探究卵巢微环境：小鼠卵巢体细胞的分离、二维培养及类器官培养方法

摘要

我们描述了从小鼠卵巢的基质富集部分分离小鼠卵巢体细胞的方法，以及采用无支架方法生成小鼠卵巢体细胞类器官的技术。

摘要

卵巢由卵泡内及周围间质中的多种体细胞群体组成，这些体细胞对维持卵巢功能以及产生高质量配子至关重要。本文报道了从小鼠卵巢中分离体细胞的方法，包括内皮细胞、上皮细胞、类固醇生成细胞、间质细胞和免疫细胞。当这些原代卵巢体细胞在传统的二维培养系统中接种和培养时，卵巢中典型的细胞异质性、组织结构以及细胞间和细胞-基质相互作用会丧失。因此，我们还描述了如何采用无支架方法生成小鼠卵巢体细胞类器官。这些类器官可自发组装，维持多种细胞群体，并产生细胞外基质和分泌因子（包括细胞因子）。类器官可用于共培养实验，并可在体外培养至少3周，保持高存活率。总体而言，这些模型能够从体细胞角度研究卵巢的生理与病理过程。

引言

尽管卵母细胞（即雌性配子）对于繁衍下一代至关重要，但卵巢中的体细胞群体在配子发育、类固醇激素生成以及卵巢稳态中也发挥着关键作用。卵母细胞被颗粒细胞和膜细胞等体细胞包围，共同构成卵巢的功能单位——卵泡。颗粒细胞通过跨 zona 突起与卵母细胞形成物理连接，除调控减数分裂阻滞外，还为卵母细胞提供代谢支持和营养物质^1,2。此外，颗粒细胞和膜细胞在促性腺激素刺激下可产生包括雌激素、孕酮和雄激素在内的类固醇激素，这些激素的作用不仅限于生殖系统，还影响心血管、肌肉骨骼及神经系统，从而对女性整体健康产生重要影响³。卵巢卵泡发育于一个异质性的卵巢间质环境中，该间质由血管系统、免疫细胞、多种间质成纤维细胞和间充质细胞，以及高度有序的细胞外基质（ECM）共同组成⁴。这一间质微环境提供物理和化学信号，调控卵泡生长、排卵及黄体化过程⁴。

分离和培养配子及卵泡有多种方法 体外，并且这些方法推进了我们对卵子发生和卵泡发生过程的理解⁵然而，由于缺乏可靠的手段，卵巢的体细胞区室在很大程度上尚未得到充分研究 体外 模型。目前的卵巢体细胞区室模型大多局限于单一细胞类型，例如成纤维细胞、卵巢表面上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞或颗粒细胞。^{6,7,8,9,10,11}二维培养广义定义的原代卵巢体细胞随时间推移倾向于促进巨噬细胞群体的生长，导致细胞异质性的丧失¹²此外，传统的二维（2D）单层培养无法模拟卵巢中存在的多种细胞间及细胞与基质间的相互作用。卵巢组织外植体能够维持天然组织的细胞和结构复杂性，但其组成会因其在卵巢内的取材位置不同而有所差异。^13,14.

类器官是三维（3D）、多细胞、微型化的器官或组织模型，能够重现 体内 组织与功能^15,16类器官可由来自正常或病变组织的干细胞或原代细胞生成¹⁵在女性生殖系统中，已成功构建用于模拟子宫内膜、输卵管、宫颈和胎盘的类器官¹⁷然而，就卵巢而言，直到最近，类器官模型仍局限于单一细胞类型，例如卵巢表面上皮细胞或癌细胞，或者由诱导性多能干细胞生成，以模拟卵泡结构而非卵巢间质^17,18最近的研究利用从小鼠、恒河猴和人类卵巢组织中分离的体细胞异质性群体，生成并表征了类器官^19,20,21这些类器官模型使得研究人员能够探究卵巢衰老背后的细胞机制，以及邻苯二甲酸盐暴露对细胞外基质（ECM）组成的影响。^19,21.

鉴于体细胞在卵泡和间质中对卵巢功能具有至关重要的作用，本文描述了从小鼠卵巢间质富集组分中分离体细胞以及培养这些细胞的方法。 体外 使用传统的单层培养或类器官模型。利用无支架的琼脂糖微模具，卵巢体细胞可在1–3天内形成类器官。这些类器官可保留关键的卵巢细胞群体，包括成纤维细胞、巨噬细胞和类固醇生成细胞，并可在高存活率条件下培养长达3周。卵巢体细胞类器官适用于转录组学和组织学评估、条件培养基分析、与其他细胞类型的共培养以及化合物筛选。总体而言，这些类器官是一种可靠的模型 体外 卵巢体细胞区室的检测与调控，可应用于卵巢发育、衰老、生理及病理学研究。

方案

本方案中使用动物的操作均遵循西北大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）以及美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》的规定（西北大学动物福利保证编号：A3283-01；IACUC 方案编号：IS00013082_IM12）。所有材料（包括用于琼脂糖微模具的硅胶铸模、培养基及添加剂）的生产厂家信息和目录编号均列于材料表中。图1概述了本方案的操作步骤。所有操作步骤均应佩戴适当的个人防护装备，并遵守各机构的生物安全与环境健康安全规定；除非另有说明，所有操作均应在II级生物安全柜内进行。

