利用转录组分析识别乳腺癌中的枢纽基因、单核苷酸多态性及潜在药物靶点

Summary

本研究探讨了与HER2阳性乳腺癌治疗耐药相关的线粒体氧化应激相关基因。利用转录组数据集、综合生物信息学和临床数据（n = 4,929），作者确定MTHFD2和PRDX3为具有潜在预后价值的关键差异表达基因。 在计算机模拟中。 分析显示遗传变异具有功能效应。

Abstract

HER2阳性（HER2⁺）乳腺癌常对拉帕替尼等治疗产生耐药性，可能涉及线粒体代谢和氧化还原重编程。本研究旨在鉴定线粒体氧化应激相关基因（MOS-DEGs）作为抗药性生物标志物，并表征其功能性NSSNPs及结构影响。利用DESeq2分析RNA测序数据集（GSE231524、GSE231525），以识别与线粒体氧化应激基因交叉获得MOS-DEG的DEGs。进行了功能富集、PPI分析、ROC分析、表达分析和生存分析。nsSNPs通过多种预测工具进行评估，结构影响则通过二级和三维建模进行评估。综合转录组和临床分析确认MTHFD2和PRDX3为线粒体氧化还原代谢中表现出相反调控作用的中心MOS-DEGs。MTHFD2显著上调，且与预后较差相关（HR = 1.53，p = 1.1 × 10⁻¹⁶），而PRDX3表现出保护性表达模式（HR = 0.73，p = 7.7×10⁻¹⁰）。ROC分析显示它们具有作为治疗反应预测因子的潜力。nsSNP分析显示MTHFD2中存在五个有害变异，PRDX3中存在四个有害变异，其中rs1471336772（MTHFD2）和rs747786383（PRDX3.）被认定为最具致病性。这些变异基于多种计算评分系统预测具有破坏性，包括SIFT ≤ 0.05、PolyPhen-2 ≥0.85、有害的CADD评分和高REVEL评分，且均位于催化或氧化还原活性域内。结构模型表明，这些取代可能破坏构象稳定性，破坏金属和辅因子结合位点，并影响NADPH再生或硫氧还蛋白依赖性过氧化物酶活性。分子动力学预测显示结构稳定性可能丧失和柔韧性改变，暗示线粒体氧化还原控制可能受损。本研究鉴定MTHFD2和PRDX3作为HER2⁺ 乳腺癌线粒体氧化应激的调控因子。这些基因中的有害nsSNP可能导致氧化还原平衡的改变，可能影响代谢适应（MTHFD2）和抗氧化防御（PRDX3）。

Introduction

乳腺癌是全球女性中最常被诊断的癌症，尽管早期发现和靶向治疗取得了显著进展，但它仍是导致癌症相关死亡的主要原因之一（^1,2,3）。乳腺肿瘤中的分子异质性导致了多样的临床结局和治疗反应，这对精准肿瘤学构成了持续的挑战 ^4,5。在已知的分子亚型中，人类表皮生长因子受体2（HER2）阳性乳腺癌约占所有乳腺癌的15–20%，其特征是HER2基因扩增及HER2受体酪氨酸激酶的过度表达 ^6,7。尽管HER2靶向疗法如曲妥珠单抗和拉帕替尼显著改善了患者预后，但这些药物的初级和获得性耐药性常常出现，导致肿瘤复发和^{疾病进展8,9}。因此，理解驱动HER2治疗耐药性的分子机制仍然是临床肿瘤学中一个重大未被满足的需求。

新兴证据表明，线粒体功能障碍和氧化应激在介导乳腺癌药物耐药性中起关键作用。线粒体除了在ATP产生中的作用外，还是细胞凋亡、氧化还原信号和代谢可塑性的关键调控因子——这些都是癌细胞利用以抵御治疗压力的过程。特别是，耐药HER2⁺ 癌细胞表现出向氧化磷酸化（OXPHOS）转变，活性氧（ROS）缓冲增强，线粒体生物发生发生改变。这些适应使细胞能够维持存活信号并避免细胞凋亡，尽管HER2信号通路持续受阻。编码线粒体复合亚基和氧化还原调节酶的基因因此成为克服耐药性的潜在生物标志物和治疗靶点。

