一种用于研究生活方式加速衰老病理生理学的昼夜节律紊乱与饮食应激联合小鼠模型

摘要

本文介绍了一种建立昼夜节律紊乱合并高脂高糖（HFHS）饮食小鼠模型的实验方案，该模型可模拟不健康的生活方式，诱导代谢紊乱和衰老表型。

摘要

本实验方案的目标是建立一种标准化的小鼠模型，以重现现代不健康生活方式所引起的多因素损伤。为此，我们开发了一种新的C57BL/6J模型，该模型结合了随机化的昼夜节律紊乱和高脂高糖（HFHS）饮食，并设置单独的HFHS饮食组和昼夜节律紊乱组作为对照。与对照组相比，复合模型表现出更严重的代谢紊乱，包括体重增加、空腹血糖和血脂水平升高以及显著的肝脂肪变性，同时还出现明显认知和运动功能障碍。复合模型还表现出更显著的加速衰老现象，经衰弱指数和苏木精-伊红（HE）染色证实。该整合模型能够可靠地模拟与生活方式相关的代谢-认知功能衰退及早衰状态。这一可重复的逐步实验方案有助于开展针对生活方式介导的衰老机制研究以及靶向治疗策略的评估。

引言

现代生活节奏的加快使人群越来越多地暴露于扰乱节律的行为和促进肥胖的饮食中，大量证据表明这些因素与全身功能衰退及慢性疾病的发生密切相关¹。流行病学数据显示出显著的共病现象：轮班工作者代谢综合征标志物的检出率较高，而长期摄入高脂高糖饮食则与痴呆风险显著升高密切相关^2,3。这些有害因素共同作用，导致多器官病理改变——代谢功能障碍常伴随认知功能加速衰退以及心血管结构重塑，体现出外周与中枢系统退化之间的双向交互作用。尽管临床上已认识到这些因素的协同效应，但能够全面模拟生活方式所致多器官功能衰退的标准化临床前模型仍尚不完善。

在分子水平上，长期的昼夜节律失调会启动一种病理级联反应，起源于视交叉上核，破坏向室旁下丘脑的谷氨酸能信号传递，并减弱促肾上腺皮质激素释放激素的脉冲性分泌。这会损害下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的负反馈调节⁴，导致糖皮质激素受体脱敏以及皮质醇水平持续升高。随之而来的肝脏糖异生激活和骨骼肌胰岛素受体底物-1磷酸化抑制共同促使外周胰岛素抵抗的发生，为高血糖和脂质代谢紊乱建立起代谢基础^5,6。与此同时，膳食中的饱和脂肪酸通过下调内皮紧密连接蛋白的表达，穿透受损的血脑屏障^7,8，激活小胶质细胞中的TLR4/NF-κB信号通路，进而引发由TNF-α和IL-1β介导的神经炎症反应⁹。关键在于，这两种不健康的生活方式因素并非独立作用，而是具有协同效应。然而，目前文献中仍严重缺乏对二者联合暴露的系统性研究。因此，开展将昼夜节律紊乱与高脂高糖饮食作为复合因素整合在一起的建模研究具有重要意义。

尽管现有小鼠模型在研究孤立的衰老机制方面具有实用价值，但它们未能重现由生活方式引起的衰退所具有的整合性病理生理特征。自然衰老表现出显著的个体间差异，且所需时间较长，与实验效率不相容。诸如多柔比星等药物主要诱导DNA损伤和急性细胞衰老，但无法模拟慢性代谢紊乱¹⁰。基因修饰模型仅靶向单一分子通路，忽略了系统性的神经内分泌-代谢交互作用^11,12。D-半乳糖给药虽可诱导氧化应激，却不足以模拟昼夜节律紊乱对糖皮质激素节律性的影响，或饮食脂肪介导的神经炎症¹³。关键的是，单一因素干预无法捕捉临床上观察到的多器官协同衰退模式。这一转化医学鸿沟迫切需要一种先进的复合模型平台，能够同时整合慢性昼夜节律紊乱和致肥胖饮食应激，以真实加速神经退行性变、心脏功能障碍和代谢损伤之间的相互依赖性进展。