图1：小鼠卵巢体细胞分离、卵巢体细胞类器官生成及下游应用示意图。 分离小鼠卵巢并富集间质组分。通过酶消化和机械方法消化富集后的间质组分，过滤去除未消化的组织。细胞经离心、洗涤、计数后接种于二维培养体系中。为生成类器官，细胞在二维培养过夜后，用胰蛋白酶消化收集，并进行离心、洗涤和计数。随后将细胞接种至琼脂糖微模具中进行类器官培养。类器官可用于组织学分析、RNA/蛋白质提取、条件培养基分析、药物处理与筛选，以及共培养实验。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 卵巢体细胞分离与培养用培养基的制备

注意：卵巢组织的消化以及随后的原代体细胞分离与培养需要四种培养基：解剖用培养基（DM；用于第2.3–2.4步中小鼠卵巢的解剖和穿刺）、酶解培养基（EM；用于第2.5–2.8步中富含基质的小鼠卵巢的酶消化）、终止反应培养基（QM；用于第2.9步以减缓酶消化过程）以及接种培养基（PM；用于第2.11–2.14步和第4.6步中原代卵巢体细胞的洗涤、接种和二维培养，以及在从二维培养中收获细胞时灭活胰蛋白酶）。所有培养基均应在无菌的II级生物安全柜或层流罩中配制。以下列出的培养基配方适用于处理5–6只小鼠的卵巢，可根据需要按比例调整。所有培养基可提前一周配制，并于4 °C保存，但EM中的酶必须在细胞分离当天新鲜加入。

1. 在 Leibovitz's L-15 培养基中制备含 1% 胎牛血清（FBS）和 0.5% 青霉素-链霉素（PS）的 DM（15 mL）。使用无菌滤器对培养基进行灭菌。
   注：DM 经缓冲以适应常温空气交换，用于从周围组织中显微解剖卵巢，以及富集基质组分。
2. 在 αMEM 中制备含 1% FBS 和 0.5% PS 的 EM（10 mL）。加入 82 酶活性单位/mL 的 IV 型胶原酶和 0.2 mg/mL 的 DNase I（≥400 酶活性单位/mg）。通过倒置混匀使酶充分溶解，然后使用无菌滤器对培养基进行灭菌。
   注：酶解培养基经碳酸氢钠缓冲，适用于 5% CO₂ 条件下的气体交换，用于卵巢组织块的酶消化。
3. 在 αMEM 培养基中制备含 10% FBS 和 0.5% PS 的 QM（20 mL）。使用无菌滤器对培养基进行灭菌。
   注：QM 经碳酸氢钠缓冲，适用于 5% CO₂ 条件下的气体交换，用于终止酶消化反应。
4. 在 RPMI 1640 培养基（含 25 mM HEPES 和 2 mM L-谷氨酰胺）中制备含 10% FBS 和 1% PS 的 PM（30 mL）。使用无菌滤器对培养基进行灭菌。
   注：PM 经碳酸氢钠缓冲，适用于 5% CO₂ 条件下的气体交换，用于原代卵巢体细胞的接种及二维培养。

2. 卵巢组织的消化及原代体细胞的分离

注意：通过酶消化和机械消化相结合的方法分离小鼠卵巢，以获取原代体细胞。来自5–6只小鼠的卵巢可同时在同一培养皿中处理。以下步骤应采用无菌技术操作，最好在层流罩内的解剖显微镜下进行。