与此同时，线粒体或氧化应激相关基因中的非同义单核苷酸多态性（nsSNPs）可以改变蛋白质结构和功能，影响酶活性、药物反应和疾病易感性¹⁰。利用计算机技术预测nsSNPs的有害影响 。SIFT、PolyPhen-2和CADD等工具为识别可能导致癌症异质性和治疗耐药性的功能变异提供了快速手段。因此，整合转录组和突变数据提供了基因调控失调和结构改变的多维视图，涵盖转录和基因组层面。

近年来，生物信息学和系统生物学的进展使得通过大规模表达分析和基于网络的分析，高通量识别潜在驱动基因成为可能。像基因表达综合库（GEO）这样的公开数据库提供了宝贵的RNA测序数据集，捕捉了实验模型和患者队列中的分子变化。结合DESeq2、clusterProfiler和STRING–Cytoscape网络分析等分析工具，这些资源使差异表达基因（DEGs）、通路富集和枢纽基因发现成为可能。重要的是，将线粒体氧化应激基因特征与DEGs整合，可以揭示HER2靶向治疗耐药性背后的新型分子机制，并识别治疗干预的候选生物标志物。

HER3驱动的抵抗轴近年来作为HER2抑制后的重要补偿通路受到关注。HER3的活化恢复下游PI3K/AKT信号，促进细胞存活和药物耐受性（见图1）。DUSP6（双特异性磷酸酶6）是ERK信号的负调节因子，被认为参与调节这种适应性反应。抑制DUSP6会重新激活ERK信号，可能抵消HER3介导的耐药性，但其与线粒体氧化应激和代谢适应的相互作用仍不充分。因此，对HER2⁺ 细胞系（BT474和MDA-MB-453）在DUSP6抑制和长期拉帕替尼暴露下的比较转录组分析，为剖析药物耐药性的分子决定因素提供了理想模型。

图1。线粒体功能障碍、氧化应激与乳腺癌进展之间的分子景观示意图。这些整合的分子机制是乳腺癌中线粒体氧化应激介导致癌的基础。线粒体电子传递链复合物失调，尤其是涉及 DUFS3、 UQCRC1、 COX4I1、 SDHA和 ATP5PO的异常， 会导致活性氧（ROS）过度生成，导致氧化性DNA损伤、脂质过氧化以及线粒体膜电位受损。这些氧化扰动激活了如PI3K/AKT、MAPK和NF-κB等致癌信号通路，同时抑制包括p53和BAX在内的凋亡调控因子，从而促进肿瘤细胞的存活、增殖和免疫逃避。图示还强调线粒体氧化应激对癌症代谢和肿瘤微环境的双重影响，强调其在HER2+乳腺癌条件下对治疗抵抗性和免疫调节的贡献。该整合模型为后续转录组和基于SNP的分析奠定了机制基础，旨在识别线粒体驱动基因和潜在治疗靶点。 请点击此处查看该图的放大版本。

本研究旨在系统识别中心基因、功能性nsSNPs及与HER2⁺ 乳腺癌线粒体氧化应激相关的潜在药物靶点。通过整合GSE231524和GSE231525的转录组数据与经过精心筛选的线粒体和氧化应激相关基因集，本研究旨在定义对治疗耐药性有贡献的线粒体氧化应激相关差异表达基因（MOS-DEGs）。后续分析包括基因本体（GO）和KEGG通路富集、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建、枢纽基因优先排序以及利用Kaplan–Meier免疫治疗数据库进行生存相关分析。此外，还进一步研究了关键基因对nsSNP变异及潜在结构影响，以界定突变驱动的功能后果。

通过结合转录组分析、网络生物学和 计算机突 变分析，本研究为发现HER2⁺ 乳腺癌潜在线粒体生物标志物和治疗靶点提供了一个综合框架。氧化磷酸化关联枢纽基因及其功能SNP的鉴定，可能为精准治疗策略的发展铺平道路，以克服HER2靶向药物耐药性，改善患者结局。

