DNA损伤修复效率检测方法大致可分为三类：基于细胞的功能检测、 体外 生化检测和分子标志物检测。这些方法能够对多种DNA损伤修复通路的修复效率进行定性或定量评估。
综述文章
DNA损伤修复效率评估策略的研究进展
1Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 2School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 3Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 4Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University
* These authors contributed equally
在新标签页中打开
本文内容
摘要
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
摘要
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
细胞基因组DNA持续暴露于各种内源性和外源性因素，这些因素可引发多种形式的DNA损伤。在哺乳动物细胞中，每个细胞每天的DNA损伤负荷可能高达104–105个损伤位点。若DNA损伤持续存在并进入S期，则可能导致突变。当此类突变发生在原癌基因、肿瘤抑制基因或参与细胞增殖的基因中时，可能促进细胞转化和致癌过程。因此，DNA损伤修复在维持基因组稳定性及预防癌症发生中发挥着关键作用。评估DNA修复能力的最佳方法是检测DNA修复系统的功能活性。DNA损伤修复通路及其修复效率与化疗药物研发、基因功能验证以及癌症治疗密切相关。因此，对单个DNA损伤修复通路修复效率的研究具有重要的理论和实践意义。本文综述了主要的DNA损伤修复通路、用于评估修复效率的方法，以及这些方法的优势与局限性。
引言
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
DNA损伤修复系统是一种关键的细胞防御机制，通过降低突变频率和抑制癌变来维持基因组稳定性1。不同类型的DNA损伤通过不同但相互关联的修复通路进行修复2。例如，DNA复制过程中产生的碱基错配通过错配修复（MMR）得以纠正，而化学修饰的碱基（如烷基化碱基）则主要通过碱基切除修复（BER）进行修复3。紫外线（UV）诱导的6-4光产物以及某些化学物质引起的庞大核苷酸加合物则通过核苷酸切除修复（NER）被清除。链间交联（ICL）损伤通过与范可尼贫血通路相关的蛋白协同作用进行修复4。单链断裂（SSBs）通过单链断裂修复（SSBR）通路修复，而双链断裂（DSBs）则主要通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）进行修复。在大多数情况下，复杂的DNA损伤通过多种DNA修复通路之间的协调作用得以解决5。
对细胞中DNA损伤及修复效率的评估通常依赖于多种实验方法的结合，包括彗星实验、免疫荧光（IF）、蛋白质印迹（WB）、宿主细胞复活（HCR）以及基于质粒的修复检测。这些方法通过检测DNA链断裂、DNA损伤标志物以及修复相关蛋白的表达或定位来评估DNA损伤与修复过程6。然而，对细胞修复效率的准确定量通常需要基于动态挑战的实验方法。在这些方法中，研究人员通过实验手段诱导特定的DNA损伤，并在连续的时间点取样细胞，以监测损伤信号的形成与清除过程。通过比较不同时间点残余损伤水平与初始损伤负荷，可对修复动力学及修复通路的功能性进行定量评估。
为了系统比较目前可用的DNA损伤修复效率检测方法的特征与应用，本综述根据五个参数总结了主要的检测方法：损伤/底物特异性、分析分辨率、灵敏度、定量能力以及仪器要求（表1）。本综述旨在为在基础研究、转化研究和临床研究中选择合适的方法来研究DNA损伤修复通路提供实用的方法学指导。