为解决这一问题，我们建立了一种整合了随机性昼夜节律紊乱与高脂高糖饮食的C57BL/6J小鼠模型，以模拟现代生活方式中多种因素协同作用带来的损伤。将小鼠置于轮替的光照周期并同时给予持续的致肥胖饮食，导致代谢紊乱显著加剧，表现为体脂含量升高、空腹高血糖以及血脂异常。认知功能评估显示空间记忆和识别记忆出现明显缺陷，而运动行为测试则表明其耐力下降。尤为关键的是，对衰弱指数的纵向定量分析表明，与年龄相关的功能缺陷加速累积。因此，这一双重挑战范式能够稳健地再现多方面的加速衰老表型，为研究由生活方式驱动的病理生理机制提供了一个经过验证的全新平台。

方案

所有实验程序均经河北以岭医药研究院动物研究伦理委员会批准（批准号：N2024043）。32只8月龄雄性C57BL/6J小鼠（见材料表）饲养于河北以岭医药研究院新药评价中心所属的屏障环境动物实验设施中。饲养环境保持标准化条件：室温维持在20–26 °C，相对湿度控制在40%–70%，采用12小时光照/12小时黑暗循环。小鼠可自由摄取标准实验室啮齿类动物饲料和灭菌饮用水。

1. 建立昼夜节律紊乱与饮食应激联合的小鼠模型（图1）

注意：在实验过程中意外死亡、出现严重体重减轻或未能完成建模过程的动物将被排除在最终分析之外。每组初始动物数量为8只，最终有效样本量为每组5只。

1. 实验前准备高脂高糖（HFHS）饮食（参见材料表），并准备一个独立房间，配备可编程定时器，用于灵活控制光暗周期。
   注意：将饮食储存在 4 °C 或 -20 °C 以防止氧化；使用前恢复至室温，避免冷凝影响其成分。
2. 动物适应与随机分组
   1. 所有8月龄小鼠在实验开始前，在标准条件下饲养，进行为期7天的适应性喂养。
   2. 适应期结束后，根据体重将小鼠随机分为四组（每组 n = 8）：对照组、复合应激模型（Model）组、HFHS组和昼夜节律紊乱（CR）应激组。
3. 对复合应激模型组小鼠进行为期8个月的HFHS饮食联合昼夜节律紊乱干预。HFHS组仅给予HFHS饮食，持续相同时间。
4. CR组仅接受昼夜节律紊乱干预。对照组在整个实验期间饲喂标准维持饮食。所有动物均可自由饮水。
   注意：8个月的干预过程可暂时中断（例如进行小鼠常规健康检查），不会影响实验结果，检查完成后可继续干预。
5. 昼夜节律紊乱干预方案（图2A、B）
   1. 使用可编程定时器（参见材料表）灵活控制每周光暗周期。采用四种不同的光照模式：快速光暗切换（每天连续2小时，每7分钟交替一次光照与黑暗）、反转光暗周期（每天8:00关灯，20:00开灯）、持续光照（24小时照明）和持续黑暗（24小时无光）。
   2. 每周开始时，使用统计软件（R语言，设定固定随机种子）生成随机序列。将四种光照模式随机分配至每周的每一天，确保每种模式连续应用1–2天。
6. HFHS饮食自由供应，每周监测食物摄入量。HFHS饮食的详细成分见表1。
   注意：需定期检查食物供应，防止喂养不足或断食。
7. 在8个月干预期间，每周固定时间点（周四上午9:00）使用电子天平称量小鼠体重，并详细记录所有体重数据。
   注意：称重过程应迅速完成（每次不超过30秒），以尽量减少对小鼠的应激及对昼夜节律的干扰。