Protocol

数据检索与预处理

本研究使用公开可得的转录组和遗传数据进行;没有直接涉及人类或动物受试者。与HER2⁺乳腺癌治疗耐药性的转录组数据集检索自NCBI基因表达综合数据库（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）¹¹。选中了两个RNA-seq数据集，GSE231524和GSE231525，因其特别关注HER3驱动的耐药性和HER2+乳腺癌细胞系（BT474和MDA-MB-453）中的DUSP6抑制作用。这些数据集包括由拉帕替尼（1 μM）暴露和DUSP6敲低产生的亲代表型、耐药性和耐药表型。原始计数矩阵及对应的元数据文件通过 RStudio（v4.3.2）¹² 中的 GEOquery（v2.70.0）和 Biobase（v2.62.0）包访问。元数据经过筛选，定义了两个主要对比：GSE231524比较对照组（BT474亲本，第0天）与耐药和耐药样本（第9天至第9个月），GSE231525组比较对照组（Scrambled siRNA）与DUSP6敲低样本（DUSP6-KD）。质量控制和数据归一化采用了DESeq2（v1.42.0）框架，该框架采用方差稳定变换（VST）以降低异差性并确保样本间的可比性。在差别表达分析前，使用ggplot2（v3.5.0）和pheatmap（v1.0.12）视觉评估数据分布和聚类模式，以确认数据一致性并识别潜在异常值，随后进行差异表达分析^13,14。

本研究明确区分了来自细胞系转录组数据集的发现与患者来源临床数据集所得的结果。细胞系数据主要用于探索性分析，包括鉴定差异表达基因以及在受控实验模型中生成初步机制见解。相比之下，患者来源数据集用于基因表达模式的外部验证和临床相关性评估，包括预后评估。因此，细胞系模型和临床队列的结果会被分开解释，以避免过度泛化，并确保所有发现都具有适当的转化背景。

差异基因表达分析

进行了差异表达分析，以识别在对照与治疗条件下显著调节的基因。归一化计数使用集成于DESeq2的调整回归模型（ARM）处理，以准确估计log₂折叠变化和统计显著性。设计公式定义为~条件，代表对照组与处理组。调整后p值（FDR）<0.05且绝对log₂折叠变化≥1的基因被认为表达差异显著。利用apeglm方法进行了Log₂折叠变化缩减，以增强效应量估计的稳健性。分析结果通过EnhancedVolcano （v1.22.0）¹⁵和ggplot2¹⁶可视化，生成了火山图和MA图，显示表达强度与统计置信度之间的关系。还在DESeq2中评估了分散估计，以确保准确的方差建模和生物复制间的一致归一^化。

线粒体氧化应激相关差异表达基因（MOS-DEGs）的检索与鉴定

为了研究能量代谢、氧化应激与耐药性之间的联系，我们从多个数据库中汇编了一份完整的线粒体及氧化应激相关基因列表，包括人类MitoCarta3.0¹⁸ （https://personal.broadinstitute.org/scalvo/MitoCarta3.0/human.mitocarta3.0.html）、Gene Ontology（GO：0006979，氧化应激反应）（http://geneontology.org/）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）氧化磷酸化途径（https://www.genome.jp/kegg/ 年），以及人类氧化应激基因数据库（HOSGDB）（http://hosgdb.com/ 年）。所有检索的基因均通过org标准化为HGNC批准的基因符号。Hs.eg.db（v3.18.0）和AnnotationDbi（v1.64.0），同时删除重复条目、伪基因和非编码RNA，以确保注释准确性。由此筛选出的线粒体氧化应激基因面板（MOS基因）随后被用作与两个转录组数据集中识别出的差异表达基因整合的参考集。

在R中，通过dplyr（v1.1.3）¹⁹ 和基础R的intersect（）函数完成了从GSE231524和GSE231525获得的DEG的交集。这种整合方法使得MOS-DEGs的识别成为可能，这些基因代表与线粒体代谢、氧化还原调控和氧化应激适应功能相关。数据集间的重叠通过R语言中的VennDiagram（v1.7.3）包可视化，展示了^{实验模型中}共享和独特的基因。细化后的MOS-DEGs列表被用于后续分析，提供了关于HER2靶向治疗耐药背后转录和代谢重编程机制的机制洞见。

