方法文章

集成UHPLC-MS/MS与HRMS策略用于筛选薯蓣Dioscorea bulbifera L.中潜在肝毒性的呋喃类化合物

DOI：

10.3791/70865

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2026年5月19日

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1The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medicine and Health Management, Guizhou Medical University, 4Guizhou Provincial Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM, Guizhou Medical University

本文内容

摘要

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本研究建立了一种整合策略，结合超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC–MS/MS）和高分辨质谱法（HRMS），用于筛查薯蓣Dioscorea bulbifera L.中可能具有肝毒性的含呋喃化合物。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dioscorea bulbifera L.（DBL）是一种用于治疗甲状腺疾病和肿瘤的传统草药，但由于其潜在的肝毒性作用，已引发广泛的安全性关注。先前的研究表明，这种肝损伤可能与DBL中存在的含呋喃化合物（FCCs）的代谢活化有关。本研究采用超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）和超高效液相色谱串联高分辨质谱（UHPLC-HRMS）相结合的综合分析方法，系统地表征了DBL提取物中的FCCs及其活性代谢产物。通过靶向与非靶向质谱分析，我们在DBL水提物中共鉴定出849种成分，其中包括10种呋喃二萜类化合物和17种其他FCCs。为阐明其代谢活化途径，我们在小鼠肝微粒体（MLM）孵育体系中使用谷胱甘肽（GSH）和4-溴苄胺（BBA）作为双捕获试剂。通过细胞色素P450介导的代谢，成功捕获并表征了来自薯蓣素B（DSB）、C（DSC）、D（DSD）、E（DSE）、L（DSL）、N（DSN）以及2-戊基呋喃的7种相应的加合物。本研究建立了一种灵敏且特异的方法，可用于全面分析DBL中潜在肝毒性的呋喃类化合物，并为含呋喃中药中活性代谢物的形成及其毒性机制提供了重要见解。

引言

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与传统中药（TCM）相关的安全性问题，尤其是药物性肝损伤（DILI），阻碍了其在临床中的广泛应用和现代化进程1,2,3。越来越多的证据表明，大多数中药成分本身并不具有内在毒性；相反，其肝毒性源于在体内的代谢活化in vivo1,4,5。含呋喃环的化合物（FCCs）被广泛认为是重要的肝毒性前体，可通过P450介导的代谢活化生成高反应性的亲电中间体，特别是cis-烯二醛，这些中间体在启动肝毒性过程中起关键作用。这些亲电性代谢产物可与关键蛋白中的半胱氨酸巯基和氨基形成共价加合物，从而促进毒性效应的发展6,7,8。

在中医中，Dioscorea bulbifera L.（DBL）被广泛用于治疗甲状腺疾病、肿瘤及皮肤病9,10。目前已从DBL中分离并鉴定了共计152种化学成分，其中包括41种呋喃二萜类化合物11。其中，二苯并丁内酯B（diosbulbin B, DSB）是一种主要的生物活性成分，已被证实可在小鼠模型中诱导肝损伤，该毒性作用与DSB代谢生成的cis-烯二醛（DDE）密切相关12,13。随着分析仪器技术的进步，质谱法已成为分析中药复杂化学成分及其代谢物的重要工具14,15。传统上，DSB代谢产生的cis-烯二醛通常通过使用N-乙酰-L-赖氨酸联合谷胱甘肽（GSH）或N-乙酰-L-半胱氨酸进行亲电性物质捕获，随后对生成的化学稳定的吡咯衍生物进行LC-MS/MS分析来检测16,17。在此基础上，我们先前开发了一种改进策略，即同时采用GSH和苯并[b]吖啶（BBA）捕获呋喃类代谢中间体，并结合LC-MS/MS分析：针对GSH加合物采用129 Da的中性丢失扫描和m/z 272的前体离子扫描，同时针对BBA片段产生的吡咯类物质采用m/z 169与171的1:1前体离子扫描（图1）18,19。尽管该方法对已知结构的呋喃类化合物有效，但在应用于缺乏先验结构信息的复杂混合物时仍存在明显局限性。因此，亟需建立一种全面的分析策略，既能实现对中药复杂基质的系统化学表征，又能高效筛选潜在的肝毒性前体物质。