| 检测方法 | 损伤/底物特异性 | 分析分辨率 | 灵敏度/检测阈值 | 定量与定性输出 | 仪器要求 |
| Western blot | CPDs、6-4PPs、修复蛋白（例如 MGMT、RAD51） | 群体水平 | 中等 | 半定量 | 蛋白质电泳、膜转移、化学发光成像系统 |
| 免疫荧光 | CPDs、DSB 焦点（例如 γ-H2AX、RAD51） | 单细胞水平 | 中等 | 半定量 | 荧光显微镜 |
| HPLC-MS/MS | CPDs、6-4PPs、氧化性和烷基化碱基损伤 | 群体水平/体外 | 极高 | 定量 | HPLC-MS/MS |
| MGMT 酶活性检测 | O⁶-meG 烷基化损伤 | 群体水平/体外 | 高 | 定量 | 微孔板读数仪 |
| 彗星实验 | SSBs、DSBs、氧化碱基（经 FPG/OGG 预处理） | 单细胞水平 | 高 | 定量 | 荧光显微镜/电泳系统 |
| 切口实验 | AP 位点、NER 切口、BER 切口 | 群体水平/体外 | 高 | 定量 | 凝胶成像、放射性标记/荧光检测 |
| 重建修复系统 | 位点特异性碱基损伤、AP 位点、链断裂 | 体外 | 高 | 定量 | 凝胶电泳、荧光/质谱检测 |
| 质粒为基础的修复实验 | 位点特异性损伤 | 群体水平 | 中等 | 定量 | 微孔板读数仪、流式细胞仪、菌落计数 |
| 报告基因实验 | 位点特异性损伤；BER、NER、HR、NHEJ、MMR | 群体水平 | 高 | 定量 | 微孔板读数仪、流式细胞仪、荧光显微镜 |
| HCR/FM-HCR | 紫外线损伤、铂类交联、位点特异性损伤 | 群体水平 | 高 | 定量 | 流式细胞仪、荧光/化学发光检测器 |
| RADD | 广谱DNA损伤 | 单细胞水平 | 极高 | 定量 | 单分子荧光显微镜 |
| qPCR | 紫外线损伤、链阻断性损伤 | 群体水平 | 中等 | 定量 | 实时定量PCR仪 |
| MSI检测 | 与MMR缺陷相关的微卫星不稳定性 | 群体水平 | 中等 | 定性 | PCR仪/毛细管电泳 |
| DR-GFP/EJ5-GFP | HR和NHEJ介导的DSB修复 | 群体水平 | 高 | 定量 | 流式细胞仪/荧光显微镜 |
| BLESS/BLISS | 全基因组DSB定位 | 单细胞水平 | 极高 | 定量 | 高通量测序仪 |
| iPOND | 复制叉处的DDR蛋白/TLS相关修复 | 复制叉/蛋白质组 | 高 | 半定量 | 质谱/测序平台 |
表1：检测DNA损伤修复效率方法的系统性比较。 对多种修复通路中常用DNA损伤修复效率评估方法的比较。该表格总结了每种检测方法在损伤位点或底物特异性、分析分辨率、灵敏度、定量能力以及仪器需求方面的特点，包括生化、分子和基于细胞的方法。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
综述与观点
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 直接修复（DR）
直接修复（DR）是最简单的DNA修复形式，指在不切除碱基或核苷酸的情况下直接恢复受损的DNA7。DR主要修复两类重要的DNA损伤。第一类是由紫外线（UV）辐射引起的环丁烷嘧啶二聚体（CPD）损伤。在许多生物体中，光裂合酶能够识别并结合嘧啶二聚体。在可见光照射下，光裂合酶被激活，直接逆转DNA损伤，随后从DNA分子上解离。这种光复活机制在植物和低等生物中尤为重要。然而，包括人类在内的胎盘类哺乳动物缺乏有功能的光裂合酶，因此无法进行光复活。因此，人类细胞中由紫外线引起的CPD损伤主要通过核苷酸切除修复（NER）途径进行修复8。
通过DR修复的第二种主要类型损伤是烷基化引起的碱基损伤。该修复过程由O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶（AGT）介导，也称为O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）。该酶将鸟嘌呤残基O6位上的烷基基团转移至自身，从而直接恢复受损的DNA碱基。