1. 分别向三个100 mm培养皿中加入10 mL EM、20 mL QM和20 mL PM。使用前，将培养皿置于组织培养箱（加湿环境，37 °C，含5% CO₂）中至少平衡1小时。
2. 使用前，将DM在水浴中预热至37 °C。
3. 将小鼠卵巢解剖至含有3 mL DM的35 mm培养皿中。使用尖头镊子和/或显微剪刀分离附着的脂肪组织、输卵管和卵巢囊（图2Ai,ii）。必要时使用解剖显微镜进行显微解剖。
4. 将解剖后的卵巢转移至含有2–3 mL DM的45 mm表面皿中。在解剖显微镜下，分别用非优势手和优势手持28 G胰岛素针头固定并穿刺卵巢各个区域，持续约10分钟。频繁旋转卵巢组织，确保所有区域均被破坏。
   注意：穿刺卵巢可通过释放前窦状卵泡以及窦状卵泡中的卵丘-卵母细胞复合物和颗粒细胞，从而富集基质组分（图2Aiii–iv）。
5. 使用尖头镊子将富集基质的小鼠卵巢转移至含有平衡好的EM的培养皿中（图2Bi）。
6. 操作需迅速，以尽量减少培养基温度和pH的变化，用尖头镊子将富集基质的卵巢撕成约2–3 mm大小的组织块（图2Bii）。
7. 将培养皿倾斜放置，使用设置为1 mL的p1000移液器反复吹打含有卵巢组织块的EM，吹打100次或持续3分钟，以先完成者为准（图2Biii）。必要时轻轻晃动培养皿，确保所有组织块均被吹打。
   注意：若组织过大，无法用p1000吸头吹打，可用无菌手术刀剪去吸头尖端以扩大开口。孔径应足够宽，使大多数（>50%）但并非全部组织块能够进入，从而产生剪切效应。
8. 将含有EM和卵巢组织块的培养皿转移至组织培养箱（加湿环境，37 °C，含5% CO₂）中，总共孵育30分钟，在15分钟时取出培养皿并重复吹打（100次或3分钟），30分钟孵育结束时再次重复吹打（图2Biii）。
   注意：经过前15分钟孵育后，组织块应已被消化至足够程度，使>80%的组织块无需扩大吸头开口即可通过p1000吸头。消化总时长及所需吹打次数取决于撕碎后组织块的初始大小。此外，小鼠的年龄和品系、酶活性的批间差异以及移液器孔径大小均可能影响组织解离速率。当卵巢组织块被分解为肉眼仍可见的约1 mm大小的碎片时，应终止消化（图2Biv）。过度消化可能导致细胞丢失和细胞活力下降。
9. 通过加入20 mL预平衡的QM稀释酶液，以减缓组织消化过程（图2Ci）。
10. 将细胞悬液通过置于50 mL锥形管上的40 µm细胞滤网，以去除未消化的组织块（图2Cii）。在室温下以300 × g离心5分钟，收集细胞沉淀（图2Ciii）。
11. 通过吸弃上清液洗涤细胞，将细胞沉淀重悬于1 mL预平衡的PM中，将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管，室温下以300 × g离心5分钟，再次收集细胞沉淀（图2Civ）。
12. 吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL PM中，取10 µL细胞悬液用台盼蓝染色以评估细胞活力，并使用血细胞计数板计数细胞。
    注意：有关此分离方案阶段预期获得的原代卵巢体细胞数量（取决于小鼠品系和年龄），请参见表1。此阶段细胞活力应>80%。
13. 将细胞以约1.25 × 10⁵–1.5 × 10⁵/cm²的密度接种于组织培养处理过的培养容器中（例如，若细胞数约为3 × 10⁶，则接种于组织培养处理的60 mm培养皿；若细胞数约为1 × 10⁶，则接种于组织培养处理的6孔板中的一个孔）。
    1. 根据培养皿或孔板的总体积添加适量PM（例如，使用60 mm培养皿时额外添加4 mL PM，使用6孔板的一个孔时额外添加2 mL PM）。
       注意：上述接种密度适用于细胞经一夜二维培养后用于类器官生成的情况。若需更长时间的二维培养，可采用较低密度接种。未平衡的额外培养基可于4 °C保存最多1周。PM既用于类器官生成，也用于维持卵巢体细胞的二维培养。在此步骤后，卵巢体细胞可继续进行二维单层培养（步骤2.14），或用于生成类器官（进入第3节）。在类器官生成前进行一夜二维培养，有助于清除可能通过40 µm细胞滤网的早期卵泡中的卵母细胞。
14. 接种过夜（至少16小时）后，用磷酸盐缓冲液（PBS；无Mg/Ca，pH 7.0–7.3）洗涤细胞，以去除死细胞和碎片（图3A）。洗涤后加入新鲜PM，并在培养期间每隔一天更换一次新鲜PM（图3B）。
    注意：尽管分离后细胞活力较高，但接种过夜后通常会观察到总细胞数量显著减少，这可能是由于细胞死亡或无法贴附于组织培养容器所致（图3A）。

图2：小鼠卵巢体细胞分离的示意图。（A）（i,ii）小鼠卵巢解剖和（iii,iv）间质富集的代表性图像。Ai 中的虚线标出了小鼠卵巢的轮廓。（B）在机械和酶消化过程中不同阶段的卵巢组织碎片的代表性图像。（i）间质富集后的卵巢组织在撕碎前和（ii）撕碎后的状态，（iii）移液过程中的卵巢组织碎片，以及（iv）消化完成后的卵巢组织碎片。（C）（i）终止消化反应、（ii）过滤细胞悬液、（iii,iv）离心收集原代小鼠卵巢体细胞的代表性图像。Cii 和 Ciii 插图分别显示了细胞滤器截留的未消化组织碎片以及离心后形成的细胞沉淀。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：原代卵巢体细胞可在二维条件下培养。（A）原代卵巢体细胞接种于60 mm培养皿中，接种后16小时在PBS洗涤前后的代表性透射光图像。（B）原代卵巢体细胞在24孔板中培养3天的代表性透射光图像。比例尺 = 400 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 类器官生成与培养用琼脂糖微模具及培养基的制备

注意：卵巢体细胞类器官在无支架的琼脂糖微模具中生成并培养，使用卵巢类器官培养基。琼脂糖微模具和卵巢类器官培养基应在无菌条件下，于经灭菌的II级生物安全柜或层流罩中制备。

