本研究通过向 C57BL/6 小鼠施用甲基亚硝基脲以诱导视网膜损伤，随后联合使用 ALDH2 激活剂和抑制剂以及 SIRT1 和内质网应激（ERS）调节剂进行治疗。该实验方案旨在探讨这些治疗对视网膜变性的保护作用及其对醛类代谢的影响。
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研究文章
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本研究通过向 C57BL/6 小鼠施用甲基亚硝基脲以诱导视网膜损伤，随后联合使用 ALDH2 激活剂和抑制剂以及 SIRT1 和内质网应激（ERS）调节剂进行治疗。该实验方案旨在探讨这些治疗对视网膜变性的保护作用及其对醛类代谢的影响。
本研究探讨了醛脱氢酶2（ALDH2）激活（通过Alda-1）、ALDH2抑制（通过Daidzin）以及sirtuin 1（SIRT1）和内质网应激（ERS）的调控对C57BL/6小鼠中甲基亚硝基脲（MNU）诱导的视网膜损伤的保护作用。将72只小鼠随机分为八组，包括对照组、仅 MNU处理组以及多种治疗组合组。分别通过腹腔注射给予靶向ALDH2-SIRT1-ERS轴的激动剂和抑制剂。在治疗后第2天和第4天评估小鼠的体重、视网膜层厚度及醛类代谢生物标志物。MNU处理导致视网膜变性，并引起除对照组外所有组小鼠显著的体重下降。Alda-1治疗减轻了视网膜损伤，而Daidzin则加重了损伤。SIRT1的药理学抑制（通过EX-527）削弱了Alda-1的保护作用，而ERS诱导（通过TUN）几乎完全消除了其益处。相反，SIRT1激活（通过SRT1720）缓解了Daidzin的不利影响，而 ERS 抑制（通过4-PBA）部分减轻了Daidzin的作用。此外，MNU增加了醛类代谢标志物（丙二醛[MDA]和4-羟基-2-壬烯醛[4-HNE]）的水平，Alda-1可降低这些水平，而Daidzin则使其升高。此外，SIRT1/ERS通路的药理学调控干预了Alda-1和Daidzin对醛类代谢的调节作用。总体而言，ALDH2激活可保护视网膜结构并调节醛类代谢，凸显了ALDH2-SIRT1/ERS信号轴在缓解视网膜变性中的关键作用。
视网膜变性是全球致盲的主要原因之一，包括视网膜色素变性（RP）、年龄相关性黄斑变性（AMD）和糖尿病性视网膜病变（DR）等疾病，这些疾病共同影响着数以百万计的个体，并带来巨大的社会经济负担1,2,3。然而，目前临床上尚缺乏能够有效阻止这些致盲性视网膜疾病进展的药理学疗法。视网膜变性的发病机制是多因素的，涉及氧化应激、慢性炎症以及内质网应激（ERS），这些因素破坏了视网膜细胞的稳态。这些应激因素通常由内部代谢失调（例如线粒体功能障碍）引发，最终导致细胞凋亡和不可逆的视网膜损伤4。甲基亚硝基脲（MNU）是一种强效的DNA烷基化试剂，已被广泛用作建立视网膜变性模型的化学诱导剂5。MNU诱导的视网膜疾病模型为研究疾病机制和评估潜在治疗干预措施提供了有价值的工具。从机制上讲，MNU通过产生活性氧（ROS）并破坏氧化还原平衡来诱导氧化应激，从而损伤感光细胞膜和细胞器。这还可能影响醛类代谢，损害脂质过氧化产物的解毒过程。随后毒性醛类物质的积累可能加剧氧化损伤，放大感光细胞的凋亡过程6。
醛脱氢酶2（ALDH2）是一种线粒体中的NAD+依赖性酶，在通过将有毒醛类（如4-羟基-2-壬烯醛（4-HNE）和丙二醛（MDA））转化为反应性较低的羧酸来解毒过程中发挥关键作用，从而防止氧化损伤7。ALDH2活性的维持对红ox稳态至关重要，而ALDH2功能受损已被证实与加速衰老及神经退行性疾病病理过程相关8。药理学激活ALDH2（特别是通过小分子激动剂Alda-1）已在多种模型中被证明具有细胞保护作用9,10。Sirtuin 1（SIRT1）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸+（NAD+）依赖性去乙酰化酶，通过调控包括p53和核因子κB（NF-κB）在内的转录因子，调节应激反应和能量代谢11。SIRT1的激活在促进线粒体功能和细胞存活方面展现出潜力，研究显示其表达上调与视网膜变性中氧化损伤和炎症的减轻相关12。内质网应激（ERS）由错误折叠蛋白的积累引发，可激活未折叠蛋白反应（UPR），而在慢性应激条件下，该反应可能转变为促凋亡级联反应。ERS已被证实参与视网膜变性过程，导致感光细胞凋亡13。尽管已有上述发现，ALDH2、SIRT1与ERS在MNU诱导的视网膜变性模型中的具体相互作用仍不明确。此外，这些相互关联通路的协同作用仍需进一步系统性研究。
