用于禾本科植物-微生物互作研究的植物无菌培养系统组装与使用

摘要

本方案描述了一种新型植物无菌培养系统的组装与使用方法，该系统专为禾本科作物设计，并已在小麦和玉米中得到验证。该植物无菌培养系统通过提供无菌生长环境、灌溉管理以及与多种土壤基质的兼容性，实现了对植物-微生物互作实验的精确控制。

摘要

开发在田间条件下能够稳定发挥作用的微生物类农业改良剂，需要深入理解植物与微生物相互作用的分子机制。研究这些相互作用的内在机制，要求能够在环境可控且无菌（即与植物相互作用的所有微生物均为已知，无论是无菌状态、定义明确的微生物群落，还是天然群落）的条件下培养植物。目前可用的植物无菌培养系统并不适用于研究具有重要农业价值的大型植物，例如谷类作物。此外，大多数现有系统缺乏灌溉管理能力。本文介绍一种新型无菌培养系统GNOVA，该系统专为谷类作物设计，并具备灌溉管理功能。该新系统是一个易于获取的平台，由3D打印底座和市售材料组成。本实验方案提供了系统组装及实验设置的逐步操作指南。此外，我们还对GNOVA系统与传统的无菌袋系统进行了性能比较。在GNOVA系统中，小麦的植株生长期从袋系统中的两周延长至17周，玉米则从袋系统中的四周延长。两种作物在GNOVA系统中的发芽率也显著提高：小麦从66%提升至100%，玉米从75%提升至100%。在GNOVA系统中生长的小麦能够产生分蘖，而在相同生长期的袋系统植株中则未观察到分蘖现象。在GNOVA系统中生长的玉米鲜重比袋系统高出594%。此外，玉米的地上部分高度和根系长度在GNOVA系统中分别比袋系统高出89%和57%。GNOVA系统通过提供更大的生长空间和灌溉管理能力，扩展了科学家可用于研究谷类作物在苗期之后植物–微生物群相互作用的工具箱。

引言

基于微生物的农业处理方法在过去几十年中引起了广泛关注，因其具有通过促进植物生长和增强对环境胁迫的抗性来提高作物生产力的潜力。然而，这些生物刺激剂的作用分子机制仍不清楚，这可能导致其在不同土壤、地理位置和环境条件下的效果不一致^1,2。要提高现有基于微生物的处理方法的有效性并推动新技术的开发，就需要更深入地理解植物–微生物相互作用的分子机制^3,4。然而，由于天然微生物群落的复杂性，解析这些机制仍然具有挑战性^5,6。为了鉴定驱动植物获益的微生物效应因子及其相互作用，我们可以通过在可控环境条件和微生物群落的培养系统中使用合成微生物群落（SynComs），以降低天然系统的复杂性。无菌生物学（gnotobiology）是研究与已知微生物群落相关联的宿主的学科⁷，它使研究人员能够比较无菌宿主与定植了特定微生物群落的宿主，从而将微生物功能与植物表型联系起来⁸。

早期的无菌生物系统采用玻璃试管^9,10,11,12和广口瓶¹³构建。此后，用于植物无菌研究的新系统迅速发展。目前最常用的系统包括培养皿¹⁴、试管^15,16、玻璃罐¹⁷、Magenta盒¹⁸、密封袋¹⁹、水培系统²⁰、FlowPot和GnotoPot²¹、微流控系统²²以及EcoFABs²³。尽管取得了这些进展，大多数系统要么针对成像优化²²，要么针对分泌物收集^17,20，或专为小型模式物种设计^14,18,21。许多系统为封闭式，限制了灌溉控制和实验持续时间。这些限制对研究需要更多空间、空气流通和水分管理的大型农作物（如谷类作物）构成了挑战。

鉴于需要一种能够容纳更大植株并支持长期研究的系统，研究人员近期开发了EcoFAB 3.0，以将已知菌群栽培体系扩展至更大尺寸的植物²⁴。EcoFAB 3.0提供了更大的根部空间和顶空体积，可支持高粱（Sorghum bicolor）生长达4周，并支持根系分泌物收集和根部成像²⁴。尽管该新系统是将已知菌群系统拓展应用于农作物的有前景范例，但仍亟需一种易于获取且多功能的平台，能够被不同实验室广泛采用，并兼容多种实验流程。为此，我们开发了GNOVA（GNotobiotic system for Versatile plant Applications，适用于多种植物应用的已知菌群系统），该系统专为在已知菌群条件下培养谷类作物而设计。本文提供了GNOVA系统的详细组装与操作方案，并将其性能与本实验室常规使用的已知菌群袋系统进行比较。通过该新系统的开发，我们改进了小麦和玉米在无菌条件下的培养能力，相较于早期封闭系统，提供了更大的生长空间和内置灌溉功能。GNOVA的性能与EcoFAB 3.0相当，从而拓展了研究非模式谷类作物—微生物组互作的工具库。此外，由于GNOVA结构简单、采用商业化材料制造，并提供可获取的3D模型文件，研究人员可根据自身研究需求和预算灵活更换材料与设计，进一步增强了植物已知菌群技术的通用性与适应性。

方案

注意：底座的3D打印文件可在补充材料中找到，并在Dryad中公开提供（https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc）。为提高速度并降低成本，建议在当地商业3D打印服务机构批量打印。

