本文展示了一种标准方案，该方案将多级质谱树与基于藿香正气口服液的碎裂过程相结合。
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本文内容
摘要
摘要
中药复方在中医药中具有不可替代的作用，近年来，对其复杂成分的鉴定已成为重要的研究方向。藿香正气口服液是一种经典的中成药，其化学成分尚需在分子水平上进一步深入研究。传统的质谱仪，如飞行时间质谱和Orbitrap质谱，通常仅能提供二级碎片信息。而基于线性离子阱质谱仪的技术可实现更彻底的化合物裂解，从而获得更深入的碎片信息。本文建立了一种针对中药复方中未知化合物的结构解析技术，涵盖样品前处理、超高效液相色谱制备、质谱样品制备、全谱检测、二级质谱检测、多级质谱检测及结果分析等环节。代表性结果展示了化合物结构的推导过程。我们讨论了影响实验技术的因素，如异构体、多羟基化合物及仪器分辨率等。通过多级质谱碎片化手段推导未知化合物的微观分子结构，所建立的实验方法具有良好的通用性，适用于中药中生物活性小分子的结构表征及其与药理机制的关联研究。
引言
中药复方（CHCs）作为中医药的宝贵财富，积累了数千年的临床验证经验1。其在疾病预防、治疗干预和康复过程中发挥着不可替代的作用2。通过多味药材的协同作用，中药复方对人体进行整体调节，体现了整体观和辨证论治的核心理念3。在现代医学体系中，中药复方因其多靶点、多通路的多效药理机制而获得全球认可4，广泛应用于消化系统疾病、呼吸道感染及免疫调节等领域5。藿香正气口服液（HXZQ）是经典中药复方制剂的代表之一6。其组方包含广藿香、紫苏叶、白芷、苍术、茯苓、陈皮等多种中药材，以具有解表化湿、理气和中、健脾和胃的功效而著称7。临床上，HXZQ常用于治疗湿阻所致的流感样症状、脘腹胀满、呕吐及腹泻等病症8。随着技术进步，中药复方研究已从现象观察转向分子水平、作用机制及活性成分的深入探究9，例如利用蛋白质组学和代谢组学技术鉴定其活性成分，为中医药的全球化奠定科学基础。因此，对HXZQ化学成分和药效动力学的系统分析，不仅有助于推进中药复方的标准化，也推动了创新药物的研发10。
HXZQ 是一种多味草药复方制剂，其固有的化学复杂性源于其组成的植物成分11。该复方含有多种植物化学成分类别，包括挥发油、香豆素、木脂素、多糖和生物碱等，其中既包含已被充分表征的生物活性化合物，也含有大量结构尚未注释的成分12。由于提取方法和储存条件的差异，关键成分（如挥发油、黄酮类、生物碱）可能发生动态变化，凸显了系统性化学剖析的重要性6。在中医药（TCM）现代化的框架下，对 HXZQ 等经典方剂进行深入的成分分析，不仅有助于阐明其疗效的物质基础，也为质量控制、标准化生产和不良事件监测提供了实证支持10。尽管 HXZQ 中高丰度化合物已有广泛报道，但其化学成分的相当一部分仍待明确13。成分的结构多样性，加之许多潜在生物活性分子丰度较低，使得仅依靠色谱和光谱等传统分析技术难以实现全面鉴定14。值得注意的是，HXZQ 中多个植物化学类别（如香豆素、木脂素和多糖）普遍存在异构现象，进一步增加了结构区分的难度15。此外，待测物丰度低和基质干扰效应也构成了准确化合物注释的额外障碍。上述因素共同凸显了 HXZQ 研究中的一个关键前沿方向：开发稳健的分析策略，以实现对其全部化学成分的精确、高覆盖度鉴定。
现代质谱（MS）平台在表征复杂基质时面临固有局限性，包括离子共洗脱干扰和质谱数据库覆盖不全16在此背景下，串联质谱法（MS/MS）和多级质谱法（MSn已成为不可或缺的分析策略 从头合成 未知化合物的结构解析17尽管传统的高分辨率质谱系统（如四极杆飞行时间质谱（Q-TOF MS）和Orbitrap MS）能够生成高质量的MS/MS碎片数据，但其应用受限于单级碎裂事件。尽管存在这一限制，这些平台在分析复杂混合物时仍能以极高的灵敏度和分辨率提供丰富的结构信息18相比之下，线性离子阱（LIT）质谱采用多级碰撞诱导解离（CID）模式，可实现分子离子的逐级、迭代式碎裂。这一独特功能能够对化合物骨架和官能团进行逐步解析，有助于对结构多样的未知分析物进行明确的定性鉴定。19为解决复杂CHC基质全面表征尚未满足的需求，本研究提出一种基于线性离子阱质谱（LIT-MS）的分析流程，专为未知化合物鉴定而设计。该方法利用LIT的高离子捕获效率和快速扫描速度，显著提升了分析通量与准确性 从头合成 结构注释。将该工作流程应用于HXZQ旨在：（1）补充现有方法，用于表征HXZQ中尚未明确的化学成分；（2）建立支持其他中药复方制剂标准化研究的技术框架；（3）推动中医药从经验实践向基于证据的精准医学转化。
