本文展示了一种标准方案，该方案将多级质谱树与基于藿香正气口服液的碎裂过程相结合。
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本文内容
摘要
摘要
中药复方在中医药中具有不可替代的作用，近年来，对其复杂成分的鉴定已成为重要的研究方向。藿香正气口服液是一种经典的中成药，其化学成分尚需在分子水平上进一步深入研究。传统的质谱仪，如飞行时间质谱和Orbitrap质谱，通常仅能提供二级碎片信息。而基于线性离子阱质谱仪的技术可实现更彻底的化合物裂解，从而获得更深入的碎片信息。本文建立了一种针对中药复方中未知化合物的结构解析技术，涵盖样品前处理、超高效液相色谱制备、质谱样品制备、全谱检测、二级质谱检测、多级质谱检测及结果分析等环节。代表性结果展示了化合物结构的推导过程。我们讨论了影响实验技术的因素，如异构体、多羟基化合物及仪器分辨率等。通过多级质谱碎片化手段推导未知化合物的微观分子结构，所建立的实验方法具有良好的通用性，适用于中药中生物活性小分子的结构表征及其与药理机制的关联研究。
引言
中药复方（CHCs）作为中医药的宝贵财富，积累了数千年的临床验证经验1。其在疾病预防、治疗干预和康复过程中发挥着不可替代的作用2。通过多味药材的协同作用，中药复方对人体进行整体调节，体现了整体观和辨证论治的核心理念3。在现代医学体系中，中药复方因其多靶点、多通路的多效药理机制而获得全球认可4，广泛应用于消化系统疾病、呼吸道感染及免疫调节等领域5。藿香正气口服液（HXZQ）是经典中药复方制剂的代表之一6。其组方包含广藿香、紫苏叶、白芷、苍术、茯苓、陈皮等多种中药材，以具有解表化湿、理气和中、健脾和胃的功效而著称7。临床上，HXZQ常用于治疗湿阻所致的流感样症状、脘腹胀满、呕吐及腹泻等病症8。随着技术进步，中药复方研究已从现象观察转向分子水平、作用机制及活性成分的深入探究9，例如利用蛋白质组学和代谢组学技术鉴定其活性成分，为中医药的全球化奠定科学基础。因此，对HXZQ化学成分和药效动力学的系统分析，不仅有助于推进中药复方的标准化，也推动了创新药物的研发10。
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方案
1. 样品预处理
- 打开市售HXZQ的包装。准确移取0.1 mL HXZQ至一个2 mL样品瓶中，然后加入0.9 mL水。振荡溶液直至充分混匀。
- 准备一支注射器（1 mL）和一个微孔滤膜（0.22 μm）。将溶液过滤至一个新的2 mL样品瓶中。
注意：实验操作过程中应采取适当的个人防护措施。
2. 超高效液相色谱（UPLC）样品制备
- 双击 Xcalibur 软件。点击 Ready to Download，然后点击 Direct Control 按钮。在弹出窗口中点击 Pump Module 列，将 %B 设为 50，%C 设为 0，%D 设为 0（图 1）。
- 点击 Motor 按钮将其切换至开启状态。点击 More Options 按钮，在弹出窗口中将流速（Flow）设为 5 [mL/min]，时间（Time）设为 180 [s]。点击 Purge 按钮，然后在弹出窗口中点击 OK
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结果
我们建议首先汇总所有所需的质荷比（m/z）信息，然后计算母离子与碎片离子之间的质量差值。通过查找数据库或文献中已报道的化合物，进而基于该已知结构逆向推导未知化合物的结构。
所有检出的化合物及其相应的碎片离子均以质荷比（m/z）值表示。其中一部分碎片离子可与经过验证的参考标准品相匹配20。未知目标化合物的结构通过逐步修饰这些具有结构诊断意义的中间体，并系统性地进行官能团改造而逐步构建。
我们对质荷比（m/z）为623.21的未知化合物进行了MS/MS碎裂分析。去除一个己糖单元后，该化合物生成了一个质荷比为461.15的中间碎片。通过三级质谱（MS3）碎裂，该中间体进一步失去一个鼠李糖单元，生成质荷比为315.09的新补骨脂醇（neobyakangelicol）。随后通过四级四极杆质谱（MS4）分析，新补骨脂醇基于其苯环结构进一步产生了一个质荷比为135.09的碎片离子。据此，推断出该未知.......
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讨论
LIT-MS 及其 MSn 碎裂技术的结合为鉴定碳氢化合物（CHCs）中的未知化合物提供了一种方法。与轨道阱（Orbitrap）和飞行时间质谱（Q-TOF MS）中的传统串联质谱模式不同，线性离子阱能够特异性捕获目标离子，有效避免共洗脱离子的干扰23。该方法可实现分子水平的精确鉴定，提供相对准确的化学结构信息，从而部分解决了因数据库缺失而导致未知化合物难以定性的难题。
糖苷、多糖、黄酮类化合物及其他成分在中药复方中广泛存在24。这些成分在线性离子阱中的裂解模式值得关注。在多糖的MSn裂解过程中，糖苷键的断裂最容易发生25。当裂解生成单糖后，分子内脱水反应可能进一步发生，形成内酯。由于碳水化合物含有丰富的羟基且存在大量异构体，较低的碰撞能量可能诱导母离子发生脱水反应，从而掩盖其分子结构。提高碰撞能量可诱导分子发生碳-碳键断裂，有助于确定碳水化合物的环状结构。
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由重庆市科研机构绩效激励引导专项（cstc2022jxjl120005）、重庆市教育委员会科学技术研究项目（KJZD-K202315102）、重庆市医学科研项目（重庆市卫生健康委员会与科学技术局联合项目，2022DBXM007）以及成都中医药大学杏林学者院内专项（YYZX202160）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | 液态 |
| 甲酸 | Thermo Scientific | CAS 64-18-6 | 液态 |
| 藿香正气口服液 | 重庆太极实业（集团）股份有限公司 | 国家药品标准编号 Z50020409 | 研究对象 |
| 线性离子阱质谱仪 | Thermo Scientific | LTQ XL | IT-MS 仪器 |
| 液相色谱仪 | Thermo Scientific | U3000 | UPLC 仪器 |
| Xcalibur | Thermo Scientific | 版本 2.0 | UPLC-IT-MS 操作软件 |
参考文献
- Chao, J., et al. Major achievements of evidence-based traditional Chinese medicine in treating major diseases. Biochem Pharmacol. 139, 94-104 (2017).
- Zou, Q., et al. The role and mechanism of TCM in the prevention a....
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