1. 无菌系统组装

1. 启动培养钵组装（在重复实验使用前仅需执行一次）。
   1. 通过将不锈钢丝网圆片放置在聚碳酸酯管的一端，并用软管夹固定，以封闭培养钵底部（图1A）。
   2. 钻设灌溉孔：在聚碳酸酯管开口端顶部边缘下方1.5 cm处，钻一个直径为1/4英寸（6.35 mm）的灌溉孔；在距第一个孔3 cm处钻两个直径为1/8英寸（3.18 mm）的狭槽，其中一个狭槽距边缘1 cm，另一个距上方狭槽2 cm。
      注意：如有需要，可按照相同步骤在培养钵顶部边缘增加更多管路。
   3. 通过将一小段硅胶管插入1/4英寸的孔中，安装灌溉管路。
   4. 将扎带穿过两个1/8英寸的狭槽以固定管路（图1B）。将接头1的公鲁尔接头插入伸出培养钵外的硅胶管中（图1C）。
      注意：接头1的软管接头部分应外露。
   5. 准备注射器筒：将空注射器筒内填充玻璃 wool，并用一小片铝箔封闭末端（图1C）。
   6. 在注射器筒的鲁尔锁末端连接一小段硅胶管（图1C）。
   7. 制备两个相同的注射器筒。将其中一个已准备好的注射器筒连接到培养钵外部管路上外露的接头1软管接头上（图1D）。
   8. 暂停：组装好的培养钵可储存以供后续实验使用。

图1：培养皿组装示意图。 A) 培养皿底部用金属网和软管夹封闭。(B) 培养皿顶部边缘的灌溉口。(C) 灌溉管末端连接带有外露接头的接头1，并配有准备好的注射器筒。(D) 组装完成的培养皿及封闭的灌溉管路 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 实验用盆的准备（每次新实验前进行）
   1. 在盆底部铺上两个预先裁剪好的玻璃纤维管包裹圆片（图2A）。
   2. 将两份黏土与一份沙子混合，制备土壤基质。向盆中加入840 mL基质。
   3. 用塑料盖盖住盆口，并用胶带固定（图2B）。
   4. 将装好基质的盆在121 °C条件下干循环高压灭菌30分钟。盖上塑料盖，过夜冷却。再次在121 °C条件下干循环高压灭菌30分钟，然后完全冷却。保持盆口用塑料盖覆盖。
      注意：可使用其他土壤基质，但每盆所需用量应预先优化。GNOVA系统也已测试使用800 mL纯黏土和1 L纯沙的条件。其他土壤基质可能需要更多高压灭菌循环或不同的设置以实现完全灭菌。
      警告：从高压灭菌器中取出盆时需小心，材料温度较高，且软管夹可能松动。待冷却后，应确保软管夹已用手拧紧，再搬动盆体。
   5. 将冷却后的盆插入3D打印底座中。将装有土壤的盆放入3D打印底座内。操作时应握住盆的底部，而非开口处的支柱，因为支柱是最易损坏的部分。
   6. 将灌溉管穿过3D打印底座的一个下部开口（图2C）。
      注意：请勿对3D打印支撑底座进行高压灭菌，以免导致部件熔化。若实验需要高于60 °C的温度，可能需使用耐高温的替代打印材料（见材料表）。
   7. 高压灭菌后，将盆置于室温环境中保存，在最终实验组装前不要移除塑料盖或已准备好的注射器。

图 2：制备好的花盆示意图。（A）花盆底部衬有玻璃纤维管包裹材料。（B）花盆顶部用塑料盖封闭。（C）空花盆安装在最终设计的3D打印底座内。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 玻璃圆筒的准备（每次新实验前进行）
   1. 用预先裁剪好的DW4滤膜封住玻璃圆筒的一端，并用乙烯基胶带固定（图3A）。
   2. 将玻璃圆筒翻转，使另一端开口朝上，在距管口14 cm处将一个棉环固定于管内，使用医用胶带固定棉环（图3B）。
   3. 用灭菌包装材料封住圆筒底端，并用两根橡胶圈固定（图3B）。
   4. 使用前，将准备好的玻璃圆筒在121 °C条件下干热灭菌30分钟。灭菌后，将无菌玻璃圆筒在室温下保存备用，不要拆除包装材料。

图3：玻璃圆筒组件。（A）玻璃圆筒顶端用DW4滤膜和乙烯基胶带封闭。（B）玻璃圆筒底端装有棉环，并用灭菌包装材料和橡胶圈封闭。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 灌溉滤器的制备（每次浇水前均需执行此步骤，但步骤1.4.4–1.4.6仅需进行一次）
   1. 将PES滤膜（图4A.4）置于滤器底座（图4A.5）与滤片（图4A.3）之间，组装滤器底座。
   2. 将滤膜光滑面朝向流出方向，确保其面向滤器上盖（图4A.1）。
   3. 将O型圈（图4A.2）嵌入滤器上盖（图4A.1）中，然后将滤器上盖连接至滤器底座，仅用手拧紧即可。
   4. 安装接头。将接头2的公端滑入滤器上端口。
   5. 将一段短硅胶管连接至滤器上的软管接头（图4B）。将接头1的公鲁尔接头插入步骤1.1.6中准备好的另一支注射器筒末端（图4B）。
   6. 将滤器连接至已准备好的注射器筒上的软管接头。
   7. 将组装好的滤器在121 °C条件下干循环高压灭菌30分钟。待滤器冷却后、使用前再次拧紧。
      注意：建议一次性准备好所有所需滤器，并将其放入密闭的聚丙烯盒中进行高压灭菌。灭菌后，只要不拆卸已准备好的注射器，灌溉滤器可在室温下保持无菌状态直至使用。

图4：滤器组装示意图。（A）拆解状态的滤器组件：1. 滤器上部，2. O型圈，3. 滤盘，4. 滤膜，以及5. 滤器主体。（B）组装完成的滤器及配套准备好的注射器筒体。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 实验设置