1. 琼脂糖微模具的制备
   1. 将微模具用硅胶模具和格拉费镊子放入灭菌袋中，使用干循环进行高压灭菌（夹套压力：20 psi，腔体温度：250 °F（121.11 °C），灭菌时间：15 分钟）。
      注意：可同时对多个硅胶模具进行高压灭菌，以便快速制备大量琼脂糖微模具。
   2. 向24孔细胞培养板的每孔中加入1 mL含1% PS的PBS，用于储存琼脂糖微模具。
   3. 将1.5%（w/v）无菌琼脂糖溶于PBS中，可通过微波炉加热、水浴或加热板溶解。
      注意：将50 mL锥形管置于盛有水的100 mL烧杯中进行微波加热，可有效溶解琼脂糖（图4Ai）。此方法不仅可控制沸腾过程，烧杯中的热水浴还能延缓琼脂糖的再凝固。
   4. 让液态琼脂糖冷却至约50 °C，直至可安全用手操作。
   5. 缓慢吸取300–350 µL的1.5%琼脂糖溶液注入硅胶模具中，注意避免过度填充或填充不足，并防止产生气泡（图4Aii）。确保琼脂糖在模具顶部形成平整的表面，而非凹面或凸面（图4Aiii,iv）。在琼脂糖开始凝固前，使用无菌P10移液枪头刺破气泡（图4Bi–iii）。
   6. 在室温下静置2–3分钟，使琼脂糖在硅胶模具中完全凝固（图4Biv）。
   7. 凝固后，将硅胶模具倒置于含有PBS + 1% PS的24孔细胞培养板的孔上方，轻轻弯曲硅胶以释放琼脂糖微模具至孔中（图4Ci）。
      注意：用封口膜包裹后的24孔细胞培养板中，琼脂糖微模具可在PBS + 1% PS中于4 °C保存长达1个月（图4Cii）。建议至少在使用前16小时制备琼脂糖微模具，因为刚制备并浸入PBS + 1% PS后，微孔中常含有气泡（图4Ciii）。然而，这些气泡在储存过程中会逐渐消散（图4Civ）。在用于类器官培养前，应于显微镜下仔细检查琼脂糖微孔插入物，确认微孔在制备过程中未发生融合或破损（图4Di–iv）。不建议使用有缺陷的微模具进行类器官的生成与培养。建议额外多制备部分琼脂糖微模具，以弥补约25%可能存在缺陷的样品。
2. 卵巢类器官培养基的制备
   1. 在生物安全柜中，根据制造商说明，向基础培养基中加入类器官生长培养基（小鼠）添加剂1和2以及1% PS。配制好的卵巢类器官培养基可在4 °C保存最多2周。
      注意：添加剂1和2可分装后于-20 °C保存。

图 4：琼脂糖微模具制备示意图。 （A）（i）1.5% 琼脂糖制备、（ii）移液至硅胶模具中、（iii）正确填充以及（iv）过度填充的硅胶模具的代表性图像。Aiii 和 Aiv 中的虚线分别表示琼脂糖微模具的平坦和凸起底部。（B）（i,ii）填充后琼脂糖中存在气泡的硅胶模具、（iii）在琼脂糖凝固前用移液枪头刺破气泡、以及（iv）在硅胶模具内已凝固的琼脂糖微模具的代表性图像。（C）（i）将凝固的琼脂糖微模具从硅胶模具中取出、（ii）将琼脂糖微模具储存在含有 PBS + 1% PS 的 24 孔板中、（iii）浇铸后微孔中立即出现的气泡、以及（iv）储存 16 小时后无气泡且正确成型的琼脂糖微模具的代表性图像。（D）微模具存在（i,ii）合并孔、（iii）破损孔或（iv）损伤的代表性图像。缩写：PBS = 磷酸盐缓冲盐水；PS = 青霉素-链霉素。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 类器官的生成与培养

注意：经过一夜的二维培养后，从二维培养物中收获原代卵巢体细胞，并将其接种至琼脂糖微模具中以生成类器官。以下步骤应在经过灭菌的II级生物安全柜中，采用无菌技术进行操作。

1. 将 PM 和类器官培养基在水浴中预热至 37 °C，并将 0.05% 胰蛋白酶预热至室温。
2. 使用格拉费镊子，小心地将微模具转移至新的 24 孔板的孔中（图 5Ai）。
3. 向含有琼脂糖微模具的 24 孔板各孔中加入 500 µL 卵巢类器官培养基（图 5Aii）。确保微模具完全浸没在培养基中，并将微模具和培养基置于培养箱中（湿润环境，37 °C，5% CO₂）至少平衡 30 分钟。
4. 通过抽吸去除贴壁型卵巢体细胞上的 PM，并用无 Mg/Ca 的 PBS 洗涤细胞。
5. 加入 0.05% 胰蛋白酶（6 孔板或 60 mm 培养皿使用 1–2 mL 胰蛋白酶）以从二维培养中收获细胞。将细胞在培养箱中于 37 °C 下与胰蛋白酶孵育 2–3 分钟。
6. 在显微镜下确认细胞已脱落，并通过加入相当于所用胰蛋白酶体积两倍的预热 PM 来终止胰蛋白酶反应。
7. 将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
8. 用 1 mL 预热的 PM 重悬细胞，取部分细胞与台盼蓝染色以评估细胞活力，并使用血细胞计数板计数细胞。
   注：根据小鼠品系和年龄的不同，过夜二维培养及后续胰蛋白酶消化后预期的原代卵巢体细胞数量见表 1。胰蛋白酶消化后细胞的活力通常高于 90%。
9. 离心（室温下 300 × g，5 分钟）收集细胞沉淀，并用卵巢类器官培养基重悬细胞沉淀，使细胞密度为每 1 mL 培养基含 3.33 × 10⁶ 个活细胞，即每 75 µL 培养基含 2.5 × 10⁵ 个活细胞。
   注： 此处每个琼脂糖微模具接种 2.5 × 10⁵ 个细胞。因此，可制备的微模具总数取决于总细胞数。每个琼脂糖微模具中可接种少于 2.5 × 10⁵ 个细胞来生成类器官，但类器官的大小、聚集动力学、相对细胞组成以及功能（包括激素分泌）可能会受到影响。
10. 从培养箱中取出已平衡的琼脂糖微模具，确保微模具方向正确，使细胞接种室朝上，并从细胞接种室中移除卵巢类器官培养基（图 5Aiii）。
    1. 使用格拉费镊子提起并倾斜微模具，或使用移液器，从微模具的细胞接种室中移除培养基。若采用移液方式去除接种室中的培养基，应将移液器吸头轻轻悬于细胞接种室角落上方吸取液体。避免直接接触琼脂糖微模具，以防破坏微孔。
       注：细胞接种室应尽可能干燥，使微孔肉眼可见，但微模具外部仍需被卵巢类器官培养基包围（图 5Aiii）。
11. 将 75 µL 细胞悬液（即 2.5 × 10⁵ 个细胞）直接加入每个琼脂糖微模具的细胞接种室中，避免产生气泡（图 5Bi）。将 24 孔板放回培养箱。
12. 细胞接种后 1 至 2 小时，向琼脂糖微模具外部小心添加额外的 250 µL 预热卵巢类器官培养基，注意不要扰动细胞接种室（图 5Bii）。
    ​注：原代卵巢体细胞应在接种后 1–24 小时内在琼脂糖微模具中开始聚集（图 5Biii）。
13. 细胞接种次日，将琼脂糖微模具周围的培养基更换为 750 µL 新鲜卵巢类器官培养基，之后每隔一天更换一次培养基。
    1. 更换培养基时，将培养板倾斜一定角度，以去除琼脂糖微模具周围的废液。不要从细胞接种室中移除培养基。轻轻将新鲜培养基沿孔壁加入，避免扰动细胞接种室。
       注：更换下来的条件培养基可保存并在 -80 °C 冻存，用于分析类器官分泌因子。一旦类器官形成（细胞接种后 1–3 天），可将培养基更换为含有重组蛋白、抑制剂等的培养基，以研究不同处理对类器官功能的影响，或用于化合物筛选。

