本研究建立了一种三维（3D）培养模型，可在体外支持人类卵泡从次级阶段发育至窦状阶段。in vitro条件下，该系统能够促进卵泡生长和窦腔形成，同时保留体细胞的分子特征，为人类卵泡发生研究提供了重要的模型体系。
研究文章
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本研究建立了一种三维（3D）培养模型，可在体外支持人类卵泡从次级阶段发育至窦状阶段。in vitro条件下，该系统能够促进卵泡生长和窦腔形成，同时保留体细胞的分子特征，为人类卵泡发生研究提供了重要的模型体系。
人类卵巢卵泡发生是一个复杂且受到严密调控的过程，直接研究具有较大挑战性 体内。尽管 体外 模型对于机制研究至关重要，但现有体系仍不理想，因其无法重现卵泡发育的时空动态过程。本研究提出了一种支持人类卵泡从次级阶段发育至窦状阶段的三维培养模型。该模型成功重现了关键的 体内 形态学事件，包括持续的卵泡生长、从第10天开始的显著直径扩张阶段，以及约第20天时的卵泡腔形成。重要的是，这一发育过程最终成功获得了处于生发泡（GV）阶段的存活卵母细胞。此外，免疫荧光分析显示，体细胞中促性腺激素受体具有明确的表达模式，符合颗粒细胞和膜细胞的身份特征。内层类似颗粒细胞表现出高水平的卵泡刺激素受体（FSHR），而外层类似膜细胞则显示高水平的黄体生成素受体（LHR）表达。该模型为研究人类卵泡发生及生殖毒理学提供了有价值的平台，并为优化相关体系提供了参考 体外 用于次级至窦腔阶段发育的卵泡培养系统
从原始卵泡到排卵前阶段的卵巢卵泡发育生理过程，是女性生育力的基础1该过程涉及一系列高度协调的事件，包括卵母细胞的生长与成熟以及颗粒细胞的增殖与分化2这些复杂机制的紊乱是导致不孕症和卵巢功能障碍的主要原因。因此，深入了解卵泡生成过程中所涉及的调控网络——包括旁分泌信号、卵母细胞-体细胞相互作用以及细胞外基质动态变化——在病理生理学上具有重要意义。然而，对人类卵泡生成的直接研究 体内 仍受限于伦理和实际限制，推动了对可靠方法的需求 体外 用于阐明这些机制的模型。尽管已有进展，但仍严重缺乏能够支持人类卵泡发育（特别是从次级卵泡到有腔卵泡阶段）的长期培养模型。
尽管二维（2D）或三维（3D）基质中的人类卵泡培养已推动了对早期卵泡发育的理解3,4，此类系统在支持向后期阶段发展方面仍然存在局限性。值得注意的是，实现人类卵泡发生 体外 由于卵泡体积更大且成熟时间更长，使其在后续发育阶段仍面临显著挑战5. 即使在有限数量的人类 体外 成功获得MII期卵母细胞的卵泡培养系统，其成熟率仍然较低（最多约为20%）6,7,8,9也许更根本的挑战在于次级卵泡向窦状卵泡过渡阶段的再现，这一阶段至关重要且结构复杂，迄今尚未得到充分的模型化模拟。 体外.
