一例由额部脓肿引起的病例报告 Nocardia concava 在一名艾滋病患者中

摘要

本文介绍了一种针对免疫功能低下患者诺卡菌感染的检测方案，该方案结合了脓液培养与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）。这一联合方法可实现快速、准确的菌种鉴定，有助于实施靶向性抗微生物治疗，最终改善此类高危患者群体的临床预后。

摘要

诺卡氏菌属（Nocardia）为专性需氧放线菌。人类诺卡菌病通常发生于免疫功能低下者，最常见表现为原发性化脓性肺部感染。血行播散可导致肺外受累，其中中枢神经系统最常受累，其次为皮肤及皮下软组织；心包、淋巴结和关节受累较为罕见。一名50岁HIV阳性男性因口腔血疱及四肢淤斑持续1个月入院。住院期间出现右侧前额脓肿，其脓液经基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定为凹陷诺卡氏菌（Nocardia concava），并经16S rRNA基因测序证实。初始治疗包括抗逆转录病毒治疗、全身性糖皮质激素及静脉注射免疫球蛋白；在微生物学确诊后，加用利奈唑胺联合甲氧苄啶-磺胺甲噁唑进行靶向抗菌治疗，患者临床状况改善并最终出院。据我们所知，此为首例获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者感染凹陷诺卡氏菌（N. concava）导致前额脓肿的病例报告。由该病原体引起的人类感染仍极为罕见。此外，本例感染部位并非诺卡菌病常见的肺部或中枢神经系统，因而临床表现不典型，易造成漏诊或误诊。本病例中，准确的病原学鉴定实现了早期确诊并获得良好临床转归。该病例凸显了在严重免疫功能低下患者中提高对罕见诺卡氏菌感染警惕性的重要性。对于原因不明的皮肤及软组织脓肿，早期进行病原学检查至关重要，基于药物敏感性的靶向抗菌治疗可显著改善预后。

引言

Nocardia 属为需氧放线菌，广泛分布于自然环境中，常见于土壤和腐烂的有机物中。尽管在自然界中普遍存在，但它们通常不存在于人体内，属于机会性病原体。大多数感染通过吸入途径发生¹。诺卡菌病主要影响免疫功能低下者，尤其是细胞介导免疫受损的个体，如恶性肿瘤、糖尿病、HIV/AIDS、自身免疫性疾病患者、实体器官移植受者以及长期接受皮质类固醇治疗的患者²。然而，免疫功能正常者亦可发生感染³。Nocardia 主要通过呼吸道入侵，引起肺部疾病，并可继而通过血行播散导致肺外器官受累。脑部是最常见的播散部位，其次为皮肤和皮下软组织；较少情况下可累及心包、淋巴结和关节。临床上，Nocardia 可引起累及肺、皮肤和中枢神经系统的急性或慢性、局限性或播散性化脓性肉芽肿性炎症⁴。

迄今为止，由N. concava引起的人类感染病例鲜有报道。本文报道了首例HIV阳性患者因N. concava感染导致额部脓肿的病例，为诺卡菌病的诊断与治疗提供了有价值的参考。

病例报告：
一名50岁男性患者因口腔血疱及四肢紫癜性皮损持续一个月，入我院就诊。该患者在十多年前被诊断为HIV感染，但未持续坚持抗逆转录病毒治疗。约在入院前一个月，患者在无明确诱因的情况下出现口腔血肿及肢体紫癜，在当地医院开始接受抗逆转录病毒治疗，药物为Biktarvy（比克替拉韦/恩曲他滨/丙酚替诺福韦）。经进一步检查，怀疑为免疫性血小板减少症（ITP），遂给予甲泼尼龙冲击治疗及静脉注射免疫球蛋白（IVIG），同时进行胃黏膜保护和补钙治疗。

由于持续性血小板减少，该患者被转诊至我院进一步诊治。入院时，患者体温为37.9 °C；神志清楚，定向力完整，一般状况尚可。皮肤及巩膜无黄染。全身可见广泛分布的瘀点和瘀斑，右侧额部可触及一肿块。非增强胸部CT显示双肺下叶间质性改变，上叶存在旁间隔型肺气肿。腹部超声未发现明显异常。