MOS-DEGs的表达分析与可视化

通过RStudio中的ComplexHeatmap （v2.18.0）²¹ 和pheatmap （v1.0.12）软件包对已识别的MOS-DEGs进行表达分析，以可视化父本、耐药和耐药条件下的全局表达模式。通过z分数尺度法对归一化计数数据进行转换，以标准化样本间的基因表达矩阵。聚类采用欧几里得距离和完全连锁方法进行，以检测共表达模式并区分条件特异性的转录谱。使用ggplot2生成热图和聚类图，以确保各条件的清晰视觉区分。这种可视化方法有助于识别与线粒体活性、氧化应激调节以及耐药状态下代谢重编程相关的基因群。

功能富集与通路注释

为探究已识别MOS-DEGs的生物学意义和调控机制，使用R Studio（版本4.3.1）进行了基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。分析在整洁宇宙环境中进行，使用多种Bioconductor软件包实现可重复计算和可视化。基因注释和标识符映射均使用该组织完成。Hs.eg.db基于 智人 参考基因组（GRCh38）的数据库（https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/）。GO富集分析使用clusterProfiler软件包（版本4.8.1;https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/）进行，该软件将基因分为三大本体——生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。enrichGO²² 函数参数设为 p值 <0.05并 调整p值。 （FDR）<0.05，采用Benjamini–Hochberg校正法。可视化图，包括条形图、点图和弦图，均使用enrichplot（https://bioconductor.org/packages/enrichplot/）、ggplot2¹³ （https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/）和GOplot（https://cran.r-project.org/web/packages/GOplot/）生成。这些工具为富集 GO 术语及其基因关联提供了结构化的视图。

KEGG通路富集通过clusterProfiler包中的enrichKEGG（）函数完成，参考了人类KEGG数据库（https://www.genome.jp/kegg/）。KEGGREST软件包（https://bioconductor.org/packages/KEGGREST/）用于通路数据检索和注释。调整后 p值 （q值）<0.05的通路被视为显著。可视化和路径映射使用路径视图（https://bioconductor.org/packages/pathview/）、ggplot2和enrichplot进行，网络表示则使用igraph和ggraph²³。所有浓集分析和可视化均在R Studio（v4.3.1）中实现，采用可重复代码和标准化的生物导体工作流程，确保可靠识别与MOS-DEG相关的富集功能类别和生物通路。

基于ROC的乳腺癌预测性生物标志物验证

为验证MOS-DEGs的临床预测能力，使用ROCplotter在线工具（https://www.rocplot.org/）进行了受试者工作特征（ROC）曲线分析²⁴。ROCplotter是一个集成的基于网络平台，结合了基因表达数据与来自3,104名乳腺癌患者的临床注释治疗反应数据集，包括接受化疗、激素治疗或抗HER2药物治疗的患者。

分析采用“病理性完全反应”作为结局变量，“任何化疗”作为治疗类别。根据平台内的临床注释，Affymetrix微阵列数据集中得出的基因表达值自动分为响应组和非响应组。

受试者工作特征（ROC）曲线（AUC）、曼-惠特尼U检验、折叠变化和卡方检验被应用于评估每个基因区分响应者与非响应者的能力。曲线下面积（AUC）被用作评估判别性能的主要指标。AUC值大于0.55且ROC p值<0.05被视为显著，代表转录组生物标志物典型的中等预测表现，并采用假发现率（FDR）修正以保持分析严谨性。

所有选定的MOS-DEG均使用对应的Affymetrix探针ID进行查询。在临床乳腺癌队列中评估了各基因的区分潜力，表达数据被分层为响应组和非响应组。ROC曲线、箱形图及相关统计输出由ROCplotter平台直接生成，并导出用于下游可视化和比较。该分析量化了参与线粒体氧化应激的氧化还原和代谢调控因子的预测价值。在临床样本中表现出一致预测显著性的基因被保留，纳入最终预测面板。

