镜下观察到24。

尽管该检测方法已被广泛采用，但对X-gal沉淀的检测传统上依赖于明场显微镜。明场检测依赖于对蓝色沉淀物的视觉识别，因此对于低水平信号和早期衰老状态的检测灵敏度有限。相比之下，反射光成像可捕捉X-gal沉淀物的光密度，从而在更宽的动态范围内实现定量检测。最近，已开发出荧光原性底物以提高检测灵敏度25。然而，这些方法通常在不维持SA-β-gal经典的pH依赖性定义的条件下测量β-半乳糖苷酶活性。因此，它们可能增强信号强度，但会降低对细胞衰老的特异性。相比之下，X-gal沉淀物固有的不透明性使其能够通过共聚焦反射光成像进行检测，在保持SA-β-gal原有酶学定义的同时，提供更灵敏且可定量的读数26。

多年来，人们已鉴定出衰老的其他特征，包括细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 P16 和 P21 的表达升高，以及转录因子 P53 的上调，后者调控细胞周期阻滞及其他衰老相关程序27,28,29,30,31,32,33。这些进展促使人们对衰老的定义更加完善，通常根据多种标志物的共同存在来对细胞进行分类。然而在实际操作中，这些标志物往往通过不同的检测方式来测定：细胞核标志物（如 P16 和 P21）通常采用基于荧光的技术进行检测，而 SA-β-gal 活性则传统上通过明场显微镜进行评估。这种分离限制了在同一细胞内同时评估多种衰老特征的能力。反射光成像技术克服了这一局限，通过在单一成像流程中直接整合 SA-β-gal 检测与基于荧光的标志物检测，从而有助于在异质性细胞群体中更可靠且更具生物学意义地评估细胞衰老状态。

尽管Dedic及其同事解决了传统SA-β-半乳糖苷酶成像的若干局限性，包括提高了灵敏度、采用pH匹配的对照以实现客观阈值设定，以及与免疫细胞化学的兼容性，但其反射光共聚焦方法专门针对 分离的成熟脂肪细胞26进行了优化。然而，脂肪组织中的衰老并不仅限于脂肪细胞34,35，通过分析 基质血管组分（SVF） 还可获得进一步的认识。SVF包含前脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞群体，以及多种免疫细胞，这些细胞均可能发生衰老，并参与脂肪组织重塑、炎症反应及代谢信号的改变。因此，表征这一异质性组分中的细胞衰老对于将 特定细胞类型的过程 与 组织层面及 系统性结局相联系具有重要意义。

在此，我们将反射光SA-β-半乳糖苷酶检测技术扩展至SVF细胞，使其可应用于多种脂肪组织细胞类型。通过将该方法与免疫细胞化学相结合，可在原代人源样本中实现SA-β-半乳糖苷酶活性与细胞谱系及功能标志物的整合性单细胞分析。

方案

所有实验均遵循《赫尔辛基宣言》的规定进行。本研究已获得斯德哥尔摩地区伦理委员会批准，批准号：DNR 2012/50-31。

1. 细胞准备

  1. 采用胶原酶消化法从人脂肪组织中分离获得基质血管组分（SVF）细胞。
    ​注意：细胞得率因活检组织大小和组织成分而异；但通常每10 g脂肪组织可获得约1.0 × 106个SVF细胞。

2. X-gal 染色与玻片制备

  1. 在1.5 mL微量离心管中，加入1 mL 2%多聚甲醛（PFA），于室温（RT）在摇床上固定细胞20分钟。
  2. 以600 × g离心10分钟，弃去上清液。
  3. 根据生产商说明书，使用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒配制X-gal染色液。
  4. 将染色液分装至3个离心管中（每管1 mL），分别用1 M HCl和1 M NaOH调节pH至5、6和8。使用校准后的pH计测量pH值。
  5. 将X-gal溶液加入含0.5 × 106个细胞的样本中，于37 °C孵育24小时，无需CO2环境。
  6. 以600 × g离心10分钟，弃去上清液。
  7. 用PBS（pH 7）洗涤细胞，于室温在摇床上洗涤10分钟，重复3次，每次均以600 × g离心10分钟后弃去上清液。
  8. 在5%正常驴血清（NDS）中配制一抗溶液（CD31 [1:200] 或 IgG对照 [1:333]），4 °C孵育过夜。
  9. 在PBST（0.1%）中于室温摇床上洗涤细胞3次，每次10分钟。
  10. 在5% NDS中配制二抗溶液（抗小鼠Alexa Fluor 555 [1:500]）和麦芽凝集素（WGA [1:200]），于室温在摇床上孵育1小时。
  11. 以600 × g离心10分钟，弃去二抗染色液。
  12. 在PBST（0.1%）中于室温摇床上洗涤细胞3次，每次10分钟。
  13. 以600 × g离心10分钟，弃去上清液。
  14. 将细胞重悬于抗荧光淬灭封片剂中。
  15. 将细胞悬液滴加至显微镜载玻片上。
  16. 于室温静置过夜，使封片剂固化以固定细胞。
  17. 加入100 µL 100%甘油，盖上盖玻片，并用指甲油封边。