1. 至少在实验开始前一天准备好并灭菌所有溶液和材料。
   1. 按照制造商说明配制0.5X Murashige和Skoog植物生长培养基。在121 °C条件下，使用液体循环高压灭菌30分钟。
   2. 将拆解的瓶顶分液器在121 °C条件下，使用干循环高压灭菌30分钟。将1 L去离子水在121 °C条件下，使用液体循环高压灭菌30分钟。
   3. 提前一天将玻璃培养皿、500 mL烧杯、茶漏和镊子在121 °C条件下，使用干循环高压灭菌30分钟。
      注意：除非另有说明，以下所有步骤均应在超净工作台中采用无菌技术操作。
2. 对种子进行表面灭菌。
   注意：种子表面灭菌方案取决于所使用的植物种类。该已知微生物体系已使用以下种子灭菌方案在小麦和玉米上进行了测试。
   警告：操作次氯酸钠和漂白剂时需穿戴实验服、手套和护目镜，因为这些化学品可能对皮肤和眼睛产生刺激或腐蚀作用。乙醇易燃，切勿在明火附近使用。
   1. 小麦种子灭菌²⁵
      1. 用两个烧杯各装150 mL 95% v/v乙醇，一个烧杯装150 mL未稀释家用漂白剂，另两个烧杯各装150 mL水。
      2. 将小麦种子放入茶漏中，将装有种子的茶漏在其中一个含95% v/v乙醇的烧杯中轻轻搅动1分钟。
      3. 将种子转移至新的茶漏中，将装有种子的茶漏在漂白剂中轻轻搅动10分钟。
      4. 将种子转移至新的茶漏中，将装有种子的茶漏在另一个含95% v/v乙醇的烧杯中轻轻搅动。
      5. 将装有种子的茶漏在无菌去离子水中轻轻搅动30秒，再在另一杯无菌去离子水中轻轻搅动2分钟。将灭菌后的种子置于无菌空培养皿中。
   2. 玉米种子灭菌²⁶
      1. 将玉米种子放入50 mL锥形管中，加入70% v/v乙醇至充满。轻轻倒置锥形管3分钟。
      2. 倾去70%乙醇，向装有种子的锥形管中加入2% v/v次氯酸钠。轻轻倒置锥形管3分钟。
      3. 倾去2%次氯酸钠，用无菌去离子水冲洗种子，倒去水后重复用水冲洗四次。将玉米种子置于无菌培养皿中。
3. 如适用，在培养基中加入微生物接种物。
   注意：在已知微生物体系的优化和无菌性测试过程中未添加任何微生物接种物。
4. 组装瓶顶分液器，并将其连接到培养基瓶上。
   注意：由于这是一个开放系统，建议准备一个容器以收集流出的培养基。我们发现使用烤盘效果良好且便于移动，但需要频繁清空。
5. 取下盆盖的塑料帽，向盆中分装378 mL培养基。
   注意：这相当于约70%的水分填充孔隙度（WFPS），当使用其他土壤基质时应进行相应调整。黏土使用360 mL，沙土使用358 mL。
   1. 使用无菌镊子将灭菌后的种子播种至适当深度。
   2. 小麦播种深度为½英寸，玉米播种深度为1英寸。或者，可将无菌预萌发的幼苗移栽至GNOVA系统中。玉米生长测试建议使用预萌发种子。
   3. 将塑料帽重新盖回盆口上方。

3. 最终组装与实验操作

1. 将培养罐和玻璃圆筒转移至生长室。用手握住玻璃圆筒，使其底部朝下靠近培养罐。
2. 迅速取下培养罐上的塑料盖以及玻璃圆筒上的灭菌包装。将玻璃圆筒向下放入，使其边缘落在3D打印底座的凸缘上。
   注意：在组装生长系统的最后阶段，也可在培养罐旁放置火焰（例如便携式本生灯），以进一步降低污染风险。
   警告：使用明火时，务必确保周围无其他易燃材料。注意火焰相对于身体的位置，以防烧伤。
3. 根据植物种类，采用特定物种的生长条件，培养植物4至17周。
4. 小麦的昼夜培养温度设为22 °C/16 °C，玉米设为27 °C/23 °C。两种植物的光周期均为12小时，仅使用荧光灯照明。

4. 灌注

1. 将一段长硅胶管连接到瓶口分配器上。
2. 使用便携式火焰在浇水过程中保持无菌状态。若无法使用便携式火焰，则使用次氯酸钠溶液进行灌溉以维持无菌条件。
3. 使用便携式火焰进行灌溉.
   注意：在明火附近操作时需小心谨慎，以防止人身伤害和设施损坏。
   1. 将火焰置于灌溉管线附近。从灌溉管线和滤器支架上取下注射器筒。保持所有管路末端处于火焰区域之内。
   2. 将滤器支架连接至灌溉管线。将两个注射器筒相互连接。将瓶口分配器上的另一段长硅胶管连接至滤器支架的底部接口。
   3. 分配 150 mL 的 0.5X Murashige 和 Skoog 培养基。将两个注射器筒分开。
   4. 从滤器支架上拆下硅胶管，并替换为一个注射器筒。
4. 使用 10% 次氯酸钠溶液进行灌溉
   注意：在大规模实验（n > 50）中，我们建议采用此灌溉策略，以提高浇水通量。
   注意：处理次氯酸钠时应穿戴实验服、手套和护目镜。
   1. 将 10% v/v 次氯酸钠溶液分别加入两个小型塑料烧杯中，并将其放置在灌溉管线附近。从灌溉管线和滤器支架上取下注射器筒。
   2. 将所有管路末端浸入 10% 次氯酸钠溶液中，直至使用前。使用前甩去多余溶液。将滤器支架连接至花盆的灌溉管线。
   3. 将瓶口分配器的另一段长硅胶管连接至滤器支架的底部接口。
   4. 分配 150 mL 的 0.5X Murashige 和 Skoog 培养基。从滤器支架上拆下硅胶管。
      注意：砂土基质的灌溉量为 120 mL，黏土基质为 360 mL。
   5. 甩去多余次氯酸钠溶液后，用注射器筒替换灌溉管线中的滤器。
      注意：若灌溉体积发生变化，需额外预留约 20 mL 培养基用于润洗灌溉管线。
5. 每周灌溉一次花盆。根据实验目的和所用土壤基质调整灌溉量和频率。若使用 100% 砂土，应将灌溉频率增加至每周两次。

