联合胶原酶注射与运动诱导的机械性超负荷：一种模拟超负荷应激损伤性膝骨关节炎的小鼠模型

摘要

本方案通过关节内注射胶原酶结合运动诱导的过度劳累，建立了一种过载应激诱导的小鼠膝骨关节炎模型，为研究退行性病变的发病机制提供了一个微创平台。

摘要

膝骨关节炎（KOA）是一种多因素参与的退行性关节疾病，由生物组织降解与持续机械超负荷之间的复杂相互作用驱动。传统的手术动物模型通常诱发创伤后关节破坏，难以准确模拟人类退行性 KOA 逐步累积的发病过程。为弥合这一转化医学鸿沟，本研究建立了一种新颖且可重复的小鼠模型，通过轻度酶解软骨降解与持续机械负荷的协同作用，模拟超负荷应激诱导的 KOA。具体而言，在为期四周的时间内，采用标准化的关节内注射 II 型胶原酶，并结合严格校准的旋转式疲劳装置进行每日机械性过度负荷。通过全面的行为学、组织学和分子分析验证了这种双因素干预的有效性。自动化步态分析显示，联合干预组小鼠出现严重的运动功能障碍，表现为步长、步宽以及站立相足印面积峰值的显著降低。采用番红O-快绿染色进行的组织形态学评估进一步证实了这些功能缺陷，结果显示软骨结构进行性损伤、表面缺损，以及显著升高的国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分，忠实地再现了人类早期至中期 KOA 的病理特征。此外，免疫组织化学分析表明，关节软骨细胞中机械敏感性离子通道瞬时受体电位香草酸 4（TRPV4）显著上调，同时关键基质蛋白 II 型胶原 α1 链（COL2A1）表达明显减少。通过将局部关节不稳与可控机械应力相结合，该微创策略避免了手术模型所伴随的急性创伤。本方案建立了一个具有临床相关性的实验平台，可用于动态追踪分子机制、评估慢性疼痛表型以及测试针对早期骨关节炎的长期治疗干预措施。

引言

骨关节炎（OA）是一种多因素退行性疾病，其特征为疼痛、肿胀、僵硬和功能受损，由肥胖、机械应变和创伤等因素引起¹。膝骨关节炎（KOA）患病率高，且随年龄增长日益常见，但由于临床表现多样，临床试验常受限于研究范围。因此，开发有效治疗方法需要建立合适的动物模型²。鉴于OA本身具有异质性，目前尚无普遍接受的“"金标准"”模型，研究人员需根据具体科学问题选择相应的特定模型。

目前，现代医学将膝骨关节炎（KOA）定义为一种涉及机械因素与生物学因素在关节软骨及软骨周组织中相互作用的疾病。这种复杂相互作用的主要后果是关节软骨及其周围基质进行性退变³。机械应力作为关键的转导信号，调控着关节细胞和组织内的多种生理与病理过程⁴。维持关节软骨的健康状态需要在生理范围内的适当机械负荷。相反，过度的负荷则常导致软骨退化，进而引发KOA⁵。自发性动物模型受限于高昂的时间与经济成本⁶，而手术诱导模型采用破坏性手段，主要模拟中晚期KOA，偏离了自然退变的进程^7,8。相比之下，化学诱导模型虽以胶原基质为靶点，但在缺乏机械应力的情况下，无法全面再现人类退行性骨关节炎的病理变化⁹。将酶解降解与机械性过度负荷相结合，可更真实地模拟过载应力损伤的渐进性发病过程，从而弥补上述模型的不足。本研究旨在通过关节内注射II型胶原酶联合旋转式跑轮疲劳装置诱导过度负荷，建立并验证一种新型的小鼠KOA模型。

方案

所有动物实验均按照上海中医药大学动物护理与使用委员会批准的方案进行。实验在上海中医药大学实验动物中心伦理委员会授予的项目许可证（编号：PZSHUTCM201016022）下开展，符合美国国家研究委员会实验动物护理与使用指南更新委员会的相关规定。

1. 动物模型制备方案

1. 将32只10周龄的C57BL/6小鼠随机分为四组：对照组、胶原酶组、过度运动组以及胶原酶+过度运动组。
   1. 在开始建模操作前，所有小鼠均在标准饲养条件下适应环境一周。
2. 根据各实验分组，持续4周建立动物模型。
   1. 对胶原酶组小鼠通过关节内注射给予II型胶原酶。
   2. 让过度运动组小鼠在旋转跑轮装置上进行运动训练。
   3. 对胶原酶+过度运动组小鼠同时实施关节内注射胶原酶和旋转跑轮运动训练。
   4. 所有涉及运动的实验组应保持完全相同的训练频率和持续时间。