检测DR效率的方法
- 紫外（UV）辐射诱导的环丁烷嘧啶二聚体（CPD）损伤修复效率检测
- 检测环丁烷嘧啶二聚体（CPD）含量变化的蛋白质印迹（WB）实验
使用特异性针对环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）的抗体，研究人员可在紫外线照射后的不同时间点检测CPD丰度的变化，并根据残留损伤水平推断修复效率。较高的修复效率对应于CPD更快速的清除。基于Western blot（WB）的CPD检测是评估DNA修复活性的经典且有效的方法；然而，该方法存在若干局限性。首先，该检测反映的是细胞群体中损伤水平的平均值，因此缺乏单细胞分辨率。其次，更为重要的是，该方法无法区分不同的修复通路。由于人类细胞中的CPDs主要通过核苷酸切除修复（NER）途径进行修复，单独使用WB分析无法判断所观察到的修复活性反映的是光解酶介导的修复还是NER活性，除非提供额外的实验条件支持。 - 免疫荧光（IF）定位CPD焦点动态变化
经紫外线照射并接受光修复处理的细胞可使用针对环丁烷嘧啶二聚体（CPD）的特异性抗体进行染色，并通过荧光显微镜观察细胞核内CPD焦点的变化。对CPD焦点形成与清除的定量分析可用于在群体和单细胞水平上评估DNA修复能力。CPD焦点消失的速率直接反映修复效率。免疫荧光（IF）技术可实现单个细胞内修复动态过程的空间和时间可视化，并能够检测细胞间的异质性。然而，荧光信号易发生淬灭，且定量分析通常依赖人工计数，可能引入主观偏差。在缺乏光复活活性的哺乳动物细胞中，该方法主要反映核苷酸切除修复（NER）介导的修复效率。 - 高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS/MS）用于定量CPD分析
提取的DNA通过酶消化降解为核苷，随后利用高效液相色谱法（HPLC）将环丁烷嘧啶二聚体（CPD）与正常核苷分离。接着采用串联质谱法（MS/MS）进行定量分析。通过比较修复前后CPD的含量，确定修复效率9高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）具有极高的特异性和皮摩尔级的检测灵敏度；然而，该方法需要昂贵的仪器设备，样品前处理复杂，且无法反映完整细胞中原位的修复状态。在人源细胞样品中，所测得的修复结果主要反映的是核苷酸切除修复（NER）的活性。
- 检测环丁烷嘧啶二聚体（CPD）含量变化的蛋白质印迹（WB）实验
- 烷基化试剂诱导的DNA碱基损伤修复效率
- MGMT酶活性检测
通过检测MGMT活性，通常可评估烷化剂诱导的DNA损伤的修复效率10使用放射性标记的甲基化DNA底物来监测甲基从受损DNA向MGMT蛋白的转移，从而实现对修复效率的定量评估。 - 用于检测O的报告基因检测法6-meG 修复效率
含有O的报告质粒6甲基鸟嘌呤（O6-meG）损伤的构建可用于评估修复效率。所引入的损伤会抑制报告基因的表达，直至通过MGMT介导的修复恢复报告基因活性。随后通过检测报告基因的表达水平来定量修复效率。报告基因检测可在活细胞中直观且定量地评价修复活性。11然而，这些检测方法需要构建针对特定损伤的载体，并涉及相对较长的实验周期12.
- MGMT酶活性检测
- 链断裂检测后的损伤修复效率
- 彗星试验
彗星试验，又称单细胞凝胶电泳（SCGE），是一种在单细胞水平上检测DNA链断裂的敏感方法。在电泳过程中，受损的DNA片段会从细胞核中迁移出来，形成类似彗星的尾部，而完整的DNA则仍集中在核区内。通过荧光显微镜结合图像分析软件，可对彗星尾长、尾部DNA含量和尾矩等参数进行定量分析。这些指标可用于评估DNA链断裂的严重程度。通过比较DNA损伤诱导后立即获得的彗星图谱与修复后的图谱，可估算DNA修复效率13.