肿瘤、正常和转移组织中的差异表达分析（TNMplot分析）

使用TNMplot网络工具 v2 （https://tnmplot.com/analysis/）²⁵，分析了正常、肿瘤和转移乳腺组织中主要MOS-DEGs的表达模式。同时分析了RNA-Seq（TCGA + GTEx + MET500）和基因芯片数据集，以确保跨平台验证。“多基因分析”模块被用于乳腺浸润性癌，作为²⁶号组织的选择类型。表达值进行了log₂转化，并在肿瘤组与正常组（TvsN）、转移组与肿瘤组（MvsT）及转移组与正常组（MvsN）间进行比较。TNMplot 利用 Mann–Whitney U 检验自动计算了折叠变化（FC）和 p 值，以评估统计显著性。表达分布被可视化为直接从TNM图界面生成的箱形图和密度图，绿色、红色和灰色分别代表正常组织、肿瘤组织和转移组织。所有图表均以高分辨率导出，以便整合进结果部分。这一双平台分析使得与乳腺癌进展相关的关键线粒体氧化还原代谢调控因子的可靠识别和验证成为可能²⁷。

使用Kaplan–Meier绘图仪的存活与预后分析

为评估MOS-DEGs在乳腺癌中的预后相关性，使用Kaplan–Meier在线绘图仪工具（https://kmplot.com/analysis/）²⁸进行了生存分析。该数据库整合了来自多个GEO、EGA和TCGA数据集的4900多名乳腺癌患者的基因表达和生存数据。分析采用对应优先基因的单个Affymetrix探针ID：225609_at（GSR）、201761_at（MTHFD2）、201619_at（PRDX3/AOP1）和201128_s_at（ACLY）进行无复发生存（RFS）。患者根据中位表达阈值分为高表达组和低表达组，并采用Kaplan–Meier方法估算生存概率。使用对数秩检验评估生存曲线间的统计显著性，工具自动计算了带有95%置信区间（CI）的危险比（HR）。所有分析均采用RFS终点，未基于激素受体或HER2状态（ER、PR、HER2=全部）进行限制。删除了冗余样本，并验证了比例风险假设以确保统计稳健性。质量控制滤镜排除了偏置微阵列。多次测试未采用手动探针选择或p值校正，符合KM绘图仪的默认设置。统计显著性定义为p. < 0.05。存活图被可视化并下载为高分辨率，以便进一步解读，比较各候选MOS基因^29,30的高低表达体结局。

本分析仅使用HER2⁺ 乳腺癌样本的数据集，用于鉴定差异表达基因（DEGs）和枢纽基因。随后，进行了不限于HER2状态（ER、PR、HER2=全部）的生存分析，以评估已识别基因的更广泛预后相关性和可推广性。该方法被用作次级验证步骤，而非重新定义研究重点。因此，对已识别中枢基因的预后影响需谨慎解读，主要结论仍限于HER2⁺ 乳腺癌。

MTHFD2-201（ENST00000394053.7）和PRDX3-201（ENST00000298510.4）的典范转录本序列检索自Ensembl基因组浏览器（https://www.ensembl.org）^31,32。变异注释和分类使用Ensembl变异效应预测器（VEP）（https://www.ensembl.org/vep），该工具为每个已识别变异提供了详细的基因组背景、密码子变化和氨基酸替换。仅选择错义变体（非同义SNP）进行下游分析。

致病性预测与变异优先排序

每个nsSNP的功能后果通过多种计算预测工具的组合进行了评估。应用SIFT（https://sift.bii.a-star.edu.sg）评估氨基酸保护，将得分≤0.05的变异归类为有害³³。PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2）估算了替代的结构和进化影响，得分≥0.85表示可能的损害³⁴。CADD（https://cadd.gs.washington.edu）提供了整合多个注释的综合有害性评分，值≥20表示高致病潜能³⁵。MetaLR³⁶、Mutation Assessor和REVEL的辅助指标通过VEP接口整合，以增强预测信度³⁷。符合MetaLR ≥0.70、突变评估者≥3.5和REVEL≥0.75阈值的变异被优先考虑为可能致病。