本研究建立了一种支持的三维培养模型 体外 人类次级卵泡发育为具有明显腔隙结构的窦状卵泡。该模型为进一步研究人类卵泡发育的调控机制提供了基础平台，并为未来优化针对次级至窦状卵泡发育的卵泡培养系统提供了参考。
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本研究方案已通过北京大学第三医院伦理委员会审查并批准（批准号：M2024151）。所有参与研究的未成年人的法定监护人均已签署知情同意书。
组织来源
本方案所用的人卵巢髓质组织来自四名被诊断为卵巢畸胎瘤的儿科患者（年龄分别为2岁、6岁、13岁和16岁），这些患者为科研目的捐赠了卵巢组织（表1）。卵巢皮质用于卵巢组织冷冻保存研究，而剩余的髓质组织则用于本研究中的体外卵泡培养。共分离出33个次级卵泡，其中16个卵泡分配至对照组，17个分配至3D培养组。
试剂制备
运输培养基由添加了10%血清替代补充剂的Leibovitz's L-15培养基组成，储存于4 °C。完全消化液通过在MEMα中添加0.04 mg/mL Liberase DH、10 IU/mL DNase I和100 IU/mL青霉素-链霉素配制而成，储存于-20 °C。消化终止液为添加了10%血清替代补充剂的DPBS，储存于4 °C。完全生长培养基通过在MEMα中添加10%血清替代补充剂、1%胰岛素-转铁蛋白-硒、50 µg/mL L-抗坏血酸、2 mM丙酮酸钠和100 IU/mL青霉素-链霉素配制而成，储存于4 °C。如先前研究所述10，在培养开始时加入重组人促卵泡激素（FSH），终浓度为100 mIU/mL。当显微镜下观察到早期腔隙形成（约第20天）时，在换液过程中补充重组人黄体生成素（LH），终浓度为10 mIU/mL。固体培养基质通过将70%（v/v）基底膜基质与30%（v/v）冰冷新鲜完全生长培养基混合配制，并在所有操作步骤中保持在冰上。
组织消化与次级卵泡的分离
将卵巢组织置于运输培养基中，并在4 °C条件下运送至实验室。在无菌条件下，使用手术刀剥离卵巢髓质。将组织切成薄片（约3 × 3 × 1 mm），再用组织切片器进一步切碎为小片段（约0.5 × 0.5 × 1 mm），全程保持组织湿润。将切碎的组织转移至35 mm培养皿中，按每100 mg组织加入2 mL预热的完全消化液。于37 °C孵育45–80分钟（平均：60 ± 15分钟），期间每10分钟轻柔混匀一次。当显微镜下观察到间质基质松解并释放出单个卵泡时，终止消化（图1）。在体视显微镜下，使用玻璃口控移液管（内径200 µm）挑选健康的次级卵泡（直径100–200 µm，具有≥2层颗粒细胞层及可见的卵母细胞），并用预热的完全生长培养基洗涤两次。
三维包埋与长期培养
将细胞培养小室置于已加入2 mL完全生长培养基并预先在培养箱中（37 °C，5% CO₂）平衡2小时的35 mm培养皿中。挑选的次级卵泡转移至培养小室内，并在相同条件下过夜预培养。预培养结束后，对照组卵泡直接在培养小室内进行培养（二维培养）。相反，指定用于三维培养组的卵泡则需准备包埋于生长因子减少型基底膜基质中（总蛋白浓度为8~12 mg/mL）。将基质置于冰上解冻，并与30%（v/v）预冷的完全生长培养基混合。取40 µL混合液滴加至35 mm培养皿中（每皿最多六滴），形成高度约1.5 mm的均匀凝胶层。随后，使用玻璃口控移液管将单个次级卵泡转移至每滴混合液中，并小心地将其置于液滴中上三分之一位置，以防止其下沉。将培养皿放入培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育30分钟，以促进凝胶形成。待凝胶完全固化后，轻柔地向培养皿中加入2 mL完全生长培养基，以启动长期培养。
培养物的维持与监测
每48小时用新鲜的完全生长培养基（含FSH）进行50%的换液。每日在体视显微镜下观察卵泡，记录其直径和形态学特征。当肉眼观察到早期腔隙形成（约第20天）时，在后续换液中向培养基中添加重组人LH。培养持续最多30天，或直至卵泡发育至腔前/腔状阶段（直径> 400 µm，并具有清晰可辨的充满液体的腔隙）。
培养后细胞解离
培养结束时，将窦状卵泡转移至含有新鲜DPBS的培养皿中，并使用无菌29号针头注射器进行机械解离。分离得到的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）被转移至另一培养皿中用于进一步分析。剩余的颗粒细胞和膜细胞悬液则转移至新的35 mm培养皿中，其中含有2 mL预热的完全生长培养基，轻轻晃动以确保细胞均匀分布，随后在37 °C、5% CO₂条件下培养48小时。
免疫荧光分析
培养后，细胞在室温下用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟。随后，样品用 PBS 洗涤三次，用 0.5% Triton X‑100 透化处理 20 分钟，然后在 4 °C 下用含 1% BSA 的 PBS 封闭过夜。细胞在 4 °C 下与一抗孵育过夜。所使用的一抗为抗 FSHR 抗体（兔源，1:200）和抗 LHR 抗体（小鼠源，1:100）。孵育后，细胞用含 1% BSA 的 PBS 洗涤三次，每次 15 分钟。随后，在避光条件下于室温下用荧光二抗（抗兔和抗小鼠，1:200）孵育 2 小时。最后，细胞再进行三次终末洗涤，每次持续 20 分钟。细胞核在室温下用 DAPI 染色 5 分钟。然后样品用含 1% BSA 的 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。使用 Operetta CLS 高内涵成像系统在共聚焦模式下进行成像。荧光信号通过以下通道采集：DAPI（405 nm）、Alexa Fluor 488（LHR）和 Alexa Fluor 647（FSHR），所有样品均采用一致的曝光设置。
统计分析