图 5：卵巢体细胞类器官生成示意图。 （A）（i）使用格拉夫镊子将琼脂糖微模具转移至培养板，（ii）琼脂糖微模具在卵巢类器官培养基中平衡，以及（iii）从细胞接种腔室中移除培养基的代表性图像。图 Aiii 中箭头指示为空的细胞接种腔室。（B）（i,ii）将细胞接种至琼脂糖微模具中，以及（iii）含有聚集态卵巢体细胞的琼脂糖微模具的透射光扫描图像。比例尺（Biii）：2500 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

5. 类器官在下游应用中的利用

注意：类器官可用于多种下游应用，包括组织学、分子生物学应用（例如 RNA/蛋白质分析）、条件培养基分析以及共培养。

1. 组织学
   注意：类器官无需从琼脂糖微模具中取出，即可直接进行组织学终点检测。事实上，琼脂糖微模具中的类器官作用类似于组织微阵列，因而可同时对多个间距一致的类器官进行高通量组织学分析。
   1. 将1.5%（w/v）无菌琼脂糖溶于PBS中，煮沸溶解。
   2. 培养卵巢体细胞类器官后，将培养板倾斜，移除琼脂糖微模具周围的培养基。
   3. 在解剖显微镜下，将移液器吸头轻轻悬于每个细胞接种腔的角落上方，小心吸取培养基，注意不要扰动类器官或破坏微模具本身，从而移除细胞接种腔中的培养基。
   4. 小心吸取100–125 µL已冷却至约50 °C的1.5%琼脂糖溶液，加入每个细胞接种室的角落，以填充并密封细胞接种室，注意避免扰动类器官图6Ai).
   5. 在室温下静置 2–3 分钟，使琼脂糖凝固。
   6. 向每个孔中加入750 µL改良型Davidson's液或4%多聚甲醛，在4 °C下对密封琼脂糖微模具中的类器官固定过夜。
   7. 固定后，去除固定剂，并用70%乙醇洗涤琼脂糖微模具。
      注意：琼脂糖微模具可在 70% 乙醇中 4 °C 保存，直至进行组织处理（脱水、透明和石蜡浸润）。在组织处理过程中，需始终注意琼脂糖微模具的方向。
   8. 组织处理后，将琼脂糖微模具包埋于石蜡中，确保微模具在石蜡块内保持平整，且微模具底部最先被切片。图6Aii).
   9. 将石蜡包埋块切片至5 µm厚度，并将组织切片置于带电荷的显微镜载玻片上。
      注意：在切片过程中，无论是组织切片还是石蜡包埋块，均可通过肉眼观察到微孔的存在。图6Aiii, iv) 可通过显微镜观察切片样本，确认类器官是否存在于微模具切片中。图6Av). 不要将2–3个连续切片置于同一张载玻片上，而应将每间隔50 µm（即每隔10个）的2–3个切片置于同一张载玻片上^th 将多个类器官切片置于同一张载玻片上，可提高每个载玻片上至少有一个切片代表大多数类器官的概率。类器官在组织切片中保持一致的间距，有利于组织学染色后的成像操作。图6Avi).
   10. 将载玻片置于37 °C烘箱中过夜干燥。
   11. 继续进行组织学或免疫组织化学染色，或将切片在室温下保存¹⁹.
2. 用于分子应用的类器官收获
   注意：培养后，类器官可从琼脂糖微模具中取出，并用于多种下游分子生物学实验，包括提取RNA或蛋白质以检测基因或蛋白质表达。
   1. 将含有琼脂糖微模具的培养板倾斜一定角度，用移液器吸除琼脂糖微模具周围的培养基。
   2. 向含有琼脂糖微模具的孔中加入 750 µL 室温 PBS。
   3. 使用格雷夫镊子翻转并搅动琼脂糖微模具，使类器官释放到周围的 PBS 中。在显微镜下确认类器官已从琼脂糖微模具中完全释放。
   4. 使用格雷费镊子移除空的琼脂糖微模具，用移液器将含有类器官的PBS转移至微量离心管中。
   5. 通过在 10,000 × g 条件下离心收集类器官 g 室温下孵育5分钟。
   6. 吸去上清液，随后进行RNA或蛋白质提取。或者，将细胞沉淀快速冷冻，并于-80 °C保存。¹⁹.
3. 保存类器官条件培养基用于分析
   注意：类器官培养过程中产生的条件培养基可全程保存，用于分析类器官分泌的因子，包括激素、细胞因子和生长因子。类器官条件培养基中细胞因子分析的代表性结果如下所示。 图7A.
   1. 将含有琼脂糖微模具的培养板倾斜一定角度，用移液器吸去微模具周围的条件培养基。注意不要吸走细胞接种腔室中的培养基，以免扰动类器官。
   2. 将条件培养基转移至微量离心管中，进行培养基分析，或进行速冻后于 -80 °C 保存^19,22.
      注意：可选步骤，将条件培养基在 10,000 × g 离心5分钟以沉淀死细胞或碎片。在进行培养基分析或储存前，将上清液转移至新的微量离心管中。
