利用转录组分析鉴定乳腺癌中的枢纽基因、单核苷酸多态性及潜在药物靶点

摘要

本研究探讨了与HER2阳性乳腺癌治疗耐药性相关的线粒体氧化应激相关基因。通过转录组数据集、整合生物信息学分析和临床数据（n = 4,929），作者鉴定出MTHFD2和PRDX3为具有潜在预后价值的关键差异表达基因。in silico 分析提示遗传变异可能具有功能影响。

摘要

HER2阳性（HER2⁺）乳腺癌常对拉帕替尼（Lapatinib）等治疗产生耐药性，这一过程可能涉及线粒体代谢和氧化还原重编程。本研究旨在鉴定与线粒体氧化应激相关的差异表达基因（MOS-DEGs）作为耐药性的生物标志物，并表征其功能性非同义单核苷酸多态性（nsSNPs）及结构影响。通过DESeq2分析RNA-seq数据集（GSE231524、GSE231525）以鉴定差异表达基因（DEGs），并将这些基因与线粒体氧化应激相关基因取交集，获得MOS-DEGs。随后进行功能富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析、ROC分析、表达谱分析和生存分析。采用多种预测工具评估nsSNPs，并通过二级结构和三维建模分析其结构影响。整合转录组学与临床分析发现，MTHFD2和PRDX3是在线粒体氧化还原代谢中发挥相反调控作用的核心MOS-DEGs。MTHFD2显著上调，且与不良预后相关（HR = 1.53，p = 1.1 × 10⁻¹⁶），而PRDX3则表现出保护性表达模式（HR = 0.73，p = 7.7×10⁻¹⁰）。ROC分析提示二者具有预测治疗反应的潜力。nsSNP分析揭示了MTHFD2中的5个有害变异和PRDX3中的4个有害变异，其中rs1471336772（MTHFD2）和rs747786383（PRDX3）被鉴定为最具致病性的位点。这些变异在多个计算评分系统中均被预测为有害，包括SIFT ≤ 0.05、PolyPhen-2 ≥ 0.85、有害的CADD评分以及高REVEL评分，且位于催化域或氧化还原活性域内。结构建模表明，这些氨基酸替换可能破坏蛋白构象稳定性，干扰金属离子和辅因子结合位点，并影响NADPH再生或硫氧还蛋白依赖性过氧化物酶活性。分子动力学模拟预测这些变异可能导致结构稳定性下降和灵活性改变，提示其可能损害线粒体氧化还原调控功能。本研究确定MTHFD2和PRDX3为HER2⁺乳腺癌中线粒体氧化应激的关键调控因子。这些基因中的有害nsSNPs可能通过改变氧化还原平衡，进而影响代谢适应（MTHFD2）和抗氧化防御（PRDX3）过程。

引言

乳腺癌是全球女性中最常见的癌症，尽管在早期检测和靶向治疗方面已取得显著进展，但它仍是癌症相关死亡的主要原因之一^1,2,3。乳腺肿瘤内部的分子异质性导致了不同的临床结局和治疗反应，这对精准肿瘤学构成了持续的挑战^4,5。在已知的分子亚型中，人表皮生长因子受体2（HER2）阳性乳腺癌约占所有乳腺癌的15–20%，其特征是HER2基因扩增以及HER2受体酪氨酸激酶的过表达^6,7。尽管诸如曲妥珠单抗（trastuzumab）和拉帕替尼（lapatinib）等HER2靶向治疗已显著改善了患者的预后，但这些药物常出现原发性或获得性耐药，导致肿瘤复发和疾病进展^8,9。因此，阐明驱动HER2治疗耐药的分子机制，仍是临床肿瘤学中尚未满足的重大需求。

越来越多的证据表明，线粒体功能障碍和氧化应激在介导乳腺癌耐药性中发挥关键作用。线粒体除了在ATP生成中的经典作用外，....