彗星试验具有多项优势，包括操作简便、成本相对较低、灵敏度高以及单细胞分辨率。对该方法的进一步改进已催生出酶修饰变体及基于彗星的 体外 DNA修复检测，可用于评估BER和NER活性。
- 彗星试验
2. 碱基切除修复（BER）
碱基切除修复（BER）是一种高度保守的DNA修复通路，主要清除由氧化、烷基化和脱氨作用产生的小碱基损伤14。BER在机制上与单链断裂修复（SSBR）存在显著重叠，某些SSBR事件被视为BER的延伸。根据修复片段的长度，BER可分为短片段BER（SP-BER）和长片段BER（LP-BER）。
碱基切除修复（BER）由DNA糖基化酶启动，这些酶可识别受损碱基并通过断裂碱基与脱氧核糖之间的N-糖苷键将其切除，从而产生无嘌呤/无嘧啶（AP）位点15。随后，AP内切酶1（APE1）在AP位点的5′侧切割DNA骨架，生成3′-OH和5′-脱氧核糖磷酸（dRP）末端。在短片段BER（SP-BER）过程中，dRP基团被去除，DNA聚合酶β（Polβ）填补单核苷酸缺口，最后由DNA连接酶III（LigIII）完成连接反应。
修复由烷基化引起的含有3′-封闭末端的单链断裂遵循类似的机制，但需要额外的末端加工步骤。首先，多核苷酸激酶3′-磷酸酶（PNKP）去除异常的3′末端，生成正确的3′-OH基团；随后，Polβ填补缺失的核苷酸，最后由LigIII连接切口以完成修复。
检测BER效率的方法
- 酶修饰的彗星实验
酶修饰彗星试验通过引入特异性DNA损伤修复酶，扩展了标准彗星试验的应用。这些酶可识别并切割受损的碱基，将原本无法检测的损伤转化为可检测的DNA链断裂。最终形成的彗星尾部强度反映了DNA损伤的程度 关键词：酶修饰彗星试验，彗星试验，DNA损伤，修复酶，链断裂，尾部强度16˒17.
为评估碱基切除修复（BER）效率，可使用甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶（FPG）或其哺乳动物同源物8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶（OGG1）将氧化碱基损伤转化为单链断裂，随后通过彗星实验进行分析18. - 切口实验
切口实验是一种核心方法 体外 一种用于评估碱基切除修复（BER）活性的方法。将含有脱嘌呤/脱嘧啶（AP）位点的DNA底物与纯化的酶或细胞提取物共同孵育，定量检测被切割的DNA底物比例。该检测方法可直接反映APE1介导的切口活性，具有高特异性和高灵敏度，同时最大限度减少细胞内环境的干扰19.
然而，切口检测法并不能完全再现活细胞中碱基切除修复（BER）的活性，因为它无法评估整个修复过程的动态调控，包括损伤识别、碱基切除、AP位点切割、DNA合成和连接等步骤。20. - 重建的修复系统
重建的修复系统是一种 体外 利用纯化的修复蛋白重建DNA修复通路的实验平台。该系统可对单个修复蛋白的分子功能及相互作用进行详细分析，广泛应用于机制研究和药物筛选。
为评估碱基切除修复（BER）效率，将纯化的糖基化酶、AP 内切酶、DNA 聚合酶和连接酶依次与损伤的 DNA 底物共同孵育，以重建损伤识别、切除、合成和连接过程。修复产物通过凝胶电泳、荧光标记或质谱分析进行检测。21尽管这种方法能够实现高度可控的机制性研究，但它未考虑染色质结构或修复活性的全局细胞调控22. - 基于质粒的修复检测
基于质粒的修复检测涉及将含有特定DNA损伤的质粒导入宿主细胞，或与含有修复酶的细胞提取物共同孵育，随后通过报告基因检测、流式细胞术或克隆形成分析评估修复效率23.
为评估碱基切除修复（BER）效率，将含有氧化性DNA损伤的质粒与细胞提取物共同孵育，随后转化至DNA修复缺陷型细菌菌株中，例如 大肠杆菌然后根据菌落形成率估算修复效率。 - 报告基因检测
报告基因检测通过测量报告基因表达的恢复情况，间接评估DNA修复效率或基因调控活性24在这些检测中，将DNA损伤或调控元件整合到报告基因载体中，通过修复后报告基因活性的变化来量化修复效率。
在BER分析中，可将8-oxoG损伤引入荧光素酶报告基因的编码区。若该损伤未被修复，翻译过程将受阻；若修复成功，则恢复全长报告蛋白的表达。通常使用未受损质粒（如pRL-TK海肾荧光素酶载体）作为内参对照。 - 宿主细胞修复（HCR）
宿主细胞修复（HCR）是一种经典实验方法，通过检测宿主细胞恢复受损报告质粒表达的能力，间接评估DNA修复效率25携带特定损伤（如紫外线诱导的嘧啶二聚体或化学诱导的交联）的质粒被转染入宿主细胞。通过检测报告基因的表达水平来定量修复效率。
HCR 检测具有高灵敏度，可评估针对特定类型损伤的修复活性。然而，该方法需要高效的转染以及高质量的损伤质粒制备。传统 HCR 的主要局限性在于，使用 DNA 损伤试剂处理质粒时，通常会在整个质粒中产生异质性的损伤位点群体，从而增加机制性解释的复杂性26.