因此，本研究旨在探讨ALDH2-SIRT1-ERS轴的关键组分——ALDH2（通过Alda-1或Daidzin）、SIRT1（通过SRT1720或EX527）以及ERS（通过4-PBA或TUN）——对C57BL/6小鼠中MNU诱导的视网膜损伤的影响。通过组织病理学和生物化学分析，我们研究了靶向该轴对 感光细胞存活和醛类代谢的作用。我们假设，协同激活ALDH2、增强SIRT1以及抑制ERS可协同缓解MNU诱导的视网膜变性，从而为靶向该信号轴治疗视网膜变性疾病提供理论依据。
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伦理声明
所有实验方案均经福建医科大学附属福总临床医学院实验动物福利与使用委员会审查批准，并严格遵守视觉与眼科研究协会（ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明。
动物与分组分配
共从符合国家标准的实验动物供应商处获得72只雄性C57BL/6小鼠（8–10周龄，体重20–25 g）。小鼠饲养于独立通风笼具中，环境条件标准化：12小时光照/12小时黑暗循环，温度控制在22 ± 2 °C，相对湿度为50% ± 10%，并可自由摄食和饮水。为研究ALDH2、SIRT1和ERS的调节作用 通过计算机生成的随机化序列，将小鼠随机分配至八个实验组（每组 n = 9；第二天组 n = 5；第四天组 n = 4），以最小化选择偏倚，研究MNU诱导的视网膜损伤相关通路。本研究的图文摘要如下 如图所示 图1.
试剂准备与处理方案
本研究中使用的实验试剂列于材料表中，其配制方法和剂量详情如下。（1）MNU（50 mg/kg）：将100 mg MNU溶于2 mL生理盐水中，配制成50 mg/mL的溶液；然后取1.4 mL该溶液加入5.6 mL生理盐水稀释，最终浓度为10 mg/mL，用于动物给药。（2）Alda-1（10 mg/kg）：将50 mg Alda-1粉末溶于1 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配制成50 mg/mL的溶液，再用24 mL生理盐水稀释至终浓度为2 mg/mL。（3）Daidzin（10 mg/kg）：将50 mg Daidzin粉末溶于1 mL DMSO中，配制成50 mg/mL的溶液，再用24 mL生理盐水稀释至终浓度为2 mg/mL。（4）EX-527（10 mg/kg）：将5 mg EX-527粉末溶于0.1 mL DMSO中，配制成50 mg/mL的溶液，再用2.4 mL生理盐水稀释至终浓度为2 mg/mL。（5）SRT1720（10 mg/kg）：将5 mg SRT1720粉末溶于0.1 mL DMSO中并充分混匀，然后加入400 µL PEG300、50 µL Tween-80和450 µL生理盐水，配制成2 mg/mL的工作溶液。（6）TUN（10 mg/kg）：将5 mg TUN粉末溶于0.1 mL DMSO中，配制成50 mg/mL的溶液，再用2.4 mL生理盐水稀释至终浓度为2 mg/mL。（7）4-苯丁酸（4-PBA；10 mg/kg）：将2 mg 4-PBA粉末溶于1 mL生理盐水中，配制成2 mg/mL的溶液。上述所有给药体积均为5 × M 毫升（其中M = 动物体重，单位为kg）。随后，将小鼠分为八组，采用以下处理方案：
对照组：腹腔注射一次生理盐水。
MNU组：腹腔注射一次MNU。
MNU + Alda-1组：腹腔注射Alda-1，2小时后给予一次MNU。随后每天一次腹腔注射Alda-1。
MNU + Daidzin组：腹腔注射Daidzin，2小时后给予一次MNU注射。随后每天一次腹腔注射Daidzin。
MNU + Alda-1 + EX-527组：腹腔注射Alda-1，1小时后注射EX-527，再过1小时注射一次MNU（单次给药）。随后每天一次腹腔注射Alda-1。
MNU + Alda-1 + TUN组：腹腔注射Alda-1，1小时后注射TUN，再过1小时注射MNU。随后每天一次腹腔注射Alda-1。
MNU + Daidzin + SRT1720组：腹腔注射Daidzin，1小时后注射SRT1720，再过1小时注射MNU。随后每天一次腹腔注射Daidzin。
MNU + Daidzin + 4-PBA组：腹腔注射Daidzin，1小时后注射4-PBA，再过1小时注射MNU。随后每天一次腹腔注射Daidzin。
体重监测
通过在MNU给药后连续四天每天记录每只小鼠的体重，监测全身毒性及与治疗相关的生理效应。使用精度为±0.1 g的精密电子天平 测量体重，并记录数据以追踪各组体重减轻或增加的趋势，这些趋势可作为治疗耐受性和全身应激的间接指标。
视网膜组织病理学检查
在实验后第2天和第4天，小鼠经腹腔注射戊巴比妥钠（50–60 mg/kg 体重）麻醉后，采用颈椎脱位法处死，严格遵循机构的安乐死指南。立即摘除左眼。在摘除前，于鼻侧角膜缘处做一小切口以标记方位。眼球随后浸入4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，于4 °C固定24小时。固定后的眼球依次经梯度乙醇（70%、80%、95% 和 100%）脱水，二甲苯透明，最后包埋于石蜡块中以进行组织学处理。包埋过程中，通过将标记的鼻侧朝下以统一方位。