5. 收获

注意：本收获方案是在无菌系统测试与优化期间所遵循的流程。应根据具体的研究目标以及待处理样本的数量对收获方案进行相应调整。

1. 在收获前至少一天准备好所有溶液和材料并进行灭菌。
   1. 提前一天使用液体循环程序在 121 °C 下高压灭菌 4 L 去离子水和 500 mL 0.145 M NaCl，持续 30 分钟。
   2. 提前一天使用干循环程序在 121 °C 下高压灭菌剪刀和镊子，持续 30 分钟。
      注意：除非另有说明，以下所有步骤均应在超净工作台内使用无菌技术操作。如果样品采集无需无菌条件，则所有这些步骤也可在超净工作台外进行。
2. 将无菌体系从生长室转移至实验室，并将其放置在超净工作台附近。
3. 从花盆中取出玻璃圆筒，并迅速将花盆放入超净工作台内，然后将花盆从 3D 打印底座上取出。
4. 用手握住植株基部，将土壤基质倒入容器中。轻轻抖动根部以去除较大的土壤团块。
   注意：在此收获步骤中，可根据具体研究目的收集和处理土壤基质样品。此处简要描述的方案用于检测土壤的无菌性。
5. 采用单板梯度稀释点样法²⁷进行土壤细菌计数的土壤采集²⁸。
   1. 在 96 孔板的各孔中加入 270 µL 0.145 M NaCl。第一行留空。将 1 g 土壤基质加入含有 9 mL 0.145 M NaCl 的 15 mL 锥形管中。
   2. 以最大速度涡旋振荡 5 分钟。将 30 µL 样品转移至 96 孔板的一个空孔中。
   3. 通过将每个样品的 30 µL 加入下一行含有 270 µL NaCl 溶液的孔中，制备七次梯度稀释液。
   4. 每次转移后通过反复吹打充分混匀。
   5. 将每种梯度稀释液各取 10 µL 点样于同一张 R2A 培养基平板上，完成单板梯度稀释点样。
   6. 倾斜平板使液滴均匀铺展。将平板置于室温下培养。
   7. 计数菌落形成单位（CFU），并计算每克土壤中的 CFU 数量。
6. 使用无菌剪刀将地上部分与根部分离。记录地上部分鲜重。
7. 将根部在盛有去离子水的烧杯中轻轻晃动以清洗干净。用吸水纸吸干根部水分，并记录鲜重。
   注意：此时可分别收集地上和地下部分材料，并根据最适合后续分析的方法进行处理。

结果

我们开发了GNOVA，一种新型的植物无菌体系，可提供研究植物–微生物互作所必需的无菌且可控的环境。该新系统提供24.4英寸（62 cm）的垂直地上部生长空间，以及一个1.3 L的种植盆，可兼容多种土壤基质。系统完全组装后高度约为3英尺（92.4 cm），宽度为4.57英寸（11.6 cm）（图5A–C）。与其他系统相比，该系统具有最高的地上部垂直生长空间，根室容积也位居第二（补充表1）。GNOVA在培养室中仅需占用0.0135 m²的表面积，因此结构紧凑且便于操作。该系统适用于垂直净空为1.22 m的步入式培养室。除3D打印底座外，该系统所有组件均可高压灭菌，且兼容尺寸为24英寸 × 24英寸 × 36英寸（宽 × 长 × 高；61 cm × 61 cm × 91 cm）的高压灭菌器。这避免了对各个部件进行手动灭菌，从而简化了实验设置流程。此外，该系统的大多数组件可重复使用，在初始搭建成本为每套54美元的基础上，每次实验的使用成本约为6美元（补充表2）。我们通过连续三天监测系统内一株一周龄玉米植株的温度和相对湿度，测定了GNOVA内部的环境条件。GNOVA内部的平均温度比培养室高+1.3 °C（补充图1）。在光照周期期间，系统内部与培养室之间的温差更大（平均+2.5 °C），而在黑暗周期期间较小（平均+0.4 °C）。GNOVA内部的平均相对湿度为63%，而培养室内的相对湿度为34%。

图5：GNOVA系统的示意图。（A）支撑底座最终设计的三维模型（B）支撑底座三维模型的截面图（C）完全组装后的GNOVA三维模型截面图 请点击此处查看该图的放大版本。