为解决这些局限性，已开发出基于流式细胞术的宿主细胞修复（FM-HCR）检测方法，该方法使用位点特异性的单损伤质粒。FM-HCR 能够对活细胞中的修复活性进行快速定量分析，但该检测需要专用仪器，且在同时分析多条碱基切除修复（BER）通路的机制方面存在局限性。27.
基于特定损伤的碱基切除修复（BER）底物的噬斑宿主细胞修复（PL-HCR）检测方法也已被开发，用于研究活细胞中的BER机制（图1)28. 在该方法中，质粒包含单个 1,N6εA 损伤被引入哺乳动物细胞。修复后，回收质粒 DNA，用限制性内切酶消化，转化进入 E. coli并通过噬斑形成分析进行定量。完全修复的质粒在限制性酶切后会线性化，无法形成噬斑；而未修复或未完全修复的质粒仍保持环状，能够形成噬斑。因此，碱基切除修复效率通过噬斑数量的定量来确定。 - 修复辅助损伤检测
修复辅助损伤检测（RADD）是一种用于检测和定量DNA损伤的单分子方法29在此方法中，特异性修复酶识别并切除受损碱基，随后DNA聚合酶将荧光标记的核苷酸掺入产生的缺口。之后通过荧光显微镜观察DNA分子，从而实现对DNA损伤的直接检测与定量分析。图2)30.
RADD 能够在单分子水平上对 DNA 损伤进行高灵敏度的定性和定量分析。然而，该方法主要测量的是 DNA 损伤负荷，而非直接评估细胞群体中的修复动力学或整体修复效率。
图1：噬菌斑宿主细胞修复（PL-HCR）。 将含有特定损伤的M13mp18环状单链DNA转染至感受态细胞中。转染后，细胞在琼脂平板上培养以形成噬菌斑。随后从噬菌斑中分离复制型M13 DNA，用限制性内切酶消化，并通过凝胶电泳分析，以区分突变型和野生型产物，判断损伤修复是否发生。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：修复辅助损伤检测（RADD）。 在DNA修复过程中产生的单链缺口被生物素标记的核苷酸填充。随后使用荧光标记的亲和素或链霉亲和素来检测已掺入的核苷酸，从而通过荧光分析实现对DNA损伤水平的定量评估。 请点击此处查看该图的放大版本。
3. 核苷酸切除修复（NER）
核苷酸切除修复（NER）是一种主要的DNA修复通路，负责清除导致DNA双螺旋结构发生扭曲的大体积DNA损伤31。NER的底物包括紫外线诱导的环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）、6-4嘧啶-嘧啶酮光产物（6-4PPs）、氧化性嘌呤损伤、大体积化学加合物以及顺铂诱导的链内交联32。NER功能缺陷与多种疾病相关，例如着色性干皮病，其特征为对紫外线极度敏感以及癌症易感性升高。
核苷酸切除修复（NER）包含两个主要的亚通路：全局基因组NER（GG-NER）33和转录偶联NER（TC-NER）34。GG-NER对整个基因组中引起DNA双螺旋结构扭曲的损伤进行识别，从而抑制诱变和致癌过程。相比之下，TC-NER选择性地清除活跃转录基因中阻碍转录的损伤，对维持转录完整性至关重要。TC-NER的缺陷可导致科凯恩综合征和紫外线敏感综合征等疾病35。
检测NER效率的方法
- 切口检测法
切口检测法通过检测修复蛋白在DNA损伤位点引入的链切口来评估核苷酸切除修复（NER）的效率。在该检测中，将含有DNA损伤的底物（例如经紫外线照射后含有环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）的DNA）与修复蛋白或细胞提取物共同孵育，随后检测产生的切口产物36。
可通过放射性标记或荧光标记提高检测灵敏度，并实现对切口活性的精确监测37。该方法可直接测量负责损伤识别和切除的关键NER蛋白的活性。然而，成功实施该方法需要制备高质量的损伤底物以及具有活性的蛋白提取物。 - 酶修饰彗星检测法