2. 新物体识别

1. 在训练前一天，将小鼠放入一个 60 cm × 60 cm × 40 cm 的测试箱中，让其自由探索 5 分钟，以适应测试环境。
   注意：每次试验后清除箱内的粪便和尿液。用 75% 乙醇擦拭箱子，以消除残留气味。
2. 将两个相同的圆柱体（A 和 B）分别放置在测试箱的左下角和右下角。将每只小鼠背对物体放入箱中，允许其自由探索 5 分钟。
   1. 在不同小鼠之间随机交换两个圆柱体的左右位置，以避免位置偏差。
   2. 5 分钟探索训练结束后，暂停实验，暂停时间最长可达 23 小时，并确保在训练后 24 小时内完成后续的新物体替换步骤（步骤 2.3），以保证识别测试的有效性。
3. 训练 24 小时后，将左下角的物体 A 替换为一个新的立方体（物体 C）。启动上方摄像机，将小鼠放入箱中，记录其 5 分钟的行为。
   注意：新物体的大小应与熟悉物体相似，但在材质、颜色或纹理上具有明显差异，以确保小鼠能够识别其新颖性。
4. 使用视频追踪系统分析录像（参见 材料表）。
   1. 将探索行为定义为小鼠鼻尖朝向物体或距离物体 2 cm 以内。记录探索熟悉物体（TB）和新物体（TC）的时间。
   2. 根据以下公式计算识别指数：识别指数 = TC / (TB + TC) × 100%。
      注意：分析人员应盲法处理实验分组信息，以避免主观偏差；系统性地排除攀爬或啃咬等非探索行为，不计入探索时间记录。

3. 抓力测试

1. 使用握力计¹⁴（见材料表）测量小鼠的前肢握力。每次测试前，将测力计垂直旋转90度，并牢固固定在金属支架上，以确保系统完全固定。
2. 轻轻抓住小鼠尾根部，使其前爪自然抓住横杆。待读数稳定后将测力计归零，然后以恒定且缓慢的速度水平向后拉动尾巴，直至小鼠松开抓握。
3. 记录松开瞬间的最大峰值力（kgf）作为握力值。每只小鼠每天进行三次连续测试。后续分析采用三次测量的平均值。
   注意：保持拉拽速度均匀且足够缓慢，以便小鼠能够产生充分的抗拉阻力。
4. 若出现以下任一情况，则该次测试数据不得纳入分析：小鼠仅使用一只前爪、后肢接触横杆或参与抓握、拉拽过程中身体扭转，或横杆在无主动抵抗的情况下被松开。
   注意：对模糊或异常的数据标记以供复查。必要时重复测量。

4. 衰弱指数（FI）

注意：测试前需将所有设备参数校准至标准化设置。每只小鼠的总评估时间应控制在30分钟以内，以避免疲劳引起的表型变化。所有测试应在固定的上午时间段内（9:00–12:00）进行，以尽量减少昼夜节律的影响。

1. 在测试前使小鼠禁食12小时，但可自由饮水，以尽量减少食物摄入对生理测量的急性影响。
2. 在评估前30分钟将小鼠转移至测试环境，使其适应环境并减少与应激相关的干扰。
3. 排除患有严重病理状况（如肿瘤、感染或肢体畸形）的小鼠，以防止对衰弱评估产生混杂影响。
4. 根据涵盖五个领域的31项表型缺陷指标评估衰弱指数：运动功能、营养状态、感觉功能、自发活动与行为以及生理缺陷^15,16。
   注意：具体的31项评估项目包括以下五个领域：运动功能（7项，如握力下降、步态异常和攀爬能力降低）、营养状态（6项，如体重减轻、体况评分下降和摄食量减少）、感觉功能（5项，如视力障碍、听力障碍和触觉迟钝）、自发活动与行为（7项，如自发活动减少、理毛行为减少和探索行为减少）以及生理缺陷（6项，如眼部缺陷、耳部缺陷和皮肤缺陷）。所有项目均采用二元评分法（0 = 无缺陷，1 = 有缺陷），最终衰弱指数 = 缺陷项目总数 / 31。
5. 指派两名对实验分组不知情的研究人员独立完成所有评估。
6. 根据预定义的标准，对握力、步速、体重变化、毛发状况、感觉反应、自发活动能力及身体异常等每项指标评分，记为0（无缺陷）或1（有缺陷）。

5. 空腹血糖检测

注意：禁食小鼠 12 小时，期间可自由饮水，以尽量减少进食对血糖的急性影响。在上午 9:00 至中午 12:00 之间进行测量，以降低昼夜节律波动的影响。实验前使用标准葡萄糖溶液校准血糖仪，以确保不同批次间的一致性。

1. 轻轻固定小鼠，用75%乙醇消毒尾尖。使用无菌一次性采血针在尾静脉处做1–2 mm的切口。弃去第一滴血液，以避免组织液污染。
2. 采集少量毛细血管血液，立即使用便携式血糖仪（参见材料表）及配套试纸条进行分析。每个样本需重复检测两次，以确保数据准确性。