方案

数据获取与预处理

本研究使用公开的转录组学和遗传学数据进行，未直接涉及人类或动物受试者。与HER2⁺乳腺癌治疗耐药性相关的转录组数据集从NCBI基因表达综合数据库（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）¹¹中获取。选择了两个RNA-seq数据集GSE231524和GSE231525，因其特别关注HER3驱动的耐药性以及在HER2+乳腺癌细胞系（BT474和MDA-MB-453）中DUSP6的抑制作用。这些数据集包括经拉帕替尼（1 µM）处理和DUSP6敲低后获得的亲本型、药物耐受型和药物耐药型表型。使用RStudio（v4.3.2）中的GEOquery（v2.70.0）和Biobase（v2.62.0）软件包访问原始计数矩阵及相应的元数据文件¹²。对元数据进行整理，为每个数据集定义两个主要对比：GSE231524将对照组（BT474亲本型，第0天）与药物耐受和药物耐药样本（第9天至第9个月）进行比较，而GSE231525将对照组（随机siRNA）与DUSP6敲低组（DUSP6-KD）进行比较。使用DESeq2（v1.42.0）框架进行质量控制和数据标准化，该框架采用方差稳定变换（VST）以减少异方差性，并确保样本间的可比性。使用ggplot2（v3.5.0）和pheatmap（v1.0.....

结果

差异基因表达分析

为研究与HER2⁺乳腺癌进展及治疗耐药性相关的转录组改变，采用两个独立的RNA-seq数据集GSE231524和GSE231525进行了差异表达谱分析。在第一个数据集（GSE231524）中，最初共定量了19,727个基因。经过标准化、过滤以及应用校正回归模型（ARM）进行差异表达分析后，保留了6,604个显著表达的基因（补充表S1）。在完成基因符号标准化、去除重复项及注释优化后，最终确定6,300个唯一基因用于后续分析。火山图、MA图和离散度估计结果（图3A-C）清晰展示了显著上调和下调基因的分布情况（校正后p值< 0.05，|log₂FC| ≥ 1）。离散度估计显示，在平均标准化计数范围内，方差模式拟合良好，表明DESeq2分析流程中的标准化效果可靠且模型拟合恰当⁴⁵。

同样，对于第二个数据集（GSE23.......

讨论

线粒体氧化应激是肿瘤适应性的显著特征，调控细胞存活、代谢可塑性及治疗耐药性。本研究通过整合转录组数据、功能富集分析、临床验证以及详细的in silico突变和结构分析，系统探讨了HER2⁺乳腺癌中与线粒体氧化应激相关的差异表达基因（MOS-DEGs）。差异表达与突变谱的整合分析，从多维度揭示了氧化还原-代谢调控与基因组不稳定性之间的关联。在所鉴定的MOS-DEGs中，MTHFD2和PRDX3作为关键的线粒体决定因子脱颖而出，它们在线粒体氧化应激适应、代谢调控及治疗反应中表现出独特但互补的功能⁴⁸。在这些基因中发现的多个有害非同义单核苷酸多态性（nsSNPs）进一步揭示了单个氨基酸替换如何影响酶活性、蛋白质折叠以及乳腺癌细胞的线粒体韧性。需要特别强调的是，本研究中所呈现的结果来源于整合性的计算和in silico分析，因此仍需进一步的实验验证以确认其生物学和临床相关性。