结构与机制影响预测

为评估氨基酸替换如何影响结构完整性和生化功能，采用MutPred2（http://mutpred.mutdb.org）³⁸ 和DynaMut（http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut）³⁹进一步分析了每个排名前列的nsSNP。MutPred2估算功能破坏的概率，包括催化活性改变、金属结合残基的增减、溶剂可及性变化及变构调节，评分≥0.80被归类为高度致病性。DynaMut计算了野生型与突变蛋白之间的吉布斯自由能变化（ΔΔG），评估了稳定性变化的方向和大小，并生成了原子位移和氢键重排的可视化。

二维和三维结构建模与溶剂可及性剖面

通过实验分辨的MTHFD2和PRDX3晶体结构来自蛋白质数据库（PDB），并使用PyMOL V：3.1 （https://pymol.org）⁴⁰ 处理，以可视化有害残基的空间分布。通过引入相应的氨基酸替换，随后进行结构精细和能量最小化，创建了突变体模型。三维比较分析显示了次级元素的变化、原子间接触的变化以及nsSNPs与催化和辅因子结合域的空间接近，揭示了氧化还原和代谢功能的潜在干扰。

二级结构和溶剂暴露分析使用PSIPRED V： 3.2 （http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）^41,42和NetSurfP 3.0 （https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetSurfP-2.0）⁴³进行。这些工具预测了α螺旋、β股、线圈和无序区域，并预测了相对溶剂可及性（RSA）得分。对具有中高RSA值和结构顺序的残基进行了绘制，以识别暴露于溶剂和功能关键的位置。受影响位点通过二维拓扑图可视化，以确定有害突变是否发生在刚性催化核心或柔性环区，从而预测其对蛋白质折叠动态和酶效率的可能影响。

数据库交叉验证、函数集成与稳定性验证

每个优先级nsSNP均与包括dbSNP、1000 Genomes、ExAC和gnomAD在内的群体级基因组数据库交叉比对，以确认变异频率、全球等位基因分布及先前报告的临床关联。进化保守、结构建模和基于机器学习的功能预测的整合，使得识别出MTHFD2和PRDX3中高置信度的有害变异。这些高影响突变随后被定位到功能域，阐明其在线粒体氧化应激失衡、代谢信号改变及乳腺癌治疗耐药性中的潜在作用。为进一步确认每次有害置换的热力学影响，使用iMutant 3.0 （https://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant3.0.html）⁴⁴ ，利用序列和结构数据预测突变对蛋白质稳定性的影响。分析计算了ΔΔG值（kcal/mol），表示野生型与突变蛋白之间自由能的变化。ΔΔG值为负的变异被归类为不稳定突变，表明蛋白质稳定性降低和展开概率增加。将iMutant预测与DynaMut和MutPred2结果整合，为识别可能影响氧化还原功能、催化完整性和整体蛋白质构象稳定性的结构关键残基提供了交叉验证。

综合功能性解释与治疗相关性

通过与dbSNP、gnomAD和ExAC群体数据库交叉比对，验证所有识别出的有害nsSNP，以验证次要等位基因频率及先前报告的癌症表型关联。进化保守、结构建模和稳定性数据的整合解读表明，高影响突变rs1471336772（MTHFD2）和rs747786383（PRDX3）对蛋白质构象和催化效率的有害影响最为显著。计算结果综合表明，MTHFD2的突变使NADPH依赖的氧化还原代谢不稳定，而PRDX3的突变则削弱过氧化物酶介导的氧化应激防御，导致线粒体功能障碍和肿瘤侵袭性。基于nsSNP的结构和功能分析为未来治疗筛查和突变验证提供了计算基础，强调MTHFD2和PRDX3作为氧化还原靶向乳腺癌治疗的精准生物标志物。为提高清晰度并全面概述分析策略， 图2展示了总结研究主要步骤的工作流程示意。该工作流程集成了差异基因表达分析、线粒体基因过滤、蛋白质-蛋白质相互作用网络构建、利用ROC分析进行临床验证以及基于nsSNP的结构表征。该分阶段框架强调了从转录组数据处理到生物标志物鉴定和功能解释的逻辑进程。