2. II型胶原酶关节内注射方案

1. 麻醉
   1. 使用经校准的气体麻醉机通过异氟烷诱导麻醉。以2%–3%浓度的异氟烷进行快速诱导。
   2. 以1.5%–2%浓度的异氟烷维持麻醉。确保麻醉废气清除系统正常运行，防止职业暴露。
   3. 在整个操作过程中持续监测小鼠的呼吸频率和反射反应。
2. 皮肤准备
   1. 将脱毛膏涂抹于左膝关节周围区域，使用刮刀彻底去除毛发。
   2. 充分清洁暴露的皮肤。在整个准备过程中保持无菌条件。
3. II型胶原酶溶液配制
   1. 在无菌生物安全柜中将II型胶原酶粉末平衡至室温30分钟。仅使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2–7.4）作为溶解过程的溶剂和缓冲液。
   2. 使用分析天平精确称取所需质量的胶原酶粉末。缓慢加入无菌PBS至粉末中，使其最终工作浓度达到0.04 U/µL。
   3. 通过移液器轻轻吹打混合溶液，直至溶液澄清且无可见颗粒。此步骤中避免剧烈涡旋，以防酶活性丧失。
   4. 将配制好的0.04 U/µL溶液在4 °C条件下以1,000 rpm离心5分钟。此步骤可去除未溶解的微小颗粒，防止后续注射时针头堵塞。
   5. 将上清液吸出至无菌管中，并置于4 °C冰浴中立即使用。每次实验前新鲜配制溶液，以确保最大酶活性。
4. 关节腔内注射
   1. 用非优势手的拇指和食指捏住小鼠背部皮肤，用无名指和小指固定双侧下肢，使膝关节自然伸展并充分暴露注射区域。
   2. 持装有30 G针头的10 µL微量注射器。在进针点处将针头平行于皮肤表面刺入表层皮肤约0.2 cm。
   3. 当组织阻力减小时，缓慢调整针头方向至与皮肤表面垂直。
   4. 继续推进针头约0.3–0.5 cm，直至阻力消失，提示已进入关节腔。缓慢回抽注射器活塞，确认无血液反流。
   5. 以恒定速度向关节腔内注射5 µL II型胶原酶溶液（浓度：0.04 U/µL）¹⁰。
   6. 注射后立即保持针头位置不动。轻压注射部位周围皮肤10–15秒。
   7. 缓慢拔出针头。用无菌纱布轻压进针点30秒，防止药液外渗。
   8. 将小鼠放入温暖干燥的饲养笼中，让其自然从麻醉中恢复，通常需要5–10分钟。
   9. 待小鼠完全恢复后，恢复正常饲养和喂食条件。
   10. 在为期4周的造模期间（初始1周适应期之后），每周进行两次关节腔注射，每次注射间隔3–4天。
   11. 所有锐器应立即丢弃至经批准的生物危害容器中。
       注：所有注射操作应由经过培训的人员执行，以最大限度减少关节损伤和实验变异性。