6. 血脂检测包括总胆固醇（TC）

注意：严重溶血或浑浊的样本应排除在分析之外。若三个重复样本间的变异系数 > 10%，需重复测量。

1. 将采集的血液置于非抗凝试管中，在室温下静置2小时，使其自然凝固。随后以1000 ×g离心样品 × g 4℃下离心15分钟 °C 以分离血清。
   注意：操作前确保离心机已正确配平，并牢固关闭安全内盖。
2. 小心吸取上层血清，分装后立即于 -80 保存 °C 以防止脂质氧化。
   注意：血清分装后于 -80 ℃ 保存 °C，实验可暂停数天至数周；待试剂盒和设备准备就绪后，再进行后续的总胆固醇检测（步骤6.3），注意避免血清反复冻融。
3. 使用商用 Greiss's TC 检测试剂盒测定血清总胆固醇水平（参见 材料表) 按照制造商说明书操作。每个样本设三个复孔，并同时运行标准参考样本用于校准。

7. 苏木精-伊红染色（HE染色）

1. 行为学测试后，使用戊巴比妥钠（20 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
2. 通过眼球后静脉丛采集血液。解剖组织并用4%多聚甲醛固定48小时。
   注意：组织在4%多聚甲醛中固定48小时后，实验可暂时中止；固定后的组织可在4 °C条件下保存于4%多聚甲醛中，最长可达1周，之后再进行脱水步骤（步骤7.3）。
3. 使用自动组织处理机，依次以梯度乙醇（60%、70%、90%乙醇各1小时；95%、100%乙醇各2小时）对固定组织进行脱水。
   警告：乙醇为低闪点易燃液体。储存和操作过程中应远离明火、热源和火花。应在通风良好的区域使用，并佩戴防静电手套和实验服。避免在实验区域大量储存，应存放于专用的易燃液体柜中。
4. 用二甲苯对脱水后的组织透明处理2小时，然后在60 °C下用石蜡浸润3小时（见材料表）。将组织按标准解剖平面定向包埋于石蜡中。
   注意：透明时间不宜过长，以免组织变脆；浸蜡过程中应保持石蜡温度恒定，防止结晶。石蜡包埋完成后，包埋的组织块可在室温下保存数月，切片步骤（步骤7.5）可根据需要随时进行。
5. 待石蜡块完全凝固后，使用石蜡切片机切取4 µm连续切片（见材料表），转移至聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，室温下自然干燥，然后密封保存。
   注意：切片贴附并自然干燥后，载玻片可在无尘环境中室温保存最多1个月，之后再进行染色步骤（步骤7.6）。
6. 使用自动染色系统对切片进行染色（见材料表）。
   1. 在二甲苯I和二甲苯II中脱蜡（各10分钟）。
   2. 通过递减浓度乙醇系列（100%、95%、80%，各2分钟）复水，然后用蒸馏水冲洗。
   3. 用苏木精染色3–8分钟，直至细胞核清晰可见，流水冲洗促进蓝化，再用伊红复染1–3分钟，使细胞质呈现适当的粉红色。
7. 将染色后的切片用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，用于切片扫描仪分析（见材料表）。

8. 油红O染色

1. 在取材后30分钟内，将新鲜肝组织包埋于最佳切割温度（OTC）包埋剂中（见材料表）。
   注意：将新鲜肝组织包埋于OTC包埋剂后，包埋组织可在-80 °C保存最长1个月，之后进行切片（步骤8.3），避免反复冻融。
2. 将包埋好的组织置于冷冻切片机中，待其完全冻结后再进行切片。
3. 将冷冻切片机温度设为-22 °C，将完全冻结的组织块连续切成8 µm厚的切片。
4. 将切片直接转移至未处理的玻璃载片上，并轻轻压平，以确保切片与载片之间紧密贴附。
5. 用中性福尔马林在室温下固定载片10分钟。固定后立即用60%异丙醇冲洗切片5秒。
6. 将预处理后的切片置于湿盒中，加入油红O染色液（见材料表），孵育20分钟。
7. 染色后，用60%异丙醇进行分化，直至脂滴与间质组织的边界清晰可辨。
   注意：分化过程中需密切观察切片，防止过度分化导致染色褪色。
8. 在光学显微镜下观察经分化和染色的切片，以评估与肝脂质沉积相关的组织病理学改变。
   注意：染色和分化完成后，切片可在4 °C保存最长3天后再进行显微镜检查，以确保染色效果不受影响。