次日进行的实验室检查显示，血小板计数为 12 × 10⁹/L（参考范围：83–303 × 10⁹/L），降钙素原水平为 0.11 ng/mL（<0.50 ng/mL），高敏C反应蛋白（CRP）为 1.11 mg/L（<6.00 mg/L）。辅助/诱导性T淋巴细胞（CD3+、CD4+）的绝对计数为 15 个细胞/µL（参考范围：550–1440 个细胞/µL）。定量聚合酶链式反应（PCR）检测发现，EB病毒（EBV）DNA 为 1.21 × 10⁴ IU/mL（参考范围：0–200 IU/mL），人巨细胞病毒（HCMV）DNA 为 4.53 × 10⁵ IU/mL（参考范围：0–200 IU/mL），两者均为阳性；其余常规血液检查未见明显异常。

鉴于已确诊的HCMV病毒血症，患者开始接受更昔洛韦和膦甲酸钠联合抗病毒治疗，同时继续使用Biktarvy控制HIV。大剂量甲基泼尼松龙和静脉注射免疫球蛋白（IVIG）用于治疗ITP并持续维持。由于持续存在低热，于住院第6天给予利妥昔单抗，第7天开始使用伏立康唑以预防口咽念珠菌病。

入院时，体格检查发现右侧额部区域有一肿块（图1）。住院第6天，从此病灶中抽取脓性物质进行微生物学评估。脓液直接革兰染色显示大量分枝的丝状革兰阳性杆菌（图2）。取部分标本接种于哥伦比亚血琼脂平板，置于35 °C、5–10% CO₂富集环境中培养。培养24小时后，观察到白色、隆起、干燥、皱褶状、颗粒样、非溶血性菌落。至培养第5天，菌落呈现淡黄色色素（图3）。对该分离菌进行改良抗酸染色，结果显示部分抗酸、部分非抗酸的微生物形态（图4）。

使用Autobio MS2000系统进行MALDI-TOF质谱分析，将该微生物鉴定为N. concava（图5). 该鉴定结果随后通过16S rRNA基因测序得到确认，测序结果亦将该分离株归类为N. concava。同时进行了抗菌药物敏感性试验，结果总结如下 表1根据CLSI M24指南解释的药敏试验结果 诺卡氏菌 spp. 表明对所有测试药剂均敏感。

住院第8天，根据实验室报告发现大量革兰氏阳性杆菌，停用伏立康唑，开始联合使用利奈唑胺和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑进行抗微生物治疗。患者体温逐渐恢复正常，临床状况改善。住院第18天，患者病情好转出院，处方口服利奈唑胺和甲泼尼龙，继续门诊治疗。

诊断、评估与治疗计划：
该患者患有艾滋病，且绝对CD4+ T辅助/诱导细胞计数较低，易发生机会性感染。可检测到的巨细胞病毒（CMV）和EB病毒（EBV）DNA提示可能存在活跃的巨细胞病毒和EB病毒复制。体格检查发现右前额脓肿及散在瘀点/紫癜。从前额脓肿抽吸的脓液中培养出菌落，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定为N. concava。

胸部CT显示双侧下叶间质性改变；需随访以排除诺卡菌病或与HIV/巨细胞病毒相关的间质性肺病。已对脓肿进行切开引流，血小板减少症得到处理，患者出院时口服利奈唑胺联合甲氧苄啶-磺胺甲噁唑治疗诺卡菌病。