为确保系统内的无菌状态，我们进行了为期四周的无灌溉和有灌溉系统的试验（不种植植物）。通过在棉环上下区域直接拭子涂布采样，检测玻璃圆筒上的污染情况。在棉环上方，无论是无灌溉系统（n=4）还是有灌溉系统（n=6），均未检测到超过三个菌落的微生物生长（即每采样面积的三分之一区域不超过一个菌落）（补充图2A）。在棉环下方，仅在一个无灌溉重复样本中观察到微生物生长，而在有灌溉系统中未检测到任何生长（补充图2B）。这表明玻璃圆筒的污染风险较低，因为仅在少数位于棉环下方的重复样本中出现微生物生长，而该区域并不与植物接触。通过将系列稀释液点样至R2A平板上，评估土壤污染情况（补充图2C）。在两种条件下均未检测到显著的微生物生长，仅有一个有灌溉的重复样本在系列稀释中出现无法计数的菌落形成单位（即< 30个菌落）。除无菌性测试外，我们还比较了在GNOVA系统中与标准已知菌群（gnotobiotic）生长方案（即在袋系统中培养两周）¹⁹下小麦和玉米的生长表现。为了解小尺寸和无灌溉对植物生长表现的影响，我们将袋系统中的培养时间延长至与GNOVA系统一致。尽管两种系统在建立时所用的初始土壤含水量相同，但GNOVA系统每周接受营养液灌溉，而袋系统则未进行灌溉。在所有比较中，我们以袋系统作为参照，因为这是本实验室最初的已知菌群培养设置。在GNOVA系统中，小麦和玉米的发芽率均达到100%，而在袋系统中，小麦仅为67%（n = 3），玉米为75%（n = 8）（图6）。

图6：小麦（n = 3）和玉米（n = 8）在GNOVA系统（紫色）和袋系统（绿色）中的发芽情况。 每个重复实验的发芽结果以y轴上的点表示，分为“未发芽”或“已发芽”，对应于每种无菌体系。柱状图表示不同系统中小麦和玉米物种的发芽率（%）。请点击此处查看该图的放大版本。

还进行了小麦和玉米的生长试验，以确定在GNOVA系统中的最长可行生长周期及植株生长表现。尽管我们的标准袋式培养方案仅要求两周的生长时间，但为了更好地比较两种系统，我们在袋中将生长周期延长至超过两周。两周后，GNOVA系统中生长的小麦（n=3）已达到Zadock生长阶段（GS）13（图7A），而袋中植株仍处于GS11阶段。到第五周时，GNOVA系统中的植株已进入GS21阶段，表现为分蘖的出现（图7B）；相比之下，袋式系统中未见分蘖，植株仍停留在GS13阶段。由于袋式系统中植株生长受阻且缺乏物候期变化，该系统中的植株在第六周时被终止培养。而在GNOVA系统中，小麦继续生长了额外五周，期间观察到叶片数量和生物量的增加（图7C）。尽管在GNOVA中生长12周后小麦生物量在视觉上有所增加，但植株也开始出现更多黄化叶片，且玻璃圆筒内的空间已被植物生物量填满（图7D）。此后又继续培养了两周（图7E，F），但未见生物量的明显增加，因此在生长第17周时终止了生长试验。此外，在GNOVA系统中对玉米进行了为期四周的生长评估，并与袋中生长的玉米进行了比较（图8A，B）。本实验中，玉米种子在播种前经过灭菌并预先萌发。两种系统间玉米地上部和根系的鲜重存在显著差异（双样本t检验，p值 < 0.05，补充表3）。在GNOVA系统中生长的玉米地上部和根系平均鲜重分别为11.2 g和5.7 g（图8C，D）；而袋中生长的玉米地上部和根系鲜重分别为1.29 g和1.15 g。总体而言，与袋式系统相比，GNOVA系统中玉米的鲜重生物量提高了593%。此外，GNOVA系统中玉米的地上部长度和根系长度分别比袋中植株显著增加了89%和57%（图8E，F）。

图 7：小麦在 GNOVA 原型装置中的生长情况。（A）Zadock 生长阶段（GS）13 的小麦，生长两周后。（B）生长五周后，袋中与 GNOVA 中小麦的比较。GNOVA 中可见分蘖（GS21），而袋中无分蘖（GS13）。（C）生长十周后小麦生物量的增加。（D）生长十三周后小麦生物量进一步增加，并出现叶片黄化现象。（E）生长十五周后小麦生物量的进一步增加。（F）生长十七周后，小麦生物量占据了大部分可用生长空间。请点击此处查看此图的放大版本。

图8：GNOVA（紫色）原型系统与袋式系统（绿色）中玉米的生长情况对比。 条形图表示平均值 ± 标准误（n=4）A在GNOVA和袋子系统中种植四周的玉米。B) GNOVA系统与袋装系统中培育的收获植株大小比较。C新鲜茎重（平均值±标准误）。D) 新鲜根重（平均值±标准误）。E) 茎长（平均值±标准误）。F) 根长（平均值±标准误）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充图1：GNOVA内（紫色）和生长室（橙色）中测得的相对湿度和温度的时间动态。 数据以每五分钟一次的频率记录，持续三天。GNOVA内的数据由一株七周大的玉米植株记录。浅蓝色阴影区域对应夜间时段。请点击此处下载该文件。

补充图2：对未种植植物且未灌溉（对照）和进行灌溉（灌溉组）的GNOVA进行无菌测试后得到的微生物生长情况。（A）棉环上方玻璃圆筒样品。（B）棉环下方玻璃圆筒样品。（C）土壤样品的单平板系列稀释涂布。 请点击此处下载该文件。

补充表1：GNOVA 与现有植物无菌体系（EcoFAB、Magenta盒子、塑料袋、FlowPot、GnotoPot 和 EcoFAB 3.0）的功能比较。 各系统在实验设计相关的关键参数方面进行了比较，例如植物高度容纳能力、根系体积容纳能力以及灌溉控制能力。信息来源于已发表的文献和可获取的系统描述；当数据未明确报告时，标注为估计值。† 文献中未明确说明时的最佳估算；‡ 系统在执行操作时无需拆卸或移至超净工作台；* 经系统改造后可实现；成本类别定义如下：低（< 每单位30美元）、中（每单位30–100美元）、高（> 每单位100美元）请点击此处下载该文件。