使用独立样本t检验对对照组与3D培养组在第5、10和15天的卵泡直径进行比较。当p值 < 0.05时，认为差异具有统计学意义。由于对照组中几乎所有卵泡在第15天后均未能存活，导致样本量不足，无法进行可靠且有意义的组间比较，因此未对第15天之后的卵泡直径进行统计分析。所有统计分析均使用GraphPad Prism（版本9.0）完成。
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开发支持人类卵泡生长至腔状阶段的三维培养模型
卵巢卵泡研究中的一个主要挑战是开发一种 体外 支持卵泡完全发育的培养系统，以形成卵泡腔作为关键里程碑。因此，本研究建立了一种用于人卵泡的三维培养模型 体外 (图2). 共从4名供者中分离出33个次级卵泡，其中16个分配至对照组（基于2D插入式培养），17个分配至3D培养组 （表1）培养第10天，对照组存活卵泡为9个（存活率：56.3%），3D培养组存活卵泡为10个（存活率：58.8%） （表1）到第20天时，对照组中无存活卵泡（存活率为0%），而三维培养组中仍有6个卵泡保持存活（存活率为35.3%） （表1）到第25天和第30天，三维培养组中仍有一个卵泡保持存活，对应存活率为5.9% （表1）值得注意的是，对照组中未观察到任何窦腔形成，而在3D培养组中，有5个卵泡成功形成了窦腔（窦腔形成率...
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成功维持人类卵巢卵泡 体外 通过次级卵泡向窦状卵泡的转变代表了一项重要的技术进步。本研究中，一种提供适当生物物理支持和阶段特异性激素信号的三维培养系统实现了这一发育进程。这些结果与近期证据一致，强调了采用三维培养系统以重现组织生理特性的必要性。尽管传统的二维单层培养操作简便，但缺乏实现天然细胞间及细胞-基质相互作用所需的空间结构，常导致细胞分化和功能的改变11,12在本研究中，对照组的16个卵泡来自4名供体，所有患者样本均表现出一致的退化动态，于培养第10天开始退化，第15天后无存活卵泡，且在整个培养期间未观察到卵泡腔的形成。相比之下，三维培养系统在卵泡存活率和发育效能方面表现出显著优势，培养第10天、第20天和第30天的卵泡存活率分别为58.8%、35.3%和5.9%，卵泡腔形成率达到29.4%。近期研究采用微流控包封、海藻酸盐液滴包封以及3D打印多孔支架等方法，已证实三维培养平台具备维持卵泡形态并支持其发育的能力13,
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所有作者均声明不存在任何利益冲突。
本工作得到北京市自然科学基金（Z230013）、国家自然科学基金（T2293764、82501980、82288102）及国家关键技术研发计划&中国“十四五”重点研发计划（2022YFC2703000）；北京大学临床医学+X青年学者项目（PKU2025PKULCXQ033）；北京大学第三医院临床重点专项（BYSYZD2021019）；高水平创新计划（202504841089）；中国博士后科学基金（GZC20230145）。示意图使用 https://BioRender.com 制作。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗FSHR | HuaBio | ER1909-08 | |
| 抗LHR | Santa Cruz | sc-293165 | |
| 抗小鼠（二抗） | Abcam | AB150113 | |
| 抗兔（二抗） | Abcam | AB205718 | |
| 用于类器官培养的基底膜基质 | MCE | K6004 | |
| BSA | Sigma | A1933 | |
| 细胞培养小室 | Millipore | PICMORG50 | |
| 培养皿 | 康宁 | 430165 | |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| DNase I | Thermo | EN0525 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | |
| FSH | 默克 | F4021 | |
| 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | Heracell 3111 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Gibco | 41400045 | |
| L-抗坏血酸 | MCE | HY-B0166 | |
| Leibovitz L-15 培养基 | Gibco | 11415064 | |
| LH | 默克 | L6420 | |
| Liberase DH | 罗氏 | 5401054001 | |
| McIlwain 组织切片机 | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MP10180-220 | |
| MEMα | Gibco | 41061029 | |
| 多聚甲醛 | Solarbio | P1110 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 血清替代补充剂 | 富士胶片 Irvine | 90194 | |
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360070 | |
| 体视显微镜 | 尼康 | SMZ1270 | |
| 高内涵成像系统 | PerkinElmer | Operetta CLS | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 |
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