出院后监测包括每周进行全血细胞计数及肝肾功能检查，以观察骨髓抑制和免疫重建炎症综合征；若出现发热、新发结节、出血或神经系统症状，需立即重新住院。

方案

本研究方案经浙江大学医学院附属第一医院医学伦理委员会批准。（参考编号：IIT20240874A）。

1. 患者评估与初步检查

1. 获取了全面的病史。
   1. 患者在就诊前1个月出现口腔血疱及四肢淤斑，无任何可识别的诱发因素。
   2. 随后患者在当地医院就诊，开始使用Biktarvy作为抗逆转录病毒治疗，并给予升血小板药物；然而，血液学指标未见改善。
2. 体格检查发现，患者处于低热状态。全身皮肤可见散在瘀点和瘀斑，右侧额部存在一个边界清楚的肿块。
3. 实验室检查
   1. 全血细胞计数（血小板计数）：采集全血（3 mL）至含乙二胺四乙酸（EDTA）的试管中，轻柔颠倒混匀8–10次，并在采血后4小时内完成分析。
   2. 血清C反应蛋白和降钙素原检测：采集血液（2–3 mL）至血清分离管中，静置凝固20–30分钟，以1,500–2,000 ×g离心10分钟，在采集当日进行分析。
   3. 淋巴细胞亚群流式细胞术计数（CD3/4/8/16/19/45/56）：采集全血（3 mL）至EDTA管中，轻柔颠倒混匀8–10次以确保充分抗凝，在采集后24小时内完成分析。
   4. Epstein–Barr病毒和巨细胞病毒DNA的定量聚合酶链式反应（PCR）检测：采集全血（3 mL）至EDTA管中，轻柔颠倒混匀8–10次，维持在2–8 °C，并在采集后4小时内送检。采血后2–4小时内通过离心分离血浆，暂存于4 °C待分析。

2. 诊断步骤

1. 超声引导下右前额脓肿穿刺抽吸：
   1. 在标准皮肤消毒和无菌铺巾后，使用2%利多卡因进行局部浸润麻醉。在实时超声引导下，将连接针头的20 mL注射器插入额部脓肿，抽取4 mL脓性液体。
   2. 患者在操作过程中血流动力学稳定，未诉任何不适。操作后即刻未观察到并发症。
2. 脓性抽吸物被立即送至微生物学实验室进行革兰染色，并在5–10% CO₂环境中进行后续培养。₂ 在35℃ °C.
   1. 革兰染色时，首先取一洁净载玻片制备细菌涂片，经火焰固定后，滴加结晶紫染液进行初染1分钟，随后用水冲洗。
   2. 接着，加入碘液作为媒染剂，作用1分钟，然后用水冲洗。随后用95%乙醇脱色约20–30秒，直至流出液无色，立即用水冲洗以终止脱色。
   3. 最后，用番红溶液复染30秒至1分钟，用水冲洗，吸干，然后在显微镜下观察。
3. 从血琼脂平板上挑取一环菌落，进行改良抗酸染色。
   1. 对于改良抗酸染色，首先取一洁净载玻片制备细菌涂片，经火焰固定后，滴加石炭酸复红染液覆盖涂片，加热至出现蒸汽但不沸腾，持续3–5分钟，随后用水冲洗。
   2. 然后，用1%硫酸水溶液进行弱脱色，时间30秒至1分钟，直至涂片呈淡粉色，再用水冲洗。
   3. 最后，用亚甲蓝溶液复染30秒至1分钟，用水冲洗，吸干，然后在显微镜下观察。
4. 采用自动化质谱微生物鉴定系统进行鉴定，该分离株被鉴定为 N. concava.
   1. 样品制备
      1. 靶板制备：用竹签挑取单个纯菌落，并均匀涂布于MALDI靶板的靶点位置。
      2. 甲酸添加：涂片空气干燥后，加入1 µ加入1 L甲酸至每个目标位点以裂解细胞。
      3. 基质添加：待点样完全风干后，加入1 µL基质溶液（α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）立即覆盖于其上，随后将平板再次静置风干。
   2. 开启电源并设置软件。
      1. 打开仪器电源、真空泵和计算机，等待真空度达到工作状态。启动工作站软件并登录。
      2. 确认软件与仪器之间的通信正常，并验证真空、温度和激光状态均正常。
   3. 在软件中输入信息。
      1. 进入目标板管理模块。选择目标板类型，创建新批次，并输入样本信息，包括样本编号、类型、来源和备注。
      2. 保存目标板信息，并选择相应的鉴定数据库进行比对。
   4. 操作仪器并采集数据。
      1. 将干燥的靶板放入仪器腔室，并关闭腔室门。选择 运行目标板 在软件中确认目标板编号及位置。
         注意：该软件可自动完成激光激发、离子飞行、信号采集和谱图生成。可实时监测采集进程和谱图质量。
   5. 数据分析与鉴定
      1. 光谱处理：该软件对原始光谱自动进行平滑、基线校正和峰提取。
      2. 数据库比对：将处理后的特征峰谱图与仪器内置的已知细菌标准谱图数据库进行比对。
      3. 结果解读：软件根据比对相似性提供鉴定结果及评分。通常，评分≥9.0表示可可靠鉴定至种水平；评分在6.0至8.9之间表示可鉴定至属水平；评分低于6.0则视为不可靠。
      4. 报告与数据管理：原始质谱图、鉴定结果和日志将自动保存。数据可导出、进行统计分析，并与实验室信息系统（LIS）对接。
   6. 关闭程序
      1. 完成所有操作后，退出操作界面。在软件中进入待机模式，待仪器安全卸压后，关闭软件和计算机，最后关闭仪器和真空泵的电源。
5. 抗菌药物敏感性试验
   1. 挑取菌落，用无菌水中的研磨棒或玻璃珠研磨，制成均匀悬液，调整至0.5麦氏浊度标准；由于 诺卡菌 tends to form clumps，因此需要充分研磨以确保均匀悬浮。
   2. 然后将细菌悬液加入含有阳离子调节的穆勒-亨顿肉汤（CAMHB）的微量稀释板的每个孔中，接种量为10 µ每孔加入 L，使最终接种量约为 1 × 10⁵–5 × 10⁵ CFU/mL，同时设置不含抗生素的生长对照孔和阴性对照孔。
   3. 在35℃下孵育微孔板 ±± 2°在常温空气中培养3–5天，培养期间保持培养皿盖密封，以防干燥。
   4. 孵育后，用肉眼观察每个孔中的细菌生长情况，并记录完全抑制细菌生长的最低药物浓度作为最小抑菌浓度（MIC）。