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方案
1. 样品预处理
- 打开市售HXZQ的包装。准确移取0.1 mL HXZQ至一个2 mL样品瓶中，然后加入0.9 mL水。振荡溶液直至充分混匀。
- 准备一支注射器（1 mL）和一个微孔滤膜（0.22 μm）。将溶液过滤至一个新的2 mL样品瓶中。
注意：实验操作过程中应采取适当的个人防护措施。
2. 超高效液相色谱（UPLC）样品制备
- 双击 Xcalibur 软件。点击 Ready to Download，然后点击 Direct Control 按钮。在弹出窗口中点击 Pump Module 列，将 %B 设为 50，%C 设为 0，%D 设为 0（图 1）。
- 点击 Motor 按钮将其切换至开启状态。点击 More Options 按钮，在弹出窗口中将流速（Flow）设为 5 [mL/min]，时间（Time）设为 180 [s]。点击 Purge 按钮，然后在弹出窗口中点击 OK 按钮。
注意：在未安装色谱柱的情况下，流动相保持恒定，流速为 0.3 mL/min，其中 A 相为 50%（0.1% 甲酸溶液），B 相为 50%（乙腈），不控制柱温。默认进样体积通常为 1 μL。
3. 质谱样品制备
- 返回软件主窗口，点击 Sequence Setup View 按钮。点击 Open 按钮以导入已编辑的模板，右键单击 Method Name，然后点击 Open File 按钮以打开方法文件。
- 在弹出的仪器设置窗口中，将第一质量（m/z）设置为 100，将 Last Mass （m/z）设置为 1200。点击 Save 按钮以保存方法。
注意：默认的质谱条件包括离子源温度为 350 °C，初始质谱范围为 80 – 1200 Da，碰撞模式为碰撞诱导解离（CID），碰撞能量为 35。
4. 全扫描质谱测试
- 点击 运行序列 按钮，然后在弹出窗口中点击 确定 按钮。等待样品进样完成（图 2）。
注意：测试前，请将 2 mL 样品瓶放置在仪器的样品盘中。 - 点击 路线图视图 按钮，然后点击 Qual Browser 图标以打开 Qual Browser 窗口。点击 打开 按钮，在文件夹中选择 .raw 格式的 数据文件，然后双击以打开该文件。
- 在 色谱图窗口 中右键单击，然后点击 范围 按钮。在扫描过滤器部分，选择 ESI 全扫描质谱；在图谱类型部分，选择 TIC。点击 确定 按钮，窗口将显示样品的总离子流色谱图。
- 点击质谱图窗口右上角的 图钉 按钮。
- 在色谱图窗口中，点击并滑动以选择相对丰度最强的 时间区间。质谱图窗口将显示相应的质谱离子。记录 m/z 值，用于下一级质谱分析。
5. 串联质谱检测
- 返回仪器设置窗口。在 n=2 行的母离子质量（Parent Mass）列中，输入上一步记录的化合物的 m/z 值。单击 保存 单击按钮以保存方法。
- 返回软件窗口。点击 序列设置视图 按钮，修改文件名，然后单击 保存 单击按钮以保存序列。
- 点击 运行序列 按钮，然后单击 好的 弹出窗口中的按钮。等待样品注入完成。
- 返回至 Qual Browser 窗口。点击 打开 按钮，选择 数据文件 文件夹中的 .raw 格式文件，双击打开
- 右键单击 色谱图窗口，然后点击 范围 按钮。在扫描滤波器部分，选择 ESI 全扫描质谱在“图表类型”部分，选择 TIC. 点击 好的 按钮，然后窗口将显示样品的总离子色谱图。
- 点击 图钉 质谱窗口右上角的按钮
- 在色谱图窗口中，点击并滑动以选择一个 时间区域 相对丰度最强的峰。质谱窗口将显示相应的质谱离子。记录下一级质谱分析所需的质荷比（m/z）值。
6. MSn 测试
- 返回仪器设置窗口。在 n=3 行的母离子质量列中，输入上一步记录的化合物的 m/z 值。点击 保存 按钮以保存方法。
- 重复步骤 4.2 至 4.5，完成样品进样和数据查看。一旦未观察到稳定的碎片离子，即停止 MSn 分析。
7. 参数优化
- 返回仪器设置窗口。在碎裂类型（act type）列中，单击 CID，然后选择 PQD 或 ETD 以更改碰撞模式。
- 在归一化碰撞能量（normalized collision energy）列中，单击 35，然后将其设置为 20 或 50 以更改碰撞能量。