本文报道了一种用于系统表征丹参注射液（DBL）中潜在肝毒性成分（FCCs）的整合策略（图2）。该策略包括三个关键步骤：（i）基于超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC–MS/MS）的广泛靶向代谢组学（WTM）对DBL水提物进行全面的化学成分分析；（ii）利用谷胱甘肽（GSH）和苯基硼酸（BBA）捕获由FCCs生成的活性中间体；（iii）通过高效液相色谱-串联质谱法（HPLC–MS/MS）和UHPLC–MS/MS检测并解析由潜在毒性成分经代谢活化后形成的GSH/BBA加合物的结构。该整合方法可从复杂的中药体系中明确鉴定出导致DBL肝毒性的关键毒性前体，并为中药安全性评价提供一种高灵敏度和高特异性的分析框架。

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方案

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注意：本研究中使用的试剂和设备列在材料表中。

1. DBL 测试溶液的制备

  1. 采集并鉴定三批珠芽蓼（Dioscorea bulbifera L.）块茎。按照中药炮制国家标准，去除块茎上的须根，洗净泥沙，在新鲜状态下切成约1 cm厚的圆片，于60 °C鼓风干燥箱中干燥，取出后冷却至室温20。
  2. 分别称取每批200 g珠芽蓼（DBL），使用高速粉碎机研磨成粗粉（粒径250–850 µm）。
  3. 取20 g粗粉加入200 mL去离子水（1:10, w/v）浸泡30分钟。同时，将步骤1.2中制备的三批粗粉按质量比1:1:1混合均匀。
  4. 将浸泡后的物料加热回流提取60分钟，用纱布或筛网过滤以除去不溶性残渣。向残渣中再加入200 mL去离子水，重复回流提取2次，每次60分钟。合并三次滤液，通过加热浓缩至最终体积为100 mL。
  5. 将浓缩提取液转移至真空冷冻干燥机中，冷冻干燥得到粉末。
  6. 精确称取每批提取物粉末18 mg，分别溶于1.5 mL 50%乙腈溶液中，涡旋振荡30秒以确保均匀。
  7. 在4°C条件下，以13,800 × g 离心10分钟，收集上清液作为MLM孵育储备液。
  8. 移取20 µL储备液，用50%乙腈稀释至1:50，涡旋振荡30秒，然后经0.22 µm微孔滤膜过滤，得到用于质谱分析的样品溶液。

2. DBL 的化学表征

  1. 色谱条件
    1. 使用C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 µm），并将柱温箱温度设置为40 °C。将流动相A配制为含0.1%（v/v）甲酸的水溶液，流动相B为乙腈。
    2. 梯度洗脱程序设置如下：0–10 min，2%–50% B；10–11 min，50%–95% B；11–13 min，95% B。流速设为0.4 mL/min，进样量为2 µL。
  2. 采用以下参数进行质谱分析：离子源：IonDrive Turbo V电喷雾离子化（ESI）；采集模式：多反应监测（MRM），同时在正离子和负离子模式下采集；离子喷雾电压：+5.5 kV（正离子）/ −4.5 kV（负离子）；气帘气：35 psi；源温度：400 °C；离子源气体1：60 psi；离子源气体2：60 psi；去簇电位（DP）：±100 V。
  3. 数据处理
    1. 使用SCIEX Analyst软件（v1.6.3）采集和处理MRM数据。使用MSConvert将原始数据文件（.wiff）转换为TXT格式。通过查询 proprietary BiotreeDB（V2.1）质谱数据库对检测到的化合物进行注释。注释依据为保留时间（RT）、质荷比（m/z）和碎片离子模式与标准品的匹配结果。