3. 旋转轮诱导过度用力方案

1. 仪器准备与安全检查
   1. 将旋转式疲劳仪器的转速设定为 12 rpm（相当于约 0.063 m/s），每次训练持续时间为 2 小时。
   2. 打开电刺激模块。确认电流输出处于预设的安全范围 0.1–0.3 mA 内。切勿手动增加电流强度。
      ​警告：仅可使用电刺激模块引导小鼠返回转轮，不得将其作为惩罚性刺激。操作前应检查仪器线路是否损坏，并确保电极接触良好，以防止短路和电击伤害。
2. 适应性训练
   1. 确保疲劳仪器的旋转转轮腔室清洁、干燥且无杂物。关闭转轮入口处的电刺激电极，以消除任何可能由电刺激引起的应激反应。
   2. 通过尾根部轻柔抓取小鼠，或使用无菌软纸巾将其舀起。将每只小鼠单独放置于旋转转轮跑动表面的中央区域。
   3. 将小鼠以自然的四足直立姿势置于水平跑动面上，身体方向与转轮中心旋转轴平行，前爪朝前，后爪略向后。
   4. 使用临时性、非限制性的柔软屏障，防止小鼠在最初 2 分钟内进入狭窄的电极区域。在此时间段后移除屏障，允许小鼠自由探索整个腔室。
   5. 在前 3 天内，每天让小鼠在静止的仪器中停留 10 分钟。此期间不得启动转轮旋转或施加任何电刺激。
   6. 观察小鼠是否出现严重应激迹象，如持续僵直或过度直立。若小鼠行为异常，应轻柔地将其重新放置于转轮中央区域，以恢复其自然姿势。
   7. 在第 4 天以 5 rpm 的速度启动转轮，持续 30 分钟。此步骤使小鼠适应仪器的运动节律，而不使用电刺激提示。
   8. 若小鼠在节律适应阶段跌落或停止运动，应手动将其引导回转轮中心。在整个 4 天的适应期中，确保电刺激始终处于关闭状态。
      ​警告：在适应阶段避免使用电刺激，以防引发恐惧相关的应激反应，并确保后续训练的依从性。
3. 正式运动执行
   1. 每天在固定时间（例如上午 9:00–11:00）进行正式训练。佩戴绝缘手套将小鼠放入旋转式疲劳仪器中。
   2. 关闭仪器门。启动预设参数，即 12 rpm（~0.063 m/s），每次训练最长持续 2 小时（见图 1）。
      ​警告：训练期间需持续监测小鼠状态。若某只小鼠连续跌落（1 分钟内超过 3 次），应暂停训练 5 分钟，以防止严重疲劳和应激相关损伤。
4. 疲劳终点判定与刺激
   1. 持续监测小鼠以评估其疲劳状态。若小鼠满足以下四项特定疲劳标准中的至少两项，应提前终止训练，无需强制完成完整的 2 小时，以避免过度应激。
   2. 定义标准 1：小鼠无法在转轮上停留超过 5 秒即跌落。定义标准 2：跌落频率显著增加，即在 1 分钟内跌落 3 次或以上。
   3. 定义标准 3：缺乏主动返回转轮的意愿，即小鼠在电刺激下仍保持静止或仅短暂移动。
   4. 定义标准 4：出现异常运动姿势。需观察明显体征，如肢体拖行或步态不稳。
   5. 当小鼠跌落至转轮入口时，允许仪器自动触发轻微电刺激。一旦小鼠返回转轮，应立即停止电刺激¹¹。
      ​警告：若小鼠出现抽搐或呼吸困难等异常情况，应立即终止训练。将小鼠从仪器中移出，并在必要时给予对症治疗。
5. 训练后处理与训练频率
   1. 训练结束后关闭仪器电源。佩戴绝缘手套取出小鼠并将其放回原饲养笼中。
   2. 为小鼠提供充足的饮用水。观察动物是否有异常活动、精神状态或肢体问题（如跛行或肌肉震颤）。
   3. 记录所有异常情况，并及时进行处理。
   4. 维持每日一次、每次 2 小时的训练频率，连续进行 4 周。在整个期间保持训练参数和安全监测的一致性。
      注：每次日常训练前应确认疲劳仪器和电刺激模块功能正常，以确保刺激强度的一致性。

4. 步态分析

1. 系统概述
   1. 使用自动化步态成像系统进行步态采集与分析。
   2. 在建模期4周后，对32只10周龄的C57BL/6小鼠进行所有步态实验。
   3. 将高速摄像机置于透明跑带下方，以捕捉运动过程中的腹侧图像。
2. 适应性驯化与实验设置
   1. 在正式数据采集前，将所有小鼠适应跑台装置，以尽量减少应激反应。
   2. 将跑步机速度设置为 20 cm/s，以匹配小鼠的生理步行速度。
   3. 每只小鼠记录三次独立的有效试验，每次试验之间间隔 2 分钟休息时间。
3. 试验记录与步态周期选择
   1. 每次试验期间，让小鼠持续行走60秒的采集期。
   2. 如果记录因以下原因无效，则执行替换试验 "冷冻，" 跳跃或转身。
   3. 仅在小鼠持续稳定行走至少10秒后，才开始数据采集。
   4. 从每次60秒的试验中至少选择4个连续的完整步态周期用于分析。
   5. 确保由两名独立的盲法观察者进行步态周期的选择，以消除主观偏倚。
   6. 确认小鼠保持自然的四足行走姿态，无跳跃或突然的速度波动。
   7. 验证步态周期是否包含承重的站立相和产生向前推进的摆动相。
   8. 检查是否存在清晰的足爪-传送带接触图像，且无追踪丢失、模糊或污染。
4. 图像处理与参数提取
   1. 使用系统软件内置的算法对采集的图像进行数字化处理，并检测足爪与跑带的接触点。
   2. 将摆动/支撑比计算为摆动相持续时间与支撑相持续时间的比值。
   3. 以厘米（cm）为单位测量步长，即单次完整步态周期中行进的直线距离。
   4. 以对侧后爪在支撑相峰值时内侧边缘之间的水平距离测量步宽（cm）。
   5. 测定站立相峰值时的足爪面积（cm²）²代表最大负重时的总接触面积。
   6. 计算足面积变异性（cm²）²作为连续步态周期中接触面积的变异系数。
   7. 计算每只小鼠3次有效试验的平均值，并导出最终数据集。
      注意：在分析中排除存在不规则停止、跳跃或转向行为的试验。