使用旋转式切片机沿视神经乳头（ONH）制备连续切片（厚度为 5 µm），以确保对中央视网膜区域进行具有代表性的取样。具体而言，切片从上方区域向标记的鼻侧点方向切割，确保所有切片均通过 ONH。随后将切片贴附于带正电荷的玻璃载玻片上。按照标准操作流程进行苏木精-伊红（HE）染色。采用光镜在 400× 放大倍数下评估视网膜形态。从距 ONH 预设距离的颞侧视网膜系统性地获取测量数据，距离分别为：200、400、600、800、1000 和 1200 µm。在每个位置测量总视网膜厚度、内节/外节（IS/OS）长度、外核层（ONL）厚度、外丛状层（OPL）厚度以及内核层（INL）厚度。
为确保客观性并尽量减少测量偏差，实施了严格的质控方案。具体而言，将八个实验组各自细分为五个或四个亚组（例如，亚组1、2、3、4、5）。指派五名或四名独立观察者，在不知分组信息的情况下，分别测量所有实验组中对应的同一亚组（例如，观察者A始终测量每个组的亚组1）。在每个测量位点，于约5 µm范围内获取三次读数（例如，在200 µm、195 µm和205 µm处），并取平均值以尽量减少技术误差。定量测量使用ImageJ软件（版本1.54g）进行，并计算每个位点的平均厚度值，以确保可重复性。
醛类代谢标志物
为评估氧化应激和醛类代谢情况，对血清样本中的 MDA 和 4-HNE 水平进行分析，这两者是脂质过氧化和醛类应激的关键生物标志物。具体而言，所有小鼠均通过腹腔（i.p.）注射戊巴比妥钠（剂量为每公斤体重 50–60 mg）进行麻醉。待小鼠深度麻醉后，采用颈椎脱位法实施安乐死。安乐死后立即摘除眼球，并快速收集眶后静脉丛血液。样本在室温下静置 30 分钟以促进凝固，随后在 3,000 × g 条件下离心 10 分钟。将血清部分小心转移至无酶的微量离心管中，并于 -80 °C 保存，直至后续分析。血清 MDA 水平使用市售的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，按照制造商提供的操作规程进行检测。简言之，将标准品和待测样本加入预先包被的微孔板中，与特异性一抗孵育，洗涤去除未结合物质后，再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗反应。随后加入四甲基联苯胺（TMB）底物，反应结束后用硫酸终止。使用酶标仪在 450 nm 波长处读取各孔的光密度（OD）值，并通过与已知浓度分析物绘制的标准曲线比对，确定 MDA 和 4-HNE 的浓度。
统计分析
所有数据均以均值 ± 标准误（SE）表示。鉴于样本量较小（第二天组 n = 5；第四天组 n = 4），采用了Bootstrap检验统计方法。具体而言，使用Bootstrap重采样法（1,000次有放回重采样）估计各组均值的95%置信区间（CI），并比较组间差异。对于每一项结果指标（如体重、视网膜厚度、MDA/4-HNE水平），均从原始数据集中进行Bootstrap抽样，并计算每次重采样样本的均值。95% CI由第2.5百分位数和第97.5百分位数确定th 和 97.5th 自举分布的百分位数。通过以下方法检验置信区间来间接评估显著性：若自举结果的置信区间不包含零，则通常表明差异具有显著性（假设为两组或多组均值之间的比较）。图表使用 Graphpad 软件（版本 5.01）生成。
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体重变化
实验前，各组小鼠的体重差异无统计学意义。实验后第二天，除对照组体重从 17.0 ± 0.5 g 增加至 17.4 ± 0.4 g 外，其余各组小鼠体重均显著下降。具体而言，MNU 组小鼠体重从 17.4 ± 0.3 g 降至 16.2 ± 0.2 g，MNU + Alda-1 组从 17.3 ± 0.3 g 降至 16.7 ± 0.4 g，MNU + Daidzin 组从 17.3 ± 0.3 g 降至 16.2 ± 0.3 g，MNU + Alda-1 + EX-527 组从 17.3 ± 0.4 g 降至 16.7 ± 0.2 g，MNU + Daidzin + SRT1720 组从 17.2 ± 0.4 g 降至 16.2 ± 0.4 g，MNU + Alda-1 + TUN 组从 17.5 ± 0.3 g 降至 16.1 ± 0.2 g，MNU + Daidzin + 4-PBA 组从 17.2 ± 0.2 g 降至 16.4 ± 0.3 g。注射 Alda-1 的各组（如 MNU + Alda-1 和 MNU + Alda-1 + EX-527）体重下降幅度相对较小，且与 M...