3. 显微镜检查

注意：使用配置为检测反射光的共聚焦显微镜对细胞进行成像。应采用制造商提供的分光镜或二向色镜配置，在激发波长处或其附近收集反射光信号。所有实验均使用30×硅油物镜（数值孔径1.05）。

  1. 在显微镜软件中选择 T90/R10 分光镜设置。
  2. 使用 633 nm 激发光，并收集 635–645 nm 范围内的反射光。
  3. 使用 405 nm 激发光采集 Hoechst 信号。
  4. 使用 488 nm 激发光采集 WGA 信号。
  5. 使用 555 nm 激发光采集 CD31 信号。
  6. 将 Z 步进大小设置为系统最佳值（0.74 µm），并根据膜信号定义 Z 轴层扫范围，以捕获完整的细胞体积。
  7. 对所有样品使用相同的成像采集参数进行图像采集。以显微镜原生格式（例如 .oir）保存文件，且不进行压缩。

4. 图像分析

注意：使用 ImageJ 和 CellProfiler 分析图像。

  1. 在 ImageJ 中将通道分离，为每个通道（405、488、555、633）生成 Z-层叠图像。
  2. 使用Z轴投影（Z Project）功能生成总强度投影，并以16位TIFF文件格式导出。
  3. 将图像导入 CellProfiler（版本 4.2.8），用于自动细胞分割及每细胞反射光强度的定量分析补充图1 和 补充图2).
  4. 将强度测量值导出至电子表格以进行后续分析。

5. SA-β-半乳糖苷酶染色评分

  1. 将SA-β-gal阳性的阈值定义为pH 8条件下平均反射光强度加上三个标准差。
  2. 将pH 6条件下光强度值高于此阈值的细胞归类为SA-β-gal阳性。

结果

人SVF细胞在三种pH控制条件下进行反射光SA-β-半乳糖苷酶染色，呈现出清晰且可重复的染色模式。同时加入CD31染色以鉴定SVF中的内皮细胞，从而将这些细胞与其他细胞群区分开来。尽管CD31阳性细胞数量较少，但该标志物证实了内皮细胞的存在，并表明该方法适用于异质性的原代样本。

pH 5 条件下，大多数细胞产生了强信号，与酸性 pH 下内源性 β-半乳糖苷酶的高活性一致（图 1Aa–Ac）。在用于评估 SA-β-gal 活性的 pH 6 条件下，染色强度较 pH 5 时降低，仅有部分细胞的信号高于背景水平（图 1Ba–Bc）。信号强度和出现频率的这一变化与该检测方法预期的 pH 依赖性一致，从而能够识别在非最优条件下仍保留 SA-β-半乳糖苷酶活性的细胞。pH 8 条件下产生的反射光信号极弱，大多数细胞的信号接近或处于背景水平（图 1Ca–Cc）。该条件被用于确定 SA-β-半乳糖苷酶阳性的阈值，如 图 1Ac、Bc、Cc 中红色虚线所示。

对于定量分析，SA-β-半乳糖苷酶活性的阈值被定义为pH 8条件下反射光强度的平均值加上三个标准差。在pH 6条件下，光强度超过该阈值的细胞被归类为SA-β-半乳糖苷酶阳性。该方法提供了一个客观的、基于数据的截断值，可校正背景信号并最大限度地减少假阳性分类。

为评估检测灵敏度及其与免疫细胞化学的兼容性，在所有pH条件下比较了反射光成像与明场成像的效果。在pH 5时（图2Aa–Ad），反射光成像显示出强烈的X-gal沉淀，而明场成像仅能检测到最显著的沉积物。在pH 6时（图2Ba–Bd），反射光成像可识别出SA-β-gal阳性细胞，而这些细胞在明场成像中信号微弱或弥散，难以可靠检出。在pH 8时（图2Ca–Cd），反射光成像仅检测到极微弱的信号，与低酶活性一致，而明场成像则未显示出可检测的沉淀物。这些结果表明，反射光成像在检测X-gal沉淀方面具有更优的灵敏度，尤其在中等及低活性水平下表现更为突出。