注意：将所有化学残留物和溶剂合并至有机废液容器中。
8. 结果分析
- 在绘图软件中手动绘制母离子和碎片离子，包括母离子结构、化合物名称以及质荷比（m/z）值。
- 例如，对于质荷比 m/z=623.21 的未知化合物，观察其产生的碎片谱图。其中，在 MS/MS 中得到的碎片中间体的 m/z=461.15，质量差为 162.06 Da，对应一个己糖结构。
- 进一步分析发现，该 m/z=461.15 的碎片中间体在 MS3 中再次碎裂，生成新佛手柑素（neobyakangelicol），其 m/z=315.09，质量差为 146.06 Da，对应一个脱氧己甲基糖结构。也就是说，该 m/z=461.15 的中间体比新佛手柑素多一个脱氧己甲基糖单元。
- 在新佛手柑素的结构中分析其连接位点。此处，暴露的羟基最有可能与脱氧己甲基糖相连；同样，脱氧己甲基糖单元上 C1 位的羟基最有可能与己糖相连。最终确定 m/z=623.21 未知化合物的结构。
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结果
我们建议首先汇总所有所需的质荷比（m/z）信息，然后计算母离子与碎片离子之间的质量差值。通过查找数据库或文献中已报道的化合物，进而基于该已知结构逆向推导未知化合物的结构。
所有检出的化合物及其相应的碎片离子均以质荷比（m/z）值表示。其中一部分碎片离子可与经过验证的参考标准品相匹配20。未知目标化合物的结构通过逐步修饰这些具有结构诊断意义的中间体，并系统性地进行官能团改造而逐步构建。
我们对质荷比（m/z）为623.21的未知化合物进行了MS/MS碎裂分析。去除一个己糖单元后，该化合物生成了一个质荷比为461.15的中间碎片。通过三级质谱（MS3）碎裂，该中间体进一步失去一个鼠李糖单元，生成质荷比为315.09的新补骨脂醇（neobyakangelicol）。随后通过四级四极杆质谱（MS4）分析，新补骨脂醇基于其苯环结构进一步产生了一个质荷比为135.09的碎片离子。据此，推断出该未知...
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讨论
LIT-MS 及其 MSn 碎裂技术的结合为鉴定碳氢化合物（CHCs）中的未知化合物提供了一种方法。与轨道阱（Orbitrap）和飞行时间质谱（Q-TOF MS）中的传统串联质谱模式不同，线性离子阱能够特异性捕获目标离子，有效避免共洗脱离子的干扰23。该方法可实现分子水平的精确鉴定，提供相对准确的化学结构信息，从而部分解决了因数据库缺失而导致未知化合物难以定性的难题。
糖苷、多糖、黄酮类化合物及其他成分在中药复方中广泛存在24。这些成分在线性离子阱中的裂解模式值得关注。在多糖的MSn裂解过程中，糖苷键的断裂最容易发生25。当裂解生成单糖后，分子内脱水反应可能进一步发生，形成内酯。由于碳水化合物含有丰富的羟基且存在大量异构体，较低的碰撞能量可能诱导母离子发生脱水反应，从而掩盖其分子结构。提高碰撞能量可诱导分子发生碳-碳键断裂，有助于确定碳水化合物的环状结构。
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由重庆市科研机构绩效激励引导专项（cstc2022jxjl120005）、重庆市教育委员会科学技术研究项目（KJZD-K202315102）、重庆市医学科研项目（重庆市卫生健康委员会与科学技术局联合项目，2022DBXM007）以及成都中医药大学杏林学者院内专项（YYZX202160）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | 液态 |
| 甲酸 | Thermo Scientific | CAS 64-18-6 | 液态 |
| 藿香正气口服液 | 重庆太极实业（集团）股份有限公司 | 国家药品标准编号 Z50020409 | 研究对象 |
| 线性离子阱质谱仪 | Thermo Scientific | LTQ XL | IT-MS 仪器 |
| 液相色谱仪 | Thermo Scientific | U3000 | UPLC 仪器 |
| Xcalibur | Thermo Scientific | 版本 2.0 | UPLC-IT-MS 操作软件 |
参考文献
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