5. 组织学

1. 组织采集与固定
   1. 在为期4周的诱导期结束后，通过颈椎脱位法人道处死所有小鼠。小心解剖左侧膝关节，并去除周围多余的软组织。
   2. 立即将标本浸入预冷的4%多聚甲醛（PFA）固定液（w/v）中。确保固定液体积为标本体积的10–15倍，以完全浸没组织。
   3. 在室温下固定组织48小时。每8小时轻轻振荡固定容器一次，以确保固定液充分渗透。
2. 组织脱钙
   1. 用缓慢流动的水冲洗固定后的标本10分钟。重复此冲洗过程三次，以去除残留的PFA。
   2. 将标本转移至0.5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙液（pH 7.2–7.4）中。保持脱钙液体积为标本体积的20倍，并在4 °C下保存。
   3. 脱钙时间为14–21天。每隔3天更换一次新鲜的EDTA脱钙液。
   4. 用无菌针头轻轻穿刺软骨下骨以检测脱钙终点。当针头可无阻力地顺利穿透时，判定脱钙完成。
   5. 将完全脱钙的标本在流动水中冲洗2小时，以去除残留的EDTA。随后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤标本三次，每次5分钟。
3. 包埋与切片
   1. 使用梯度乙醇系列对脱钙后的标本进行逐级脱水（70%、80%和90%各2小时；95% 1小时；无水乙醇两次，每次1小时）。
   2. 在二甲苯中透明两次，每次10分钟。将透明后的组织包埋于石蜡中。
   3. 使用切片机将石蜡包埋组织切成5 µm厚的矢状面连续切片。将切片贴附于聚-L-赖氨酸涂层的载玻片上，并在60 °C的载片烘烤板上烘烤2小时。
4. 组织形态学评估
   1. 使用番红O-快绿染色法对切片进行染色，以评估关节软骨的组织形态学特征。
   2. 在双盲条件下，采用国际骨关节炎研究学会（Osteoarthritis Research Society International, OARSI）评分系统评估软骨退变程度¹²。
5. 免疫组织化学（IHC）核心操作流程
   1. 在二甲苯中脱蜡两次，每次10分钟。然后通过梯度乙醇系列将切片逐级水化至去离子水。
   2. 将切片浸入0.01 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中，进行微波加热诱导的抗原修复。高功率加热至沸腾后，转中功率维持微沸15分钟。
   3. 自然冷却至室温。用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。
   4. 在含3%过氧化氢（H2O2）的甲醇溶液中孵育切片20分钟（室温），以阻断内源性过氧化物酶活性。随后用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。
   5. 在切片上加5%山羊血清封闭液，室温孵育60分钟，以封闭非特异性结合位点。
   6. 弃去封闭液，无需洗涤。加入特异性一抗工作液（瞬时受体电位香草酸亚型4（TRPV4）按1:100稀释，Caspase-3按1:200稀释，或II型胶原α1链（COL2A1）按1:150稀释）。
   7. 将切片置于湿盒中，4 °C孵育过夜（12–16小时）。
   8. 次日将切片平衡至室温30分钟，然后用PBS洗涤三次，每次5分钟。加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔或抗小鼠IgG二抗（1:500稀释）。
   9. 室温孵育二抗60分钟。用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。
   10. 加入3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色液，室温避光孵育3–5分钟。在显微镜下观察到清晰的棕黄色信号时，立即用去离子水终止反应。
   11. 用苏木精溶液复染切片5分钟。在流动水中冲洗10分钟，使染色变为蓝色。
   12. 用1%酸性乙醇溶液分化30秒。在流动水中冲洗载玻片5分钟。
   13. 通过梯度乙醇系列快速脱水，并在二甲苯中透明两次，每次10分钟。
   14. 使用中性树胶封片，并加盖光学树脂盖玻片。将封片后的载玻片在室温下干燥。
6. IHC对照与图像分析
   1. 在染色过程中，以PBS替代一抗设立阴性对照。同时包含已知阳性的软骨组织切片作为阳性对照，以验证抗体有效性。
   2. 使用全切片扫描仪在40×和100×放大倍数下获取染色切片图像。
      注：所有组织学评估应由至少两名盲法观察者独立完成，以减少主观偏差。