补充表2：单个GNOVA装置组装与运行的材料清单（BOM）及预估成本。 材料分为可重复使用和一次性组件，列出了相应的单价、每个系统所需数量以及每个系统的总成本。可重复使用的组件构成初始设置成本，一次性材料则代表每次实验的耗材成本。* 根据批量采购协议价格计算得出，以实现成本效益；** 所需数量因实验时长、所用土壤基质及研究目标而异。表中数值基于使用黏土与沙混合基质、每周灌溉一次、持续四周的实验条件；† 每个系统所需材料量的近似成本；‡ 未包含营养液和土壤基质的价格，因其会因实验目标不同而变化请点击此处下载该文件。

补充表3：在GNOVA和袋装系统中种植的玉米生长测量变量的双样本t检验所得p值。请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍的植物无菌体系GNOVA，为研究谷类作物与微生物的相互作用提供了一种易于使用且多功能的工具。该体系的主要特点包括增强的生长能力以及内置灌溉系统，可在无菌条件下将谷类作物的生长延续至幼苗期之后。该体系的性能与EcoFAB 3.0相当，是一种易于获取的植物无菌体系替代方案。GNOVA由市售组件构建而成，组件的选择兼顾成本、操作简便性以及与中型高压灭菌器的兼容性，便于在不同实验室中推广应用。其组装和操作过程简单，无需特殊设备，从而降低了使用门槛。由于GNOVA可兼容多种土壤基质、种子灭菌方案、微生物接种物（无菌状态、合成群落或天然微生物群落）以及多样的下游分析方法，因此可根据不同的研究目标进行灵活调整。

在植物无菌体系实验中，最大限度减少污染至关重要，以确保观察到的效应可归因于目标微生物而非污染物。GNOVA 的操作简便，有助于降低污染风险。严格遵守无菌操作技术并遵循以下关键建议，可确保体系无菌状态的维持。在实验设置过程中，建议在接种不同微生物之间对超净工作台进行消毒，以最大限度减少处理间的交叉污染。接种处理的顺序也可影响交叉污染的程度，优先接种无菌处理，再进行任何活体微生物接种，是理想的操作顺序。外源微生物还可能通过种子引入。因此，应针对不同植物种类或种子来源优化种子表面灭菌方案，以平衡灭菌效果与种子萌发率²⁶。对于高粱²⁴、大麦²⁹、柳枝稷和燕麦²³等非模式禾本科作物，其灭菌方案可直接在 GNOVA 系统中实施。若灭菌处理对萌发产生不利影响，可改用预先萌发的种子。在无菌体系中，灌溉是主要的污染来源之一。该过程中最关键的步骤是将过滤器连接至灌溉管路。此操作过程中，灌溉管路和过滤器的管口末端必须始终保持无菌状态。火焰灭菌需要较高的操作技巧，且在大规模实验（n >50）中较为耗时费力。因此，对于大规模实验或无法实施火焰灭菌的情况，推荐采用基于次氯酸钠的替代方法。建议在灌溉过程中额外准备无菌过滤器，并备有次氯酸钠或乙醇，以应对操作过程中可能发生的污染。此外，强烈建议设置污染对照单元（即不种植植物、不接种微生物，但正常接受灌溉），用于监测体系无菌状态并识别污染物。

为避免灌溉污染的风险，早期的植物无菌体系完全封闭且不具备灌溉能力，这限制了实验的持续时间。玉米在无菌条件下于袋子^19,30、玻璃管和培养皿¹⁵中生长，持续时间为两到四周。为了在植物生长期间补充水分和养分，出现了诸如EcoFAB²³、FlowPot和GnotoPot²¹等替代系统，这些系统可在超净工作台内通过部分拆卸实现灌溉。但此类设计限制了系统的尺寸及其与较大植株的兼容性。由于GNOVA系统的灌溉管线可在外部直接接触，因此无需拆卸，也不受超净工作台尺寸的限制。这不仅实现了营养物质和水分的持续供应，还增加了可用的生长空间。地上部分空间不足会降低光合作用能力，并可能导致植株矮小²⁴；根系体积受限则可能引起根系缠绕，减少水分和养分的吸收³¹。袋式系统中生长空间狭小且无法灌溉的特点，可以解释为何玉米和小麦的生物量较低且物候发育停滞，与GNOVA系统相比表现较差。新系统使玉米的无菌生长持续时间达到了与高粱在EcoFAB 3.0系统中相当的水平²⁴。此外，在更接近真实土壤环境的系统中，该系统实现了比水培系统中持续四周的小麦无菌生长更为优越的表现（20）。除了物理限制外，无菌系统通常依赖受限的空气流通来维持无菌状态。空气流通受限可能导致温度和湿度升高，气体交换速率降低，从而影响植物生理过程³²。已有研究表明，在通风条件改善的系统中植物生长表现更佳，例如配备HEPA过滤器的Magenta盒³³，其工作原理与GNOVA中使用的DW4过滤器类似。同样，EcoFAB 3.0系统也存在温度和相对湿度升高的问题，但仍被视为支持高粱无菌生长的可靠平台²⁴。这表明，尽管无菌系统仍存在物理和环境上的限制，但本文所介绍的系统设计改进仍提供了更优的生长条件，能更有效地支持谷类作物的无菌生长。