反射光SA-β-半乳糖苷酶检测也在96孔板中进行（补充图3）。该设置因塑料表面的反射导致背景信号增强，从而降低了阳性与阴性细胞之间的对比度。表面缺陷（如划痕）进一步增加了背景反射（补充图3，黑色箭头）。因此，与在玻璃盖玻片上成像相比，定量分析的可靠性较低。如果必须使用板式格式，建议采用玻璃底板以实现最佳信号检测。

综上所述，这些结果显示出明显的区分：pH 5 条件下呈强阳性，pH 6 时信号处于中间水平，而 pH 8 时背景信号极低。该模式与实验的预期行为一致，支持利用反射光成像技术在异质性原代细胞群体中检测 SA-β-gal 活性。

pH 5-8 条件下 WGA 反射光显微图像系列，右侧定量图显示光强度。
图 1：SVF 细胞中 pH 依赖性反射光 SA-β-gal 检测。
WGA（Aa, Ba, Ca）与反射光成像（Ab, Bb, Cb）用于检测 pH 5、6 和 8 条件下的 X-gal 沉淀。信号在 pH 5 时最强，在 pH 6 时减弱，在 pH 8 时最弱。反射光强度的定量分析（Ac, Bc, Cc）显示了每种条件下 β-半乳糖苷酶活性的分布情况。每个点代表一个单独的细胞，红色虚线表示用于分类 SA-β-gal 阳性细胞的阈值。请点击此处查看该图的放大版本。

pH 5-8 条件下的荧光显微镜图像，显示 WGA、CD31、反射光、明场分析，比例尺为 20µm。
图 2：SVF 细胞中反射光与明场 SA-β-gal 检测的比较。 在 pH 5、6 和 8 条件下对 X-gal 染色的 SVF 细胞进行放大成像，分别显示 WGA 染色（Aa, Ba, Ca）、CD31 染色（Ab, Bb, Cb）用于识别内皮细胞、反射光成像（Ac, Bc, Cc）用于检测 X-gal 沉淀物，以及相应的明场图像（Ad, Bd, Cd）。反射光成像可在不同条件下均检测到 X-gal 沉淀物，而明场成像主要显示高强度沉积物，在信号较弱时检测能力有限。在 pH 5 和 pH 6 条件下均可观察到 CD31 染色，从而可识别内皮细胞。 请点击此处查看该图的高清版本。

补充图1： CellProfiler 分析流程概览。请点击此处下载该文件。

补充图2：细胞核与细胞分割的工作流程。 代表性图像显示了（A）Hoechst染色的细胞核，以及（B）对应的细胞核分割结果。（C）基于膜染色的细胞分割。（D）细胞核与细胞边界的叠加图。请点击此处下载该文件。

补充图3：在塑料底96孔板中进行的反射光SA-β-半乳糖苷酶成像。（A）WGA染色和（B）在标准塑料底96孔板中X-gal染色的SVF细胞的反射光成像。与在玻璃表面成像相比，背景信号增强，这与塑料表面的光反射一致，会降低SA-β-半乳糖苷酶检测的对比度。表面划痕（黑色箭头）进一步增加了背景信号（B）。请点击此处下载该文件。

讨论

衰老相关β-半乳糖苷酶是鉴定衰老细胞最常用的标志物之一；然而，传统的明场检测方法受限于灵敏度低和主观性较强。通过对X-gal染色的SVF细胞进行反射光成像，可更灵敏且可重复地在单细胞水平检测SA-β-半乳糖苷酶活性，同时仍兼容荧光抗体染色。通过针对SVF优化该方法，可在无需细胞分选的情况下，联合检测SA-β-半乳糖苷酶活性与CD31等细胞特异性标志物，从而实现对异质性原代细胞群体的分析。

多个技术参数对于可靠实施至关重要。X-gal染色液的准确pH校准尤为关键，因为微小的偏差都可能改变酶活性并影响信号检测。使用前应立即用标准缓冲液（如pH 4.0和pH 7.0）校准pH计，并在染色液配制完成后验证其pH值。此外，Z轴层扫采集必须覆盖完整的细胞体积，否则会导致反射光强度被低估。成像参数（包括激光功率和探测器增益）应优化至在无信号饱和的前提下获得最大信号，并在所有样本间保持一致。