3. MLM 孵育中生成的 GSH/BBA 代谢物的表征

  1. MLM 培养
    1. 将小鼠肝脏微粒体悬液置于冰上缓慢解冻。在冰上，于2 mL 微量离心管中依次加入下述组分，配制孵育混合液。最后加入NADPH再生系统。对于对照组，以等体积的预冷PBS替代NADPH再生系统。短暂涡旋混匀。
      1. 配制以下成分的孵育混合物：小鼠肝微粒体悬液（MLM，4 mg/mL 蛋白质）：125 µL；氯化镁（MgCl₂）溶液（32 mM）：10 µL；DBE（12 mg/mL）或 DSB 标准溶液（35 mM）：10 µL；谷胱甘肽（GSH）溶液（50 mM）：100 µL；BBA 溶液（250 mM）：10 µL；PBS 缓冲液（pH 7.4，含 1.0 mol/L EDTA 和 0.1 mol/L K2HPO4)：145 µL；NADPH再生系统溶液（5.0 mM）：100 µL。
    2. 孵育结束后立即将所有试管从培养箱中取出。向每支试管中加入1 mL预冷的乙腈（-20 °C），以终止酶促反应。
    3. 涡旋3分钟以沉淀蛋白质。在13,800 x g 4 °C 下 10 分钟。
    4. 收集上清液，经0.22 µm滤膜过滤，将滤液转移至自动进样瓶中。
  2. DBL提取物经MLM孵育的HPLC-MS/MS初步筛选
    1. 色谱条件
      1. 使用C18色谱柱（150 mm × 4.6 mm，3 µm），柱温设置为25 °C。流动相A为含0.1%（v/v）甲酸的水溶液，流动相B为乙腈。
      2. 运行以下梯度：0–2 分钟，10% B；2–15 分钟，B 相从 10% 线性增加至 90%。设置流速为 0.8 mL/min，进样量为 5 µ制备样品的升数。
    2. 质谱条件。设置全扫描范围为 m/z 500–1000。在正离子模式下进行 m/z 169 和 171 的前体离子（PI）扫描，以及 129 Da 的中性丢失（NL）扫描；在负离子模式下进行 m/z 272 的前体离子（PI）扫描。关键参数设置如下：离子喷雾电压（IS），+5,500 V（正离子模式）/ −4,500 V（负离子模式）；去簇电位（DP），±70 V；入口电位（EP），±10 V；碰撞能量（CE），+35 V（正离子模式）/ −40 V（负离子模式）；碰撞池出口电位（CXP），±10 V；气源1和气源2（GS1/GS2），各50 psi；帘气（CUR），40 psi；源温度（TEM），650 °C。
    3. 使用 SCIEX Analyst 软件（v1.6.3）采集和处理所有质谱数据。
  3. 通过超高效液相色谱-高分辨质谱法鉴定吡咯衍生物和 FCCs
    1. 色谱条件
      1. 使用C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.9 µm），并将柱温箱温度设定为30 °C。流动相A配制为含0.1%（v/v）甲酸的水溶液，流动相B为乙腈。
      2. 程序设置如下：0–20 分钟，5%–95% B；20–21 分钟，95% B。流速设为 0.3 mL/min，进样量为 2 µL。
    2. 使用以下参数进行质谱分析: 离子源：电喷雾离子源（ESI）；离子喷雾电压：+3.5 kV（正离子模式）/-2.5 kV（负离子模式）；毛细管温度：320 °C；探针加热器温度：350 °C；鞘气流速：10 arb；最大喷雾电流：100 µA；S透镜射频水平：50%；碰撞能量：35 V（正离子）和40 V（负离子）；扫描范围：100–1000 m/z。
    3. 数据预处理
      1. 基于DBL中鉴定出的FCCs及捕获机制（图1)，使用 ChemBioDraw Ultra 14.0 绘制预测的 GSH/BBA 结合物补充材料 图1).
      2. 将采集的HRMS原始文件（.raw）导入Xcalibur（V4.1）的Qual Browser模块。在软件中创建鉴定工作流程，用于筛查GSH/BBA-结合物。
      3. 比较实验质谱1 和 MS2 基于已知的加合机制，将光谱与源自FCCs的GSH/BBA结合物的预测结构（使用ChemBioDraw Ultra 14.0预测）进行比对图1 和 补充 图1). 采用最低峰值强度阈值为 1 x 105 且所有监测离子的质量精度容差为 ± 10 ppm。根据在质谱中观察到的特征性溴同位素模式（约1:1）确认偶联产物1 和 MS2 质谱图，包括 m/z 169 和 171 处的诊断离子。
      4. 通过从观测到的分子离子质量中减去GSH/BBA标签的质量，确定母体FCCs的分子量。 使用472/474 Da（C17H21O5N4BrS）用于减法运算。
      5. 基于上述获得的结果，采用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UHPLC–HRMS）对DBL中的亲本FCCs进行表征。