3. 抗生素治疗

1. 入院后立即启动联合抗病毒与免疫抑制治疗：在继续使用Biktarvy抑制HIV的同时，联合给予更昔洛韦与膦甲酸钠，并同步开始甲泼尼龙冲击治疗及静脉注射免疫球蛋白。
2. 第6天：因反复出现低热，治疗方案中加用利妥昔单抗。
3. 第7天：为预防可能的侵袭性真菌感染，经验性启用伏立康唑。
4. 第8天：显微镜检查发现大量革兰氏阳性杆菌；随即停用伏立康唑，迅速将抗微生物治疗方案调整为利奈唑胺联合复方磺胺甲噁唑。此后患者体温恢复正常，临床状况逐步改善，于住院第18天病情稳定后出院。

结果

一名50岁的HIV阳性男性患者出现全身性瘀点和瘀斑，并伴有口腔疱疹。入院后，患者接受了经验性抗病毒和促血小板治疗。体格检查发现其右侧前额存在一个肿块。随后在超声引导下进行穿刺抽吸（图1），以获取脓液进行实验室检查。革兰染色结果见图2，抗酸染色结果见图4。

在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定后（图5），科马嘉血琼脂平板上的菌落形态进一步确认了N. concava感染（图3）。针对16S rRNA测序，该菌株被送至商业实验室（RuiBio BioTech）进行分析。通过在NCBI网站上使用BLAST比对，该菌株的16S rRNA序列与NR_040996.1的同源性≥99%。测序结果将其鉴定为Nocardia concava。...

讨论

诺卡氏菌 是一种需氧的革兰氏阳性菌，属于某一门 放线菌门，类别 放线菌门，亚类 放线菌亚纲，顺序 放线菌目，亚目 棒状杆菌亚纲， 家族 诺卡氏菌科和属 诺卡氏菌¹⁵已鉴定出100多个物种，其中对人类和动物最常见的病原体为 N. asteroides, N. brasiliensis，N. farcinica，以及 N. cyriacigeorgica¹⁶首例诺卡菌病病例由 Eppinger 于 1890 年报道¹⁷，包括肺炎和脑脓肿；中国首例病例报道于1980年。近年来，诺卡菌病病例已不再罕见，尤其在长期接受化疗或使用高剂量免疫抑制剂的免疫功能低下患者中，其发病率有所上升¹⁸. 本病例中的致病因子 N. concava，由 Kageya...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5–10% CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific	20172416507
抗酸染色	Baso	20170094
Autof MS 系列	Autobio Diagnostics	https://en.autobio.com.cn/Product/productDetail/fid/63/cid/2/id/145.html
Autof MS2000	Autobio Diagnostics	20182400196
甲酸	Autobio Diagnostics	20140009
革兰染色	BioMérieux	20171067
α-氰基-4-羟基肉桂酸	Autobio Diagnostics	20140009