易于修改是GNOVA的另一关键特性。其模块化设计使用户能够针对个体组件进行调整，以更好地满足研究需求和预算限制。该系统可兼容任何土壤基质，包括天然土壤。装置的体积、营养液浓度以及灌溉量和频率的调整应基于土壤的理化性质，因为这些因素直接影响养分和水分的有效性及分布³⁴。可通过监测整个GNOVA系统的重量并采用重量法测定土壤含水量来诱导干旱处理³⁵。根系分泌物可通过将收获的植物在超纯水中孵育进行破坏性收集³⁶，或通过冲洗系统获得非无菌淋出液³⁷。若需要无菌分泌物，可对GNOVA的培养皿及3D打印支撑底座进行改造，集成类似EcoFAB 3.0设计中的内置分泌物收集装置²⁴。对于希望研究微生物群落构建中优先效应³⁸的科研人员，可在培养皿周围加装额外的灌溉管线，从而实现后续微生物接种物的施加，同时保持主灌溉线路的无菌状态。环境条件可通过在GNOVA内部放置已消毒的无线温度和相对湿度传感器进行监测。或者，将玻璃圆筒替换为聚碳酸酯培养室，并钻设取样口²⁴，可实现对环境的监测及气体取样。这使得能够定量检测可能影响植物生长表现的气体和挥发性化合物，如CO₂、O₂和乙烯³³。此外，通过移除玻璃圆筒中的棉塞环，还可增加系统内的气流。然而，上述任何修改均可能增加污染风险，目前尚未在GNOVA系统中经过验证或优化。

尽管GNOVA具有诸多优势和广泛适用性，但仍需考虑一些局限性。需要注意的是，该系统最适合在可控的生长培养箱内使用，因为在温室或田间等非受控条件下，其性能可能会受到影响。尽管小麦在该系统中能够生长17周，但在约12周时已观察到胁迫迹象。因此，小麦的培养时间不应超过12周。此外，无菌状态的维持仅在为期四周、每周一次的四次灌溉过程中得到验证；更长时间的实验会增加污染风险。尽管GNOVA已提高了根系体积容量，但仍可能存在根系受限的情况，对根系形态进行时间序列评估有助于确定最佳生长时间，以最大限度减少根系缠绕。另外，系统的一些改进，例如用聚碳酸酯圆筒替代玻璃圆筒，可能导致每个单元的搭建成本超过100美元。目前，GNOVA仅支持终点破坏性取样，这会增加对微生物动态、根系分泌模式或无菌状态监测等时间序列研究所需的劳动投入和重复实验数量。最后，在系统搭建、灌溉和收获过程中维持无菌状态耗时较长，即使像GNOVA这样的简化系统也需要投入大量人力，从而增加整体运行成本。综上所述，在采用该系统时应充分考虑这些局限性。此外，在实验设计和结果解读过程中，还需考虑由已知菌群生长环境带来的生态限制，因为这些因素可能影响植物生理状态，进而影响其相关的微生物组。