也可采用酶修饰的彗星检测法评估NER效率。在此方法中，将T4内切酶V与受损细胞共同孵育，以将嘧啶二聚体转化为可检测的单链断裂，随后通过彗星检测法进行分析38。 - 实时荧光定量PCR（qPCR）
实时荧光定量PCR（qPCR）通过测量DNA损伤对PCR扩增的抑制作用，间接评估DNA修复效率39。在NER分析中，首先使用紫外线照射诱导嘧啶二聚体。这些损伤会阻碍DNA聚合酶的延伸，降低扩增效率，导致循环阈值（Ct）升高。当NER通路完成修复后，DNA完整性得以恢复，扩增效率提高，Ct值随之降低。因此，通过比较修复前后目标区域与未受损内参区域的扩增效率，可定量计算修复效率40。
此外，qPCR还可用于检测参与DNA损伤信号传导和修复通路相关基因的表达水平，包括ATM、ATR、BRCA1、CDKN1A和XPC，从而间接反映DNA修复能力41。 - 基于流式细胞术的宿主细胞复活检测法（FM-HCR）
FM-HCR检测利用含有特定位点损伤的质粒转染宿主细胞，并通过流式细胞术分析荧光强度及荧光阳性细胞比例来量化修复效率（图3）42˒43。荧光强度的增加通常反映更强的DNA修复能力44˒45。 - 切除修复测序法（XR-seq）
切除修复测序法（XR-seq）是一种可在单核苷酸分辨率上全基因组范围内绘制NER活性图谱的技术。该方法选择性富集并在测序中鉴定NER过程中被切除的含损伤寡核苷酸，从而生成全基因组范围内的高分辨率修复活性图谱。XR-seq能够对GG-NER和TC-NER两条通路相关的修复效率及分布模式进行定量分析，代表了NER研究领域的重要技术进步。
由于NER包含两种机制上不同的亚通路，并涉及多种修复蛋白，因此需要多种互补的方法才能全面评估修复活性46˒47。除上述方法外，还可通过Western blot、免疫荧光检测、基于质粒的修复检测以及报告基因检测等方法评估NER效率。
图3：基于流式细胞术的宿主细胞复活法（FM-HCR）检测原理。 将含有四种不同类型DNA损伤的质粒共转染至培养的哺乳动物细胞中。随后通过流式细胞术根据报告荧光强度定量DNA修复能力（DRC）。DRC，DNA修复能力。 请点击此处查看该图的放大版本。
4. 错配修复（MMR）
错配修复（MMR）是一种复制后校正途径，负责修复DNA复制过程中产生的碱基错配（如G-T和A-C错配）以及小的插入-缺失环48。MMR的启动始于MutS识别错配碱基，随后MutL招募下游修复因子和外切核酸酶以激活修复过程49。MMR中的一个关键步骤是区分亲本链与新合成的DNA链50。
在原核生物中，链的区分通过DNA甲基化实现，该机制可标记亲本链。在真核生物中，链的身份由新合成DNA中的瞬时切口以及与增殖细胞核抗原（PCNA）的相互作用来确定。错配修复（MMR）显著提高了复制的保真度，在维持基因组稳定性方面发挥着关键作用51。MMR功能缺陷与多种癌症密切相关，包括林奇综合征。
评估错配修复效率的方法
- 微卫星不稳定性检测
错配修复（MMR）功能缺陷会导致微卫星位点处的复制滑动错误无法被纠正，从而引起微卫星不稳定性（MSI）。MSI检测通过PCR扩增具有代表性的微卫星标记，随后进行基于毛细管电泳的片段分析。多个位点出现不稳定性提示MMR功能受损，而微卫星图谱稳定则表明MMR功能完整。MSI检测在识别MMR缺陷方面具有高灵敏度和特异性；然而，其仍是MMR功能的间接检测方法，无法对修复效率进行定量评估。
含有特定错配或插入-缺失环的报告质粒也可用于通过报告基因检测评估MMR效率。此外，针对MMR相关蛋白的Western blotting和免疫荧光检测可间接反映该通路的活性。
5. 双链断裂（DSB）修复
双链断裂（DSBs）是最具细胞毒性的DNA损伤形式之一。若未能准确修复双链断裂，可能导致突变、染色体缺失、易位、基因组不稳定以及肿瘤发生。双链断裂的修复主要通过同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）两种途径进行，这两种机制在细胞周期的不同阶段优先发挥作用52。