6. 统计分析

1. 数据处理与整体检验
   1. 在盲法条件下进行所有数据收集和分析，以尽量减少实验偏差。
   2. 使用单因素方差分析（ANOVA）对四个实验组之间的连续变量进行分析，以检验整体差异。
   3. 对于不符合参数检验前提条件的变量，采用Kruskal-Wallis H检验。
2. 事后检验与显著性阈值
   1. 若初始ANOVA结果显示具有统计学显著性，则使用Tukey检验进行事后两两比较，以识别具体的组间差异。
   2. 仅依赖Tukey检验来控制整体误差率，不得结合其他多重比较校正方法。
   3. 将统计学显著性统一定义为 p < 0.05。

结果

步态分析
步态周期参数：摆动/支撑比——定义为单步态周期中非负重的摆动相持续时间与负重的支撑相持续时间之比——用于反映负重与推进功能之间的平衡。与对照组（2.10 ± 0.06）相比，接受关节内注射胶原酶的小鼠（1.45 ± 0.05）或进行过度运动的小鼠（1.68 ± 0.05）均表现出显著降低的摆动/支撑比。值得注意的是，与单独胶原酶组或单独过度运动组相比，胶原酶联合过度运动组的该比值降低最为显著（0.93 ± 0.05）（p < 0.05）（见图2）。

距离参数：距离参数包括步长（单步过程中线性向前推进的距离）和步宽（对侧后爪在站立相峰值时内侧边缘之间的水平距离）。与对照组（步长：2.01 ± 0.23 cm；步宽：1.97 ± 0.26 cm）相比，仅接受关节内注射胶原酶的小鼠（步长：1.70 ± 0.18 cm；步宽：1.69 ± 0.12 cm）或联合过度运动处理的小鼠，其步长和步宽均显著降低。此外，与其他实验组相比，胶原酶联合过度运动组的降低最...

讨论

本研究建立了一种新型的膝骨关节炎（KOA）小鼠模型，通过关节内注射胶原酶联合基于转轮的疲劳诱导运动训练，模拟过度应力对关节的影响。这些发现再次证实了KOA是由生物因素与机械因素相互作用而产生的观点。深入理解并识别这些因素，有望为制定个体化治疗方案和预防策略提供依据，从而缓解症状，改善膝骨关节炎患者的生活质量¹³。此外，胶原酶还可降解肌腱和韧带内的胶原基质，导致关节不稳¹⁴。过度运动可引起机械性超负荷，最终诱发KOA¹⁵。与以往的KOA模型相比，该模型在致病机制方面更接近于人类机械性诱导的KOA。进一步地，在幼年动物（10周龄）中，关节内注射胶原酶联合过度运动可在较短时间内（数周）诱导出类似于老年小鼠自发性骨关节炎所见的关节改变。综上所述，采用幼年小鼠及高效的时间安排，使得实验性骨关节炎的研究更加便捷且经济可行。

骨关节炎（OA）的最初描述可追溯至1886年，当时英国的John K. Spender将其定义为一种累及膝关节的退行性改变，导致关...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛固定液	Beyotime	P0099
乙酸	国药集团	631-61-8
小鼠DigiGait成像系统	RWD生命科学	MSI-DIG-MS
EDTA溶液	Procell	PB180320
包埋盒	Leica	IP C
乙醇	国药集团	64-17-5
快绿染液	雷岩	1085995
脱毛膏	Veet	G20161330
苏木精	Adamas	61753A
高速冷冻离心机	Hermle	Z366K
培养箱	TAITEC	M-210FN
吸入式麻醉机	Ranger	RZ-Viking
异氟烷	Webio	w100
切片机	Ted Pella	10180-220
小鼠旋转式疲劳实验装置	北京智鼠多宝生物科技	YLS-10B
中性树胶	国药集团	96949-21-2
番红O染液	Bioss	S0062
半自动组织包埋中心	Thermo Fisher	HistoStar
载玻片烘干加热板	Electron Microscopy Sciences	XH-2002
组织漂浮水浴锅	BIOBASE	BT-I
II型胶原酶	Sigma-Aldrich	C4-22-1G
全切片扫描仪	Leica	Aperio VERSA
二甲苯	国药集团	1330-20-7