与其它衰老检测方法相比，反射光成像具有多项优势。明场SA-β-gal检测依赖于对沉淀物的视觉识别，因此灵敏度有限，且难以与多重分析兼容。相比之下，反射光成像可检测X-gal沉淀物的光密度，同时保留SA-β-gal的pH依赖性酶学定义。这使得SA-β-gal活性能够与基于荧光的标志物同时检测，从而可在单个细胞内利用多种特征评估细胞衰老状态。

尽管该方法具有上述优势，但仍存在局限性。反射光成像检测的是X-gal沉淀物的光密度，但无法明确区分该信号与其他致密的细胞内结构，因此必须严格控制pH条件。pH 8的条件可提供反射光背景信号的基线水平，有助于特异性信号与非特异性信号的区分。该方法还需要配备适当反射光检测功能的共聚焦显微镜，而并非所有系统都具备此配置。此外，成像表面的性质可能影响信号质量：塑料底培养板因反射增加背景信号，降低对比度，而玻璃表面则可提供更可靠的检测结果。

该方法基于 Dedic 等人的研究，后者建立了利用反射光成像检测成熟脂肪细胞中 SA-β-gal 的技术，并将此方法拓展至更广泛的细胞类型26。应用于 freshly isolated SVF 的结果显示，X-gal 沉淀物的反射光检测与多种原代人类细胞群体相容。将 SA-β-gal 检测与 CD31 等谱系标记物结合，可进一步实现对异质组织内特定亚群的分析。

尽管在原代人源样本中预期存在供体间的差异性，但本研究的目的是建立该方法的技术实施方案，而非表征生物学变异性。未来在多种生物样本或实验条件下应用该方法时，应纳入适当的统计学分析。此外，在已建立的细胞衰老诱导模型中进行验证，并结合正交的衰老标志物进行整合分析，将有助于进一步优化对复杂细胞群体中SA-β-gal活性结果的解读。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢Liv Eidsmo和Keira Melican提供人类组织活检样本，感谢Lena Appelsved在样本处理方面的协助。本研究获得了以下资助：瑞典研究理事会（2022-01236）、卡罗林斯卡学院糖尿病战略研究计划（C5471162）、诺和诺德基金会（C5475033）、瓦列基金会学者奖（C5471234）、马克基金会Aspire资助（C5477023）、瑞典癌症协会（22 2420）、卡罗林斯卡学院干细胞与再生战略研究计划（C5472022）以及克努特和爱丽丝·瓦伦堡基金会（2020.0118；2023.0536）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管BioSphere72.706.200Biosphere safeseal 1.5 mL 离心管，250 个/包
5 mL 离心管Eppendorf30119401Eppendorf 离心管 5.0 mL 微量离心管
96 孔板Corning4680Corning 96 孔高内涵筛选微孔板，带膜底
CD31 一抗AbcamAb9498抗 CD31 抗体，克隆号 JC/70A
具备反射光功能的共聚焦显微镜EvidentFV-4000
盖玻片EprediaBB02400500A113MNZO盖玻片 24 mm × 50 mm，#1.5 厚度（0.13–0.16 mm） 
DPBSGibco14190-136DPBS，无钙，无镁
固定缓冲液Sigma Aldrich1.00496.50004% 甲醛溶液，缓冲型，pH 6.9 
HClSigma-Aldrich320331-500mL盐酸（37%）
孵育箱StuartS130H杂交炉/摇床
显微镜载玻片Avantor VWR631-1560单面磨砂载玻片，彩色端
封片剂InvitrogenP36984ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂，激发/发射最大值 361/497 nm
小鼠 IgG1 同型对照R&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500G氢氧化钠 ≥ 98%
正常驴血清Jackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pH 计MeterLabR21M002 PHM210 标准 pH 计 
移液器吸头（1000 µL）Biosphere70.1186.2101250µL 带滤芯移液器吸头
移液器吸头（200 µL）Corning4823200µL 带滤芯移液器吸头
SABG 试剂盒Cell signaling9860S衰老相关 β-半乳糖苷酶染色试剂盒
二抗，Alexa Fluor 555InvitrogenA31570驴抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附，激发/发射最大值
553/568 nm
Tween-20Fisher Scientific10419000高纯度，Fisher Chemical
水浴锅Rowe ScientificSWB20D标准水浴锅
WGAInvitrogenW11261麦胚凝集素（WGA）Alexa Fluor 488 偶联物：激发/发射最大值 495/519 nm

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