评估双链断裂修复效率的方法
- γ-H2AX 焦点检测
γ-H2AX 焦点检测是用于间接检测 DNA 双链断裂（DSBs）的最常用方法之一。在 DSB 形成后，组蛋白 H2AX 会在 Ser139 位点迅速发生磷酸化，形成 γ-H2AX 焦点。γ-H2AX 焦点的数量与 DSB 形成的程度相关，通过免疫荧光显微镜随时间监测焦点消失的速率，可推断出修复效率。
该检测方法具有多个优势，包括高灵敏度、单细胞分辨率以及成熟的实验方案，使其成为DNA损伤应答（DDR）研究中的核心方法。 - BLESS 与 BLISS
BLESS（断裂标记、链霉亲和素富集与测序）和 BLISS（原位断裂标记与测序）是基于原位标记和高通量测序的全基因组 DSB 定位方法。这两种方法均通过将测序接头直接连接至断裂的 DNA 末端，实现 DSB 位点的精确定位与全基因组范围内的定量分析。这些方法还可用于评估总体 DSB 修复动力学。
此外，DSB 特异性报告基因检测可定量评估 DSB 修复效率，并区分同源重组（HR）介导的修复与非同源末端连接（NHEJ）介导的修复（图 4）。然而，尽管 γ-H2AX 检测、BLESS 和 BLISS 能有效测量整体 DSB 负荷及修复动力学，但无法确定修复是否特异性地通过 HR 或 NHEJ 通路完成。
图 4：双链断裂（DSB）修复的报告基因检测。 将 DSB 报告基因质粒导入靶细胞。转染后经过适当的修复时间，通过荧光显微镜检测报告基因的荧光信号，以评估 DSB 修复效率。DSB，双链断裂。 请点击此处查看此图的放大版本。
6. 同源重组修复（HR）
同源重组（HR）是一种高保真的DNA修复通路，主要在细胞周期的S期和G2期发挥作用，此时未受损的姐妹染色单体可作为修复模板53。在DNA双链断裂（DSB）形成后，MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物识别DNA末端，并与CtIP协同启动DNA末端切除过程54。该过程产生3′单链DNA（ssDNA）突出末端。
新生成的单链DNA最初由复制蛋白A（RPA）包被，RPA可保护DNA免受核酸酶降解，并防止形成二级结构55。随后，BRCA2介导RPA被RAD51重组酶取代，从而形成RAD51核蛋白丝状结构56。该丝状结构会搜寻姐妹染色单体上的同源DNA序列，并促进单链侵入同源双链DNA模板，形成置换环（D-loop）结构57˒58。随后进行DNA合成和链交换，完成修复过程。
可以使用DR-GFP报告系统在报告基因检测中对同源重组效率进行定量评估。或者，也可通过针对同源重组相关蛋白的蛋白质印迹（Western blotting）或免疫荧光检测进行间接评估。
7. 非同源末端连接（NHEJ）
非同源末端连接（NHEJ）在无需DNA末端之间具有广泛序列同源性的情况下修复双链断裂（DSBs）59。相反，断裂的DNA末端被直接加工并连接，这使得NHEJ成为一种本质上易出错的修复途径。由于DNA末端在连接前可能发生降解，且来自不同DSB的末端可能被连接在一起，因此NHEJ可导致突变、缺失以及染色体重排60。
目前已知三种主要的非同源性修复形式：经典的非同源末端连接（NHEJ）、单链退火（SSA）以及微同源介导的末端连接（MMEJ）。
- 经典非同源末端连接（Classical NHEJ）
