基于线性离子阱质谱法，对火香正奇口服液体中未知化合物结构分析的技术方法

Summary

这里，我们展示了一种标准方案，结合了多级质谱树和基于火相正奇口服液体的碎片过程。

Abstract

中药化合物（CHCs）在中医中扮演着不可替代的角色，近年来识别其复杂成分成为研究重点。火香正气口服液是一种经典的中国专利药，其化学成分需要在分子层面进一步研究。传统的质谱仪，如飞行时间谱和轨道阱，通常只提供次级碎片信息。基于线性离子阱质谱仪，化合物可以被更彻底地分解，从而获得更深层次的碎片信息。本文开发了一种针对CHC中未知化合物的结构探索技术，涵盖样品预处理、超高性能液相色谱制备、质谱准备、全谱检测、二次质谱检测、多级质谱测试及结果分析。代表性结果展示了化合物结构的推导过程。我们讨论了影响实验技术的因素，如异构体、聚羟基化合物和仪器分辨率。基于通过多级质谱断片推导未知化合物的微观分子结构，该实验方法具有多功能性，适用于中医中生物活性小分子的结构表征及其与药理机制的联系。

Introduction

作为中医（TCM）宝贵的资产，中药化合物（CHCs）积累了数千年的验证^{临床经验1}。它们在疾病预防、治疗干预和康复方面发挥着不可替代^的作用。通过多种草药协同作用，CHCs以整体方式治疗人体，贯彻整体主义和综合征分^{化疗法的核心}原则。在当代医学框架下，CHCs因其多药理机制与多靶点通路的结合而获得全球^{认可，广泛}应用于消化疾病、呼吸道感染和免疫调节^5。火香正奇口服液体（HXZQ）体现了经典的CHC配方⁶.其成分包含多种药用草药，如广藿香、紫苏叶、当归、甲蓿草、黄桃和干橘皮。它以能分泌出汗、清热、解湿和滋养脾^胃的功效而闻名7.HXZQ临床应用于治疗潮湿诱发的类流感综合征、上腹扩张、呕吐和腹^泻等疾病。技术进步使CHC研究从现象学观察转向分子、机制和化合物层面^{的研究，例如}利用蛋白质组学和代谢组学技术鉴定活性成分，从而为中医全球化奠定科学基础。因此，对HXZQ化学成分和药效动力学的严格分析不仅推动了CHC的标准化，也催化了创新药物发现¹⁰。

HXZQ是一种多种草药配方，其固有的化学复杂性源自其复合植物成分¹¹。HXZQ具有多种植物化学类别——包括挥发性油、香豆素、木酚素、多糖和生物碱——同时包含经过充分表征的生物活性化合物和大量结构上未注释的成分库¹²。关键成分（如挥发性油、类黄酮、生物碱）的动态波动可能因提取方案和储存条件的变化而发生，这凸显了系统化化学剖析的必要^性。在中医现代化框架下，对传统配方如HXZQ的深入成分分析不仅阐明了其治疗效果背后的材料基础，还为质量控制、标准化生产和不良^{事件监测提供了}实证支持。尽管HXZQ中高丰度化合物已被广泛记录，但其化学成分的相当一部分尚未被鉴定¹³。其组成部分的结构多样性，加上许多潜在生物活性分子的低丰度，使得仅用色谱法和光谱学等传统分析技术进行全面鉴定构成了巨大^挑战。值得注意的是，HXZQ中多种植物化学类别中存在异构现象，包括香豆素、木酚素和多糖，进一步复杂化结构分化¹⁵。准确化合物标注的其他障碍还包括分析物丰度低和基质干扰效应。综合来看，这些因素凸显了HXZQ研究的一个关键前沿：开发稳健的分析策略，以实现其完整化学补体的精确、高覆盖度鉴定。