图2。HER2⁺ 乳腺癌中线粒体氧化应激相关生物标志物的识别和验证整合多步工作流程。本示 意图总结了本研究所采用的分析流程。首先，对RNA测序数据集（GSE231524和GSE231525）进行了差异基因表达（DEG）分析，以识别显著改变的基因。这些DEGs与经过筛选的线粒体氧化应激相关基因交叉，获得MOS-DEGs。随后，利用STRING和Cytoscape进行了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，以识别枢纽基因和功能模块。随后，利用ROCplotter平台应用受试者工作特征（ROC）曲线分析，评估临床队列中选定基因的预测表现。最后，进行了非同义SNP（nsSNP）分析和结构建模，以评估优先基因（MTHFD2和PRDX3）关键变异的潜在功能和结构影响。这一整合工作流程将转录组、网络、临床和结构分析相结合，以识别潜在的生物标志物和治疗靶点。 请点击此处查看该图的放大版本。

Results

差异基因表达分析

通过两个独立的RNA-seq数据集GSE231524和GSE231525，进行了差异表达剖析，以研究与HER2⁺ 乳腺癌进展及治疗耐药性的转录改变。在第一个数据集（GSE231524年）中，最初共定量了19,727个基因。经过归一化、过滤及调整回归模型（ARM）对差异表达的应用，6604个基因被保留为显著表达（补充表S1）。经过基因符号标准化、重复去除和注释细化，最终确定了6300个独特基因以供后续分析。火山图、MA图和扩散估计（图3A-C）清晰展示了显著上调和下调基因的分布（调整p p < 0.05，|log₂FC| ≥1）。离散估计显示平均归一化计数的良好拟合方差模式，表明稳健归一化和DESeq2工作流程中的适当模型拟合⁴⁵。

同样，第二个数据集（GSE231525）获得了初始的18,372个基因。在应用...

Discussion

线粒体氧化应激是肿瘤适应的标志性特征，决定细胞存活、代谢可塑性和治疗耐药性。本研究系统性探索了HER2⁺ 乳腺癌中与线粒体氧化应激相关的差异表达基因（MOS-DEGs），通过整合转录组数据、功能富集、临床验证以及计算机 模拟 突变和结构分析。差异表达与突变剖析的整合，提供了对氧化还原代谢调控与基因组不稳定性交织的多维理解。在已识别的MOS-DEGs中，MTHFD2和PRDX3成为关键线粒体决定因子，在氧化应激适应、代谢调控和治疗反应方面表现出不同但互补的功能⁴⁸。在这些基因中发现多个有害的非同义SNP（nsSNPs）进一步揭示了单氨基酸取代如何调节乳腺癌细胞中的酶活性、蛋白质折叠和线粒体韧性。需要强调的是，本研究呈现的发现均基于整合计算和 计算机 分析，因此需要进一步的实验验证以确认其生物学和临床相关性。