GNOVA 提供了一个适用于谷类作物的多功能无菌生物平台。该系统能够回收几乎完整的根系，适用于 RhizoVision Explorer³⁹ 和 ARIA⁴⁰ 等根系构型分析工具，可用于表征根系形态对不同微生物接种物和环境条件的响应。当与合成菌群（SynComs）和多组学分析相结合时，GNOVA 有助于揭示微生物效应因子与植物响应之间的机制联系。将较大的合成菌群（>100 个成员）与宏基因组^41,42,43 分析相结合，可用于研究不同条件下微生物的共现模式，并鉴定具有生态学意义的微生物^5,44。相比之下，较小的合成菌群（<50 株）结合宏转录组^45,46、宏蛋白质组^19,47,48 和代谢组^49,50,51 分析，可实现对植物和微生物功能响应的详细表征⁴⁴。这些能力共同使 GNOVA 成为识别关键微生物性状的有力工具，从而加速新型生物接种剂的开发，提升农业系统的可持续性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Powerconnect 无线电钻 &和 100 件套工具包	Black+Decker	BDC120VA100	1/4" 和 1/8" 所需钻头。
乙烯基胶带，黄色，1" 宽 x 36 码	3M	471	耗材
#32 号斯特林橡皮筋  （每套系统2根橡皮筋）	亚马逊	B001I1QO00	耗材
小麦种子			本实验所用品种：Catawba
玻璃纤维管壳保温材料，3 " widex 1/2 " 厚  （每套系统2个预先切割的圆片）	Lowe's	28930	切成 2 7/8 " 直径为7.3 cm的圆片。耗材。为实现高通量制备圆形片，可将保温卷材铺开，将坩埚边缘置于保温包裹材料上，通过施加压力并旋转坩埚，利用坩埚开口边缘切割出圆形。
DW4 滤膜介质，预切割为 15" x 75 码  （每个系统1个切割圆）	Class Biological Clean, Ltd	NA	切成6.3 " 直径（16.02 厘米）的圆片。如需要，也可购买 CBC 其他预切割尺寸或标准卷材。  耗材。用硬纸板剪出一个圆形模板，用它在DW4培养基区域上画出多个圆，并用剪刀剪下。
硅胶管，Versilon SPX-50 高强度，1/8" ID x 1/4" OD × 1/16" 壁厚	Saint-Gobain	ABX00007	切成两段长条（16" // 40.64 厘米）和三段短管（2.5" 6.35 厘米
5% 有效氯的次氯酸钠水溶液	VWR	JT9416-1	稀释至2%（v/v），用于玉米消毒方案
穆拉希吉 & Skoog 培养基，微量元素和大量元素。25 L	研究产品国际公司	M10200-25.0	稀释至0.5倍浓度
乙醇，100%，Deacon Labs	Fisher Scientific	04-355-451	稀释至95%（v/v）
3 mL 注射器，鲁尔锁扣，非无菌  （每系统2个）	Fisher Scientific	14-817-117	弃去活塞，仅保留管筒，填充玻璃棉，并用箔纸封口。
250 mL 玻璃烧杯	VWR	470191-150	小麦种子消毒需要五个
玉米种子			本实验所用基因型：Mexico 21–22 B73XMo17
铝制烤盘 18" × 26"	亚马逊	B01FIK54LQ	确保其尺寸适合您的超净工作台
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-1	配制 0.145 M 溶液。
3D打印底座，使用聚乳酸（PLA）细丝（每套系统1根）	Protolabs	NA	补充材料中可获取打印和可编辑的文件。文件可在 Dryad.org 获取，DOI：https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc。若使用 PLA 作为线材打印底座，则禁止高压灭菌。PLA 在高于 150 °C 时会熔化 °C，且在60℃以上可能发生变形 °C. 建议对PLA 3D打印底座的完整性进行测试，若其将在40℃以上温度条件下使用 °C. 对于耐热性更高的材料，可改用 PETG（聚对苯二甲酸乙二醇酯）或 PC（聚碳酸酯）；但这会增加部件成本，且仍可能无法进行高压灭菌。基础原型的 3D 打印是在一台成型体积为 256 的个人打印机上完成的 × 256 × 256 毫米（长度） × 宽度 × 高度）。为提高速度并降低成本，建议在当地商业3D打印服务机构批量打印。
雄性鲁尔接头转1/8英寸软管接头 " ID，无动物源性聚丙烯  （每系统2个）	Cole-Parmer	EW-50114-69	参照方案中的拟合1
公型快接鲁尔接头转1/8英寸软管接头 " ID，无动物源性聚丙烯  （每套系统1个）	Cole-Parmer	EW-50114-63	参照方案中的拟合2
201 不锈钢蜗杆软管夹，1 1/2" -3 1/2" 夹紧直径（每系统1个）	格雷格纳	5CZF2	在方案中称为软管夹
Airstream Gen 3 层流罩，带简易开关，尺寸为 24 1/4" × 47 " × 28 1/4 "	ESCO 生命科学	2120707	在方案中称为层流罩。任何尺寸相似的层流罩均可使用。在较小的层流罩中可能需要进行适当调整。
Play sand, Quikrete Premium. 50 lb	家得宝	1001709466	在方案中称为沙子
304 不锈钢编织丝网，120 目（每套系统 1 个）	亚马逊	B09KRS5F7T	文中称为不锈钢丝网。剪成4.7" 直径为 11.9 cm 的圆。为实现高通量或大量制备圆形，可用硬纸板制作圆形模板，将其用于编织网的整个网面区域描画圆形，然后用剪刀裁剪。
膨润土（蒙脱石），OIL-DRI 疏松吸附剂，50 磅重量，无香味	格雷格纳	44Z111	在方案中称为黏土。耗材。
无底透明飓风蜡烛罩烟囱管 4" OD × 30" 长度（每个系统1个）	WCG International	HST0430	在方案中称为玻璃圆筒
透明塑料帽，3 个" 直径（7.6 cm）  （每套系统1个）	ClearTec 包装	PCC3.000	在方案中称为塑料盖
透明聚碳酸酯管，3 根" OD × 2 7/8" 内径 × 1/16 英寸壁厚 × 12" 长度  （每套系统1个）	ePlastics	PCTUB3.000X2.875	在方案中简称为 pot。可要求公司切割成其他所需长度。
洁净室灭菌包装，6" × 6" （每套系统1个）	Fisher Scientific	17-101-102	在方案中称为灭菌包装材料。消耗性材料。
中号锯齿尖解剖镊，4 1/2" 长度	VWR	82027-398	在方案中称为镊子。
茶漏	亚马逊	B0FRMRZWZY	小麦种子消毒需要三个步骤
含5.7%有效氯的Clorox漂白剂	家得宝	1005131978	小麦灭菌方案中使用未稀释液；灌溉方案中稀释至10%（v/v）
编织棉卷 3/8" 直径 × 6" 长度（每个系统2个）	里士满牙科与医疗用品公司	201208	使用微孔胶带将两根编织卷固定在一起，并剪成10又3/4英寸长" （27.31 厘米）长。将其弯成环状，并使用微孔胶带封闭。耗材。
96孔板，平底，未处理，无菌	VWR	10861-562
瓶顶分液器，5 - 60 mL	VWR	76319-590
Falcon 锥形离心管，15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 圆锥形离心管，50 mL	Fisher Scientific	14-959-49A
600 mL 玻璃烧杯	VWR	470191-152
5 L 玻璃储存瓶	VWR	10754-824
玻璃棉	Fisher Scientific	AC386062500
重型铝箔	亚马逊	B093X4M4QF
微孔手术胶带，1" 宽视野	3M	1530
尼龙扎带，6 个" × 0.1"  （每套系统1个）	亚马逊	B09H5LHW78
PES 0.22 微米滤膜，47 毫米，非无菌  （每套系统1个）	Tisch Scientific	SF15021
250 mL 塑料烧杯	VWR	470332-662
50 mm 滤膜用聚丙烯滤器  （每套系统1个）	Cole-Parmer	EW-06623-52
便携式本生灯	VWR	470343-152
R2A 琼脂，BD	VWR	90000-994
Vortex Genie 2 数字混匀仪，230/240 V	VWR	78496-568