现代质谱（MS）平台在表征复杂矩阵时面临固有局限，包括离子共洗伪影和不完整的光谱数据库覆盖率¹⁶。在此背景下，串联质谱（MS/MS）和多级质谱（MSⁿ） 已成为新颖 解析未知化合物结构的不可或缺的分析策略¹⁷。传统的高分辨率MS系统如四极飞行时间（Q-TOF）MS和Orbitrap MS能生成高质量的MS/MS片段数据，但其实用性仅限于单阶段碎片事件。尽管存在这些限制，这些平台仍以卓越的灵敏度和分辨率提供丰富的结构洞察，尤其是在分析复杂混合物^时。相比之下，线性离子阱（LIT）MS采用多级碰撞诱导解离（CID）模式，实现分子离子的顺序迭代碎裂。这一独特能力允许逐步解剖化合物骨架和官能团，便于结构多样的未知分析物的明确定性鉴定¹⁹。为满足复杂CHC基质全面表征的未满足需求，本研究提出了基于LIT-MS的分析流程，专为未知化合物鉴定量身定制。利用LIT的高离子捕获效率和快速扫描速度，该方法提升 了新造 结构标注的通量和准确性。将该工作流程应用于HXZQ的目标是：（1）补充现有方法，用于分析HXZQ中未表征的化学成分;（2）建立技术框架以支持其他CHC配方的标准化研究;以及（3）加速中医从实证实践向循证精准医疗的转化。

Protocol

1. 样品预处理

1. 打开商业版HXZQ的包装。准确地将0.1毫升HXZQ注入2毫升样品瓶，然后加入0.9毫升水。摇晃溶液直到完全混合。
2. 准备注射注射器（1毫升）和微孔膜滤纸（0.22微米）。将溶液过滤到一个新的2毫升样品瓶中。
   注意：在实验过程中请采取适当的个人预防措施。

2. 超高性能液相色谱（UPLC）制备

1. 双击 Xcalibur 软件。点击 “准备下载”，然后点击 “直接控制 ”按钮。点击弹窗中的 泵模块 列，将%B设为50，%C为0，%D设为0（见图1）。
2. 点击 电机 按钮切换到开启状态。点击 “更多选项 ”按钮，弹出窗口将流量设置为5 [mL/min]，时间设置为180 [s]。点击“ 清除 ”按钮，然后点击弹窗中的 确定 按钮。
   注意：流动相在无色谱柱的情况下保持恒定，速率为0.3 mL/min，含50% A（0.1%甲酸溶液）和50% B（乙腈），无色谱柱温度。默认注射容量通常为1微升。

3. 手稿准备

1. 返回软件主窗口，点击“ 序列设置视图 ”按钮。点击 “打开 ”按钮导入已编辑的模板，右键点击 方法名称 ，点击 打开 文件按钮打开方法文件。
2. 在弹出的“仪器设置”窗口中，将第一个质量（m/z）设置为100， 最后质量 （m/z）设置为1200。点击 “保存 ”按钮保存该方法。
   注：默认的MS条件包括离子源温度为350°C，初始MS范围为80至1200 Da，碰撞模式为碰撞诱导解离（CID），碰撞能量为35。

4. 完整的MS测试

1. 点击“ 运行序列 ”按钮，然后在弹窗中点击 “确定 ”按钮。等待样品注入完成（见图2）。
   注意：测试前，请将2毫升的样品瓶放入仪器的样品托盘中。
2. 点击 路线图视图 按钮，点击 资格浏览器 图标以打开资格浏览器窗口。点击 打开 按钮，选择文件夹中.raw格式 的数据文件 ，双击即可打开该文件。
3. 右键点击 色谱图窗口，然后点击 范围 按钮。在扫描筛选部分，选择 ESI全MS。在“地块类型”部分，选择 TIC。点击 确定 按钮，窗口会显示样品的总离子色谱图。
4. 点击质谱窗口右上角的 按针 按钮。
5. 在色谱图窗口中，点击并滑动，选择相对丰度最强的时间 区域 。质谱窗口会显示对应的质谱离子。记录下一级质谱的m/z值。

5. MS/MS测试

1. 返回仪器设置窗口。在n=2行的母质量列中，输入上一步记录的化合物的m/z值。点击 “保存 ”按钮保存该方法。
2. 返回软件窗口。点击“ 序列设置视图 ”按钮，修改文件名，然后点击 “保存 ”按钮保存序列。
3. 点击“ 运行序列 ”按钮，然后在弹窗中点击 “确定 ”按钮。等待样品注射完成。
4. 返回Qual浏览器窗口。点击 打开 按钮，选择文件夹中格式.raw 数据文件 ，双击即可打开该文件
5. 右键点击 色谱图窗口，然后点击 范围 按钮。在扫描筛选部分，选择 ESI全MS。在“地块类型”部分，选择 TIC。点击 确定 按钮，窗口会显示样品的总离子色谱图。
6. 点击质谱窗口右上角的 按针 按钮。
7. 在色谱图窗口中，点击并滑动，选择相对丰度最强的时间 区域 。质谱窗口会显示对应的质谱离子。记录下一级质谱的m/z值。