MTHFD2作为代谢致癌基因及预后驱动因素

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnnotationDbi	Bioconductor	v1.64.0	用于HGNC基因符号标准化和注释的R注释包。
apeglm	Bioconductor	method in DESeq2	用于差异表达分析中的log2折叠变化收缩的方法。
Biobase	Bioconductor	v2.62.0	用于访问和管理GEO衍生的表达和元数据对象的R包。
CADD	华盛顿大学/Kircher实验室	网页工具	用于nsSNP致病性预测的组合注释依赖性耗竭得分。
clusterProfiler	Bioconductor	v4.8.1	用于GO和KEGG富集分析的R包。
ComplexHeatmap	Bioconductor	v2.18.0	用于热图生成和表达聚类的R包。
Cytoscape	Cytoscape联盟	软件	与STRING衍生的PPI网络和CytoHubba优先级一起使用的网络可视化平台。
dbSNP	NCBI	数据库	用于交叉验证优先级nsSNP的人群变异数据库。
DESeq2	Bioconductor	v1.42.0	用于归一化、方差建模和差异表达分析的R包。
dplyr	CRAN / tidyverse	v1.1.3	用于数据操作和基因集交集的R包。
DynaMut	墨尔本大学/BioSig	网页服务器	用于估计蛋白质中的突变相关稳定性和灵活性变化的工具。
EnhancedVolcano	Bioconductor	v1.22.0	用于将差异表达结果可视化为火山图的R包。
Ensembl基因组浏览器	EMBL-EBI / Ensembl	数据库	MTHFD2和PRDX3的规范转录本序列来源。
Ensembl变异效应预测器（VEP）	EMBL-EBI / Ensembl	网页工具	用于注释错义变异并整合预测得分的工具。
ExAC	Broad Institute	数据库	用于nsSNP交叉验证的人群水平外显子数据库。
基因表达综合（GEO）	NCBI	数据库	用于检索HER2阳性乳腺癌分析的转录组数据集的存储库。
基因本体	基因本体联盟	GO:0006979	用于检索氧化应激相关基因和用于富集分析的本体资源。
GEOquery	Bioconductor	v2.70.0	用于访问GEO计数矩阵和元数据的R包。
ggplot2	CRAN / tidyverse	v3.5.0	用于数据可视化、聚类图和图形输出的R包。
ggraph	CRAN	R包	用于在富集和通路表示期间进行图形和网络可视化的R包。
gnomAD	Broad Institute	数据库	用于检查优先级nsSNP的频率和分布的人群变异数据库。
GOplot	CRAN	R包	用于GO富集可视化（包括弦图和摘要图）的R包。
GSE231524	NCBI GEO	访问	用于分析亲代、耐药和耐药BT474表型的RNA-seq数据集。
GSE231525	NCBI GEO	访问	用于分析HER2阳性乳腺癌细胞中DUSP6敲除的RNA-seq数据集。
Human MitoCarta3.0	Broad Institute	数据库	用于定义线粒体基因集的精选线粒体基因资源。
Human Oxidative Stress Gene Database (HOSGDB)	HOSGDB	数据库	用于检索氧化应激相关基因的数据库。
igraph	CRAN	R包	用于网络表示和通路可视化的R包。
iMutant 3.0	博洛尼亚大学/Biofold	网页服务器	用于预测蛋白质稳定性的突变效应的工具。
Kaplan–Meier Plotter	KMplot	网页工具	用于乳腺癌队列复发无生存分析的在线平台。
KEGG	京都大学	数据库	用于氧化磷酸化和通路富集分析的通路数据库。
KEGGREST	Bioconductor	R包	用于检索和注释KEGG通路信息的包。
Lapatinib	未在手稿中指定	1 μM处理条件	用于源实验数据集的HER2靶向抑制剂，用于衍生耐药/耐药表型。
MetaLR	通过Ensembl VEP集成	分数	用于变异优先级的计算致病性指标。
MutPred2	MutPred	网页服务器	用于预测氨基酸替换的功能后果的工具。
NetSurfP 3.0	丹麦技术大学	网页服务器	用于二级结构和溶剂可达性预测的工具。
org.Hs.eg.db	Bioconductor	v3.18.0	用于基因标识符映射的人类基因组注释包。
pathview	Bioconductor	R包	用于将富集基因映射到KEGG通路的包。
pheatmap	CRAN	v1.0.12	用于热图绘制和聚类可视化的R包。
PolyPhen-2	哈佛/布莱根妇女医院	网页工具	用于估计氨基酸替换的结构/功能影响的计算预测器。
蛋白质数据库（PDB）	RCSB PDB	数据库	MTHFD2和PRDX3实验解析蛋白质结构的来源。
PSIPRED	伦敦大学学院	v3.2	用于2D拓扑分析的蛋白质二级结构预测服务器。
PyMOL	Schrödinger / PyMOL	v3.1	用于可视化蛋白质结构和突变位点的分子图形软件。
REVEL	通过Ensembl VEP集成	分数	用于错义变异优先级的集成致病性得