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既往研究表明，ALDH2激动剂可能对MNU诱导的视网膜变性具有保护作用14。然而，其抑制剂的干预效应以及潜在的下游通路（如SIRT1和ERS）尚未被深入探讨。已有研究提示SIRT1和ERS参与了多种视网膜变性模型，包括光诱导的视网膜变性以及视网膜变性基因修饰小鼠模型15,16。本研究的主要发现是，MNU可诱导视网膜变性，并显著升高醛类物质水平；ALDH2激动剂及其相应抑制剂可分别减轻或加重视网膜变性及醛类物质的积累。此外，SIRT1和ERS的调控在ALDH2的作用中发挥了中介性作用。
关于视网膜厚度的干预，结果表明MNU的主要影响位于外核层（ONL），而其他视网膜层，包括外丛状层（OPL）和内核层（INL），未显示出显著变化。该发现与MNU诱导的光感受器层选择性损伤一致，这种损伤与该层较高的代谢率相关，与既往研究结果相符17。外核层是光感受器细胞胞体所在的位置。当外核层受...
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作者声明，本研究、作者身份或本文发表不存在潜在的利益冲突。
本工作得到中国国家自然科学基金（编号：82301245）、福建省科技创新联合资金（编号：2024Y9653）、中国福建省自然科学基金（编号：2024J011148）以及福州总医院博士后科学基金（资助编号：48678）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4HNE试剂盒 | Elabscience，中国 | E-EL-0128 | 用于血清4HNE水平检测 |
| 4-苯基丁酸（4-PBA） | MCE，美国 | HY-A0281 | 内质网应激（ERS）抑制剂 |
| Alda-1 | MCE，美国 | HY-18936 | ALDH2激活剂，用于研究 |
| 大豆苷元（Daidzin） | MCE，美国 | HY-N0018 | ALDH2抑制剂，用于研究 |
| 荧光素钠 | 广州 | N/A | 用于 通过荧光素眼底血管造影系统获取图像。对血管造影图像进行分析，以检测是否存在渗漏、无灌注区域或视网膜血管形态的变化。 |
| ImageJ软件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | 版本1.53t | |
| MDA试剂盒 | 碧云天，中国 | S0131S | 用于血清MDA水平检测 |
| N-亚硝基-N-甲基脲（MNU） | MCE，美国 | HY-34758 | DNA烷基化试剂，用于诱导视网膜变性 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich，美国 | 30525-89-4 | 用于视网膜组织切片的固定 |
| 精密电子天平 | 电子秤，中国 | SF-400 | 量程：5000 g ´ 1 g/177ozX0.10z，用于记录每只小鼠的体重 |
| Prism | GraphPad | 版本5.01 | 统计分析软件 |
| 旋转式切片机 | LEICA，德国 | RM2016 | 用于制备视网膜切片 |
| Selisistat（EX-527） | MCE，美国 | HY-15452 | SIRT1抑制剂，用于研究 |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich，美国 | 1.93248 | 用于通过腹腔注射（IP）对动物进行麻醉，以开展后续研究 |
| SRT1720 | MCE，美国 | HY-10532 | SIRT1激活剂，用于研究 |
| 速眠新 | 吉林圣达动物药业有限公司 | N/A | 用于通过腹腔注射（IP）对动物进行麻醉，以开展后续研究 |
| 衣霉素（TUN） | MCE，美国 | HY-A0098 | 内质网应激（ERS）诱导剂 |
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