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结果

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DBL 中鉴定出的 FCC
为表征 DBL 的化学成分，采用基于三重四极杆的 WTM 与 HRMS 分析相结合的方法。这种双重策略可对提取的离子对进行综合分析，生成信息丰富的提取离子色谱图（EIC，图 3A）和总离子色谱图（TIC，图 3B）。在优化的色谱和检测条件下，共鉴定出 849 种化合物，涵盖 20 个化学类别（图 3C）。值得注意的是，从 DBL 提取物中检测到 27 种呋喃类化合物，其中包括 10 种呋喃型二萜类化合物：黄芫花素 B（DSB）、C（DSC）、D（DSD）、E（DSE）、G（DSG）、J（DSJ）、L（DSL）、N（DSN）、8-表黄芫花素 E 乙酸酯（EEA）和巴佛洛黄芫花素 B（图 4、表 1 和表 2）。

DBL提取物在微粒...

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讨论

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既往关于DBL肝毒性的研究主要采用靶向捕获策略，关注单个呋喃类化合物（FCC）的代谢中间产物9,22。尽管这些方法可提供有价值的机制性见解，但在复杂的中药基质中，其有效性常受限于低丰度生物活化中间体的检测困难。在本研究中，我们建立了一种升级的分析流程，用于系统性鉴定DBL中具有肝毒性的FCC。该策略的主要优势在于整合了全细胞代谢物组学（WTM）、反应性中间体捕获技术与高分辨质谱（HRMS），从而实现对复杂提取物中生物活化呋喃类物质的高灵敏度检测。具体而言，采用在多反应监测（MRM）模式下运行的UHPLC–MS/MS平台，共表征了DBL提取物中的843种化合物，其中鉴定出21种FCC，包括4种呋喃二萜类化合物（表1）。进一步的UHPLC–HRMS分析又鉴定了6种额外的呋喃二萜类化合物（表2），并解析了7种反应性谷胱甘肽（GSH）/溴化苯胺（BBA）加合物的结构（图6，表3

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作得到国家自然科学基金（编号：82360759）、贵州省自然科学基金（编号：ZK [2024]406、ZK [2024]397、博士后站 [2021]007、BSH [2024]005）以及贵州中医药大学TD希望项目[2023]005的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-溴苄胺Jiuding Chemical (Shanghai) Technology Co., LtdX114214A
乙腈Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司1000294000
离心无锡百泰克生物科技有限公司CR3180
色谱的 样本 瓶子浙江艾鲁斯生物科技有限公司C0000008
二苯并呋喃B成都普菲德生物技术有限公司18022603
Dioscorea bulbifera L.-DBL-1；DBL-2；DBL-3植物材料由贵州中医药大学蒋威克教授（中国贵州贵阳）鉴定，并将凭证标本保存于贵州省基础药理学重点实验室。
电子天平上海安亭电子仪器厂FA1004B
甲酸赛默飞世尔科技 有限公司195715
谷胱甘肽Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司SLBX5462
高速  破碎机永康标硬件产品有限公司XC-2000Y
中国昆明小鼠肝脏微粒体（雄性）大连美仑生物技术有限公司MB12496-1
氯化镁北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司M8161
甲醇Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司646377
密理博滤膜天津金腾实验设备有限公司尼龙66
NADPH Na4北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司102X022
烘箱天津实验仪器 &安普设备有限公司GFL125
磷酸盐缓冲液碧云天生物技术  有限公司C0221B
恒温的 水 浴液 振荡器上海紫佳仪器有限公司THZ-82A
超低温冰箱赛默飞世尔科技 有限公司TDE60086FV-ULTS
超声波清洗机上海紫佳仪器有限公司L10-250A
涡旋混合器江苏海门医疗器械厂VM-D

参考文献

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