MTHFD2 作为一种代谢性癌基因及预后驱动因子

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AnnotationDbi	Bioconductor	v1.64.0	用于 HGNC 基因符号标准化与注释的 R 注释包。
apeglm	Bioconductor	DESeq2 中的方法	用于差异表达分析中 log2 倍数变化收缩的方法。
Biobase	Bioconductor	v2.62.0	用于访问和管理 GEO 衍生的表达数据与元数据对象的 R 包。
CADD	华盛顿大学 / Kircher 实验室	网络工具	用于预测非同义单核苷酸多态性（nsSNP）致病性的综合注释依赖性耗竭评分。
clusterProfiler	Bioconductor	v4.8.1	用于 GO 和 KEGG 富集分析的 R 包。
ComplexHeatmap	Bioconductor	v2.18.0	用于生成热图及表达聚类的 R 包。
Cytoscape	Cytoscape 联盟	软件	用于可视化由 STRING 衍生的蛋白质-蛋白质相互作用网络并结合 CytoHubba 进行关键基因优先排序的网络可视化平台。
dbSNP	NCBI	数据库	用于交叉验证优先级 nsSNP 的群体变异数据库。
DESeq2	Bioconductor	v1.42.0	用于标准化、方差建模和差异表达分析的 R 包。
dplyr	CRAN / tidyverse	v1.1.3	用于数据操作及基因集交集分析的 R 包。
DynaMut	墨尔本大学 / BioSig	网络服务器	用于估算蛋白质中突变相关稳定性与柔韧性变化的工具。
EnhancedVolcano	Bioconductor	v1.22.0	用于将差异表达结果以火山图形式可视化的 R 包。
Ensembl 基因组浏览器	EMBL-EBI / Ensembl	数据库	MTHFD2 和 PRDX3 的经典转录本序列来源。
Ensembl 变异效应预测器（VEP）	EMBL-EBI / Ensembl	网络工具	用于注释错义变异并整合预测评分的工具。
ExAC	布罗德研究所	数据库	用于 nsSNP 交叉验证的群体水平外显子组数据库。
基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）	NCBI	数据库	用于获取 HER2 阳性乳腺癌分析的转录组数据集的存储库。
基因本体（Gene Ontology）	基因本体联盟	GO:0006979	用于获取氧化应激相关基因并进行富集分析的本体资源。
GEOquery	Bioconductor	v2.70.0	用于访问 GEO 计数矩阵和元数据的 R 包。
ggplot2	CRAN / tidyverse	v3.5.0	用于数据可视化、聚类图及图形输出的 R 包。
ggraph	CRAN	R 包	用于富集分析和通路表示过程中的图结构与网络可视化的 R 包。
gnomAD	布罗德研究所	数据库	用于检查优先级 nsSNP 频率与分布的群体变异数据库。
GOplot	CRAN	R 包	用于 GO 富集可视化（包括弦图和汇总图）的 R 包。
GSE231524	NCBI GEO	登录号	用于分析亲本、药物耐受及耐药 BT474 表型的 RNA-seq 数据集。
GSE231525	NCBI GEO	登录号	用于分析 DUSP6 沉默在 HER2 阳性乳腺癌细胞中作用的 RNA-seq 数据集。
人类线粒体基因集 MitoCarta3.0	布罗德研究所	数据库	用于定义线粒体基因集的经人工整理的线粒体基因资源。
人类氧化应激基因数据库（HOSGDB）	HOSGDB	数据库	用于获取氧化应激相关基因的数据库。
igraph	CRAN	R 包	用于网络表示和通路可视化的 R 包。
iMutant 3.0	博洛尼亚大学 / Biofold	网络服务器	用于预测突变对蛋白质稳定性影响的工具。
Kaplan–Meier Plotter	KMplot	网络工具	用于乳腺癌队列中无复发生存分析的在线平台。
KEGG	京都大学	数据库	用于氧化磷酸化及通路富集分析的通路数据库。
KEGGREST	Bioconductor	R 包	用于获取和注释 KEGG 通路信息的包。
Lapatinib	文中未指明	1 μM 处理条件	在原始实验数据集中用于诱导药物耐受/耐药表型的 HER2 靶向抑制剂。
MetaLR	通过 Ensembl VEP 集成	评分	用于变异优先排序的计算型致病性指标。
MutPred2	MutPred	网络服务器	用于预测氨基酸替换功能后果的工具。
NetSurfP 3.0	丹麦技术大学	网络服务器	用于二级结构和溶剂可及性预测的工具。
org.Hs.eg.db	Bioconductor	v3.18.0	用于基因标识符映射的人类基因组注释包。
pathview	Bioconductor	R 包	用于将富集基因映射到 KEGG 通路的包。
pheatmap	CRAN	v1.0.12	用于热图绘制和聚类可视化的 R 包。
PolyPhen-2	哈佛大学 / 布莱根妇女医院	网络工具	用于估算氨基酸替换对结构/功能影响的计算预测工具。
蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）	RCSB PDB	数据库	MTHFD2 和 PRDX3 的实验解析蛋白质结构来源。
PSIPRED	伦敦大学学院	v3.2	用于二维拓扑分析的蛋白质二级结构预测服务器。
PyMOL	Schrödinger / PyMOL	v3.1	用于可视化蛋白质结构和突变位点的分子图形软件。
REVEL	通过 Ensembl VEP 集成	评分	用于错义变异优先排序的集成致病性评分。
ROCplotter	ROCplot.org	网络工具	用于基于 ROC 曲线验证乳腺癌应答队列中基因表达的在线平台。
RStudio	Posit	v4.3.1/v4.3.2 环境	用于转录组分析、富集分析和可视化工作流的统计计算环境。
SIFT	A*STAR	网络工具	用于将氨基酸替换分类为可耐受或有害的预测工具。
STRING	STRING 联盟	数据库	用于网络分析和枢纽基因识别的蛋白质–蛋白质相互作用数据库。
TMNplot	TMNplot.com	网络工具	用于比较正常、肿瘤和转移性乳腺组织中基因表达的平台。
VennDiagram	CRAN	v1.7.3	用于可视化差异表达基因与人工整理线粒体基因集之间重叠的 R 包。