6. MSⁿ 检验

1. 返回仪器设置窗口。在n=3行的母质量列中，输入上一步记录的化合物的m/z值。点击 “保存 ”按钮保存该方法。
2. 重复步骤4.2至4.5以完成样品注入和数据查看。一旦没有稳定的片段离子，停止MSⁿ 分析。

7. 参数优化

1. 返回仪器设置窗口。在act类型列，点击 CID ，然后选择 PQD或ETD 以更改碰撞模式。
2. 在归一化碰撞能量栏中，点击 35 ，然后设置为20或50以更改碰撞能量。
   注意：将所有化学残留物和溶剂混合到有机废物容器中。

8. 结果分析

1. 在绘图软件中手动绘制母离子和碎裂离子，包括母离子结构、化合物名称和质量电荷比（m/z）值。
2. 例如，对于未知化合物m/z=623.21，观察由此产生的断裂过程。这里，片段中间体在MS/MS的m/z=461.15。质量差为162.06 Da，对应六核结构。
3. 进一步分析，中间体片段m/z=461.15再次碎裂，形成新白天使骨，m/z=315.09^。质量差为146.06 Da，对应于脱氧六亚甲酰糖结构。即m/z=461.15的中间体比新白天使高出一个去氧六甲基糖单位。
4. 在新白天使骨的结构中，分析其结合位置。这里，暴露的羟基是最有可能与脱氧六甲基糖连接的位置。同样，脱氧六甲基糖单元C1处的羟基最有可能与己糖相连。最后，得到未知化合物的结构，m/z=623.21。

Results

我们建议先收集所有m/z信息，然后计算母离子与碎片离子之间的质量差值。找到数据库或文献中报告的化合物，然后基于已知结构反向推断未知化合物结构。

所有检测到的化合物及其对应的片段离子均以m/z值表示。其中部分片段离子可与认证参考标准²⁰进行匹配。未知目标化合物结构通过系统性地修饰这些结构诊断性中间体的官能基组装而成。

我们对未知化合物进行了MS/MS断片，m/z=623.21。去除一个己糖单位后，该化合物得到一个中间体片段，m/z=461.15。通过三级质谱（MS³）断裂，中间体失去一个rhamnos单位，产生m/z=315.09的新白天使骨。通过随后的四极质谱（MS⁴），新白天使高石基于其苯环结构进一步产生了m/z=135.09的片段离子。因此，推断出了该未知化合物的结构（见图3A）。

Discussion

LIT-MS及其MSⁿ 断裂技术的结合，提供了识别CHC中未知化合物的方法。与Orbitrap和Q-TOF质谱中传统的串联质谱模式不同，线性离子阱可以特异性捕获靶离子，有效避免共洗^脱离子的干扰。该方法实现分子级精度，提供相对准确的化学结构信息，部分解决了数据库缺口导致的未知化合物鉴定难题。

糖苷、多糖、类黄酮及其他化合物广泛存在于^CHCs中。线性离子阱中这些组分的破碎模式值得关注。在多糖的MSⁿ 切割过程中，糖苷键最容易发生²⁵。当分子断裂为单糖时，分子内脱水可能进一步形成内酯。鉴于碳水化合物中羟基和众多异构体的丰富性，较低的碰撞能可能诱导母体离子的脱水反应，从而掩盖分子结构。增加碰撞能可以诱导分子中的碳-碳裂解，有助于确定碳水化合物的环状结构。

在实验过程中，若化合物断裂不...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
丙腈	Thermo Scientific	CAS 75-05-8	液态
甲酸	Thermo Scientific	CAS 64-18-6	液态
藿香正气口服液	重庆太极实业（集团）有限公司	国家药品标准代码Z50020409	研究对象
线性离子阱质谱仪	Thermo Scientific	LTQ XL	IT-MS仪器
液相色谱仪	Thermo Scientific	U3000	UPLC仪器
Xcalibur	Thermo Scientific	版本2.0	UPLC-IT-MS操作软件