4. 类器官共培养
   注意：可通过多种方法将卵巢体细胞类器官与其他细胞和组织进行共培养。图中展示了分别采用5.4.1和5.4.3步骤所述方法，将类器官与卵巢癌细胞及卵泡共培养的代表性结果。 图7B, C.
   1. 使用原代小鼠卵巢体细胞与其他细胞类型组合生成类器官，以研究直接细胞间相互作用的影响，请遵循步骤 5.4.1.1–5.4.1.4。
      1. 按照步骤4.1–4.9操作，对经二维培养过夜的原代卵巢体细胞进行洗涤，使用0.05%胰蛋白酶从二维培养中收获细胞，离心成团，计数，并以2.5 × 10⁵个细胞/mL的密度重悬于卵巢类器官培养基中⁵ 每75 µL培养基中的活细胞数
      2. 如果另一种目标细胞为贴壁细胞，需从二维培养物中收集细胞。计数后，通过离心形成细胞沉淀，并以2.5 × 10⁶ 个/mL的密度重悬于卵巢类器官培养基中。⁵ 每75 µL培养基中的活细胞数
      3. 将初级卵巢体细胞悬液与另一种目标细胞悬液按已知比例混合。
      4. 按照步骤 4.10–4.13，将所得的细胞悬液接种至琼脂糖微模具中，并培养类器官。
   2. 将含有已形成类器官的琼脂糖微模具转移至含有其他细胞或类器官的24孔板中，请遵循步骤5.4.2.1–5.4.2.4。
      注意：为了评估类器官分泌因子对其他细胞类型的影响，反之亦然，可将已形成的类器官保留在琼脂糖微模具中，并将整个琼脂糖微模具转移至含有其他细胞或类器官的24孔板中。当卵巢类器官培养基可用于同时培养两种细胞/组织类型时，可采用此类共培养方法。
      1. 将卵巢类器官培养基在水浴中预热至 37 °C。
      2. 将含有琼脂糖微模具的培养板倾斜，用移液器吸除琼脂糖微模具周围的培养基。
      3. 使用格雷夫镊子，将微模具小心转移至含有其他细胞或类器官的24孔板中。
      4. 向琼脂糖微模具周围加入 750 µL 新鲜的卵巢类器官培养基。
   3. 为将已形成的类器官从琼脂糖微模具中取出并转移至新的琼脂糖微模具中，请执行步骤 5.4.3.1–5.4.3.13。
      注意：如果卵巢类器官培养基并非共培养实验所需的培养基，则步骤5.4.2中所述方法会面临明显的培养基残留问题，因为琼脂糖微模具已饱和浸透卵巢类器官培养基。为避免培养基残留，可在初次接种细胞后1–3天将已形成的类器官从原有琼脂糖微模具中转移至新的琼脂糖微模具中，用于后续培养或共培养。
      1. 将共培养所需的培养基在水浴中预热至 37 °C。
         注意：已成功使用DMEM、αMEM和基于F12的培养基进行卵巢体细胞类器官的共培养实验。
      2. 使用格拉费镊子，将新的琼脂糖微模具从含1%青链霉素的磷酸盐缓冲液中小心转移至24孔板的孔内，与其它细胞或类器官共培养。
      3. 确保微模具完全浸没在培养基中，根据需要添加共培养的相应培养基，并将微模具和培养基置于培养箱中（湿润环境，37 °C，5% CO₂）至少平衡30分钟。₂).
      4. 将含有已形成类器官的琼脂糖微模具的培养板倾斜，用移液器吸除琼脂糖微模具周围的培养基。
      5. 在含有已形成类器官的琼脂糖微模具周围加入所需的共培养培养基。
      6. 使用格雷费镊子翻转并搅动琼脂糖微模具，以将类器官释放到周围培养基中。在显微镜下确认类器官已从琼脂糖微模具中释放。
         注意：如果原代卵巢体细胞未能充分聚集，类器官在从琼脂糖微模具中取出时可能无法保持完整。类器官的组装可能需要1–3天，具体时间取决于分离卵巢体细胞所用小鼠的品系和年龄。
      7. 使用格雷费镊子移除空的琼脂糖微模具，并用移液器将含有类器官的培养基转移至微量离心管中。
      8. 将类器官在 300 × g 条件下离心 g 室温下孵育5分钟。
      9. 在解剖显微镜下，用移液器吸除上清液，保留含有类器官的50–75 µL培养基。
      10. 从培养箱中取出已平衡的微型模具，并确保微型模具的方向为细胞接种室朝上。
      11. 使用格雷夫镊子或移液器从细胞接种室中移除培养基。
          注意：每个孔中的培养基体积不应超过 500 µL，以确保微模具的细胞接种室能够排空。
      12. 用移液枪将类器官直接转移至每个新琼脂糖微模具的细胞接种室中。将24孔板放回培养箱。
      13. 孵育1–2小时后，在琼脂糖微模具外周加入额外的250 µL所需培养基，注意不要扰动细胞接种室。