经典非同源末端连接在细胞周期的各个阶段均可发挥作用。Ku70/Ku80异源二聚体首先识别并结合DNA双链断裂（DSB）的末端61。该复合物招募DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs），从而激活激酶信号通路并启动NHEJ过程。随后，由核酸酶和磷酸酶等末端加工酶对受损的DNA末端进行处理，最终由XRCC4-DNA连接酶IV复合物介导DNA末端的连接62。由于末端加工过程常导致核苷酸丢失或错误连接，NHEJ被认为是一种具有诱变性的修复通路63˒64。 - 单链退火（SSA）
单链退火（SSA）可修复发生在重复同源序列之间的DNA双链断裂。在DSB形成后，核酸酶对5′端DNA进行切除，产生较长的3′单链DNA突出端。RAD52介导互补同源重复序列之间的退火65。随后，XPF-ERCC1核酸内切酶复合物切除未配对的DNA flap结构，SLX1-SLX4复合物也可能参与末端加工过程。DNA连接酶随后封闭剩余的缺口。由于同源重复序列之间的序列在修复过程中被删除，SSA被认为是一种快速但本质上具有诱变性的修复机制66。 - 微同源介导的末端连接（MMEJ）
微同源介导的末端连接（MMEJ），也称为替代性非同源末端连接（Alt-NHEJ），是另一种易出错的DNA双链断裂修复通路67。在MMEJ中，利用位于DNA断裂末端附近的短微同源序列来对齐断裂的DNA末端，以启动修复。在识别这些微同源区域后，DNA末端通过类似重组的过程连接在一起68。由于MMEJ依赖于非常短的同源序列，修复过程中常发生缺失和基因组重排。
NHEJ的效率可通过EJ5-GFP报告系统在报告基因检测中进行定量评估。此外，也可通过Western blotting和针对NHEJ相关蛋白的免疫荧光分析间接评估修复活性。
8. 链间交联（ICL）修复
链间交联（ICL）是一类高度毒性的DNA损伤，通过共价键将DNA双螺旋的两条链连接在一起，从而阻断DNA的复制和转录。ICL修复机制复杂，主要涉及范可尼贫血（FA）通路和NEIL3通路69。
在FA通路中，FANCM识别ICL损伤并促进FANCI-FANCD2复合物的单泛素化，从而激活下游修复蛋白70。随后，结构特异性核酸酶在交联位点附近切割DNA，使两条DNA链分离，产生的DSB通过HR或NHEJ通路进行修复。
在NEIL3通路中，DNA糖基化酶NEIL3切割与ICL损伤相关的糖苷键，产生无嘌呤/无嘧啶（AP）位点，随后由跨损伤合成（TLS）聚合酶绕过这些位点71。由于ICL会阻碍复制和转录所需的链分离，这类损伤具有高度细胞毒性，并与衰老、神经退行性疾病以及癌症的发生相关72˒73。
ICL修复效率可通过基于质粒的修复检测、报告基因检测、宿主细胞复活检测以及 体外 重建的修复系统
9. 跨越损伤合成（TLS）
跨损伤合成（translesion synthesis, TLS）是一种DNA损伤耐受机制，能够在未修复的DNA损伤位点继续进行复制74。TLS主要依赖于特殊的DNA聚合酶，包括聚合酶κ、η、ι和ζ。当DNA复制在损伤位点停滞时，TLS聚合酶可绕过该损伤位点，使复制得以继续，从而维持基因组的稳定性75。
与直接清除或修复DNA损伤的BER、NER、MMR、HR和NHEJ不同，TLS并不消除DNA损伤。相反，它在DNA复制过程中绕过未修复的损伤，因此被归类为一种损伤耐受机制，而非经典的DNA修复通路76。
跨损伤合成（TLS）可分为无错误和易错的旁路途径。无错误的TLS在损伤位点对面插入正确的核苷酸，而易错的TLS则频繁引入错误的核苷酸，从而导致突变的发生。易错的TLS被认为是环境致癌物诱导基因组突变的主要机制之一。因此，调控易错的TLS途径可能成为癌症预防和治疗的潜在策略77。
评估跨损伤合成（TLS）效率的方法
- 新生DNA上蛋白质的分离（iPOND）
新生DNA上蛋白质的分离（iPOND）是一种用于分析在停滞复制叉处与新合成DNA结合的蛋白质的技术。由于跨损伤合成（TLS）活性常发生在停滞的复制叉处，iPOND可实现对复制应激期间TLS聚合酶及DNA损