9. 统计学分析

1. 将所有实验数据表示为均值 ±± 标准误（SEM）
2. 使用Shapiro-Wilk检验来验证数据是否符合正态分布。若正态性得到确认，则进行Levene检验以评估各组间的方差齐性。
   注意：若数据不符合正态性假设，应直接采用非参数检验。
3. 采用单因素方差分析（ANOVA）检验多个组间总体差异的统计学显著性，并使用Fisher最小显著性差异（LSD）检验进行两两比较。
   注意：当方差不齐时，应使用Welch ANOVA。
4. 使用双尾 Student's t 检验对两个独立样本组之间进行比较。
5. 将统计学显著性定义为双侧 p 值 < 0.05. 使用统计分析软件进行所有统计分析。

结果

双重暴露组群中代谢性病理的协同加重
纵向体重监测显示各组群间存在不同的生长轨迹。模型组和高脂高糖（HFHS）组的体重增长速度较对照组和限制热量（CR）组均显著加快。值得注意的是，CR组相对于对照组仅表现出轻微的加速增长（图3A）。进一步的代谢功能障碍证据来自空腹血糖和血脂水平的检测结果：模型组和HFHS组的空腹血糖及血脂水平均显著高于对照组和CR组；空腹血糖水平分别为9.26 ± 0.67 mmol/L（模型组）、8.46 ± 0.62 mmol/L（HFHS组）、5.60 ± 0.69 mmol/L（对照组）和5.50 ± 0.71 mmol/L（CR组）（模型组 vs. 对照组，P < 0.05；HFHS组 vs. 对照组，P < 0.05）；总胆固醇水平分别为5.12 ± 0.29 mmol/L（模型组）、10.10 ± 1.08 mmol/L（HFHS组）、11.14 ± 1.80 mmol/L（对照组）和5.00 ± 0.45 mmol/L（CR组）（模型组 vs. 对照组，P < 0.05；HFHS组 vs...

讨论

现代研究已明确证实，昼夜节律紊乱和高脂高糖饮食是导致机体系统性功能衰退的两个独立驱动因素。我们的数据显示，这两种因素共同作用所引发的病理损伤远比任一单一因素的简单叠加效应更为严重。与单因素干预组相比，复合模型组的脂肪含量相较于HFHS组无显著差异，但明显高于CR组。空腹血糖水平在模型组中最高。血清总胆固醇（TC）浓度在模型组和HFHS组中均显著升高。肝脏组织的油红O染色显示，模型组脂质积聚和空泡化最为显著。同时，模型小鼠在新物体识别实验中表现出认知功能障碍。值得注意的是，HFHS组和CR组也呈现出一定程度的认知功能受损趋势，尽管其程度较模型组轻微，这一现象与神经炎症加剧所引发的AMPA受体内化密切相关¹⁷。此外，对包含31项参数的综合衰弱指数分析表明，模型小鼠具有早衰特征，从而验证了该复合模型诱导衰老的能力。这些结果在机制层面与人类流行病学数据高度一致：流行病学研究显示，合并代谢综合征的轮班工作者患痴呆的风险高出3.5倍¹。本研究建立的模型在8个月内成功再现了生活方式诱导的代谢-认知功能衰退表型，通过实验验证的生理级联反应，架起了临床共病与分...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ANY-maze	科学	SA225
Accu-Chek Active 血糖监测仪	瑞士，罗氏诊断	accu check active
C75BL/6J 小鼠	中国，北京华阜康生物科技股份有限公司	编号 110324241101250228
握力计	美国，Columbus Instruments	1027CSM-E54
高脂高蔗糖饮食	中国，协通生物科技有限公司	XT303
HistoCore MULTICUT — 半自动旋转切片机	德国，Leica	RM2245
油红O溶液	中国，武汉赛维尔生物科技有限公司	G1260
最佳切割温度包埋剂	日本，Sakura	4583
可编程定时插座	中国，GONEO	GND-1
Tissue Tech Prisma Plus	日本，Sakura	20B2X00014000034
Tissue-Tek TEC 6 包埋模块	日本，Sakura	M01-021E-02
总胆固醇（TC）检测试剂盒	中国，苏州格瑞斯生物科技有限公司	G0909W