图6：关键的卵巢细胞类型在卵巢体细胞类器官中得以保留。（A）（i）培养结束时用琼脂糖密封微模具，（ii）未切割的微模具，以及（iii）包埋于石蜡块中的切片微模具的代表性图像。微孔可在（iv）贴片切片中观察到，且在（vi）组织学染色前，可通过显微镜（v）确认切片微模具中类器官的存在。（B）小鼠卵巢组织切片与卵巢体细胞类器官切片经波形蛋白（Vimentin）、F4/80、Foxl2 和 3β-HSD 抗体免疫组织化学染色后的代表性图像。比例尺 = 20 µm。缩写：H&E = 苏木精-伊红染色。本图经 Dipali 等人许可改编。¹⁹ 请点击此处查看本图的放大版本。

图7：卵巢体细胞类器官与卵泡及卵巢癌细胞的共培养。（A）在培养第5天测定每个琼脂糖微模具中类器官的细胞因子分泌量，并以无类器官的琼脂糖微模具条件培养基作为归一化对照。N = 4 个琼脂糖微模具。（B）在有或无（对照）类器官条件下，培养第0、4和8天卵巢卵泡的代表性透射光图像，以及（i）共培养模式的示意图。比例尺 = 400 µm。（ii）卵泡存活率和（iii）在8天培养期间生长情况的定量分析，有或无（对照）类器官。数据以均值 ± 标准差表示。部分误差线过小而无法显示。每组 N = 56 个卵泡。**P < 0.01。（C）在培养第1、3和5天，以10:1比例将原代卵巢体细胞与表达红色荧光蛋白的卵巢癌细胞（OVCAR8-RFP）在类器官中共同培养的代表性透射光（上图）和荧光图像（下图）。比例尺 = 400 µm。缩写：RFP = 红色荧光蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 故障排除提示

1. 问题1：分离得到的原代卵巢体细胞数量低于预期。
   ​注意：如果酶消化后卵巢组织碎片持续小于1 mm或肉眼不可见，则可能因消化过度导致细胞活力下降，从而使分离细胞数量偏低；如果酶消化后卵巢组织碎片大于1 mm，则可能因卵巢组织消化不充分而导致细胞产量低。
   1. 如果酶消化后卵巢组织碎片大于1 mm，请执行步骤6.1.1.1–6.1.1.2。
      1. 确认IV型胶原酶和DNase I在推荐保质期内，并未因储存不当或（对于DNase I）反复冻融而丧失酶活性。
      2. 增加对卵巢组织的反复吹打次数，若p1000吸头已被剪开以扩大孔径，则改用未剪开的吸头减小孔径，和/或延长在EM中的孵育时间。
   2. 如果酶消化后卵巢组织碎片持续明显小于1 mm，则减少对卵巢组织的反复吹打次数，通过剪开p1000吸头以增大孔径，和/或缩短在EM中的总孵育时间。
2. 问题2：超过约25%的制备琼脂糖微模具存在缺陷
   1. 确认硅胶模具无残留琼脂糖或碎屑。如有需要，用PBS清洗硅胶模具，并通过高压灭菌重新灭菌。如有需要，重新加热用于浇铸的1%琼脂糖溶液，因为正在凝固的琼脂糖可能无法均匀填充硅胶模具和/或产生气泡。
   2. 将琼脂糖注入硅胶模具后，应让其完全凝固，过早取出琼脂糖微模具可能导致微孔结构破坏。
   3. 确认硅胶模具未填充不足，因为填充不足会降低琼脂糖微模具的结构完整性，在弯曲硅胶以脱模时易造成损伤。
   4. 此外，硅胶模具制造商建议其高压灭菌次数不超过12次。若硅胶模具已过度灭菌，请更换新模具。
3. 问题3：超过10%的微孔中类器官未能形成
   1. 确认在浇铸琼脂糖微模具时硅胶模具未过度填充，因为过度填充会导致细胞在微孔中分布不均，使中央微孔的细胞分布优于外围微孔。
   2. 向琼脂糖微模具的细胞接种室加样细胞悬液时应避免产生气泡，因为气泡会干扰细胞进入微孔的分布。
   3. 如有需要，可每微模具使用超过75 µL细胞悬液（细胞密度为每1 mL含3.33 × 10⁶个活细胞），以确保移液吸头内液体体积充足，避免因体积不足而产生气泡。
   4. 延长细胞接种与向琼脂糖微模具外部添加卵巢类器官培养基之间的时间间隔，以确保细胞有足够时间沉降至微孔中。

结果

为了确定卵巢体细胞类器官的细胞组成，我们在类器官培养6天后对其组织切片进行了免疫组织化学染色，所用抗体针对卵巢中的关键细胞类型。类器官中含有波形蛋白（vimentin）阳性的成纤维细胞、F4/80阳性的巨噬细胞，以及类固醇生成细胞群体（图6B）¹⁹。我们使用针对Foxl2的抗体标记颗粒细胞和颗粒黄素细胞，同时使用针对3β-HSD的抗体标记膜细胞、膜黄素细胞以及类固醇生成性成纤维细胞。卵巢体细胞类器官中同时存在Foxl2阳性和3β-HSD阳性的细胞（图6B）¹⁹。有趣的是，F4/80阳性巨噬细胞与3β-HSD阳性类固醇生成细胞呈现出明显不同的空间分布模式：巨噬细胞局限于类器官的边缘区域，而3β-HSD阳性类固醇生成细胞则在类器官核心区域持续减少（图6B）¹⁹。因此，在培养6天后，类器官仍维持了细胞异质性，并表现出某些细胞...

讨论

本文介绍了一种从富含基质的卵巢组织中分离原代小鼠卵巢体细胞的方法，该方法能够维持卵巢体细胞区室的异质性。原代小鼠卵巢体细胞可在二维单层培养体系中培养，也可用于通过无支架的琼脂糖微模具生成卵巢体细胞类器官。琼脂糖微模具包含96个用于类器官形成的微孔，可整体置于24孔板的一个孔内，因此是一种可高通量生成大量大小均一的类器官的方法。此外，琼脂糖微模具便于更换培养基、成像以及后续组织学应用。在细胞接种后1–3天内，卵巢体细胞可自组装形成类器官，且在培养6天期间，类器官可保留关键的卵巢细胞类型，包括成纤维细胞、巨噬细胞和类固醇生成细胞。细胞群体表现出明确的空间组织特征：F4/80阳性巨噬细胞和cleaved caspase-3阳性的凋亡细胞局限于类器官边缘，而3β-HSD阳性的类固醇生成细胞则持续从类器官核心区域耗竭¹⁹。类器官可分泌细胞因子以及细胞外基质蛋白，并可在高存活率下培养长达3周。这些模型可适用于多种研究用途，用于探究卵巢体细胞区室的生理功能与病理机制。

在本实验方案中，使用每孔琼脂糖微模具接种250,000个细胞的密度，并结合市售的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 μm，聚醚砜注射器滤器	康宁	431229
1.5 mL 微量离心管	MIDSCI	PR-MCT15
100 mL 玻璃烧杯	Fisherbrand	FB100100
100 mm 培养皿	康宁	351029
15 mL 一次性离心管	赛默飞世尔科技	339651
24孔板（TC处理）	康宁	353047
28号胰岛素注射针头	Exel International	26027
35 mm 培养皿	康宁	351008
3β-HSD 抗体	Cosmo Bio	K0607	1:1000
4% 多聚甲醛	电子显微镜科学公司	1574100
40 µm细胞滤筛	康宁	431750
45 mm 表面皿	电子显微镜科学公司	7054345
50 mL 离心管	赛默飞世尔科技	339652
60 mL 无菌注射器	Air-Tite	ML60
60 mm 细胞培养处理板	Corning	353037
6孔板（TC处理）	康宁	353046
琼脂糖	Hoefer	GR140-500	凝胶强度 >1200 g/cm2；凝胶温度 36 °C
高压灭菌袋	Fisherbrand	01-812-55
生物素标记的山羊抗小鼠IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
生物素标记的山羊抗兔IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
生物素标记的山羊抗大鼠IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
显蓝试剂	Fisherbrand	23-245681
带有摆动桶式转子的离心机，适用于50 mL锥形管	赛默飞世尔科技	Sorvall X1R Pro-MD
II 级生物安全柜	The Baker Company	SG403A
Cleaved Caspase-3（CC3）抗体	细胞信号技术公司	9579T	1:250
CO2培养箱	赛默飞世尔科技	Heracell VIOS 160i CO₂ 培养箱2 培养箱
胶原酶IV型，粉末状	Gibco，Fisher Scientific	17-104-019
C系列小鼠细胞因子抗体芯片3号试剂盒	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
显微解剖剪	World Precision Instruments	WPI-14003
解剖剪	World Precision Instruments	WPI-15922
解剖显微镜	徕卡	MZ9.5，S9系列
不含钙、镁的DPBS	Gibco，Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
伊红	Fisherbrand	23-314631
F4/80 抗体	伯乐（Bio-Rad）	MCA497G	1:50
胎牛血清，经认证，热灭活，美国	Gibco，赛默飞世尔科技	10082147
精细尖头解剖镊	世界精密仪器公司	WPI-14098
FOXL2 抗体	Abcam	ab246511	1:200
格劳费镊子	Fine Science Tools	1105010
苏木精	EK Industries	EKI 47971GL
血细胞计数板	MedOne	DHCN015
成像系统	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult 类器官生长培养基（小鼠）	STEMCELL Technologies	06005	基础培养基，补充剂1和2
层流罩	IVFtech	IVFtech 无菌工作站
Leibovitz L-15 培养基	Gibco，Fisher Scientific	11415114
显微镜载玻片	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D培养皿微模具球状体	Millipore Sigma	Z764043-6EA	用于琼脂糖微模具的硅胶铸型
改良大卫森固定液	电子显微镜科学公司	6413350
OVCAR8-RFP 细胞			乔安娜·伯迪特博士（Joanna Burdette PhD），芝加哥大学
青霉素-链霉素	Millipore Sigma	P4333-100ML
苦味酸-天狼星红染色液	StatLab	STPSRPT
RPMI 1640 培养基（ATCC 改良型）	Gibco，Fisher Scientific	A1049101
台式离心机	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
台盼蓝	赛默飞世尔科技	T10282
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红	Gibco，赛默飞世尔科技	25300054
波形蛋白抗体	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM，含GlutaMAX补充剂，无核苷	Gibco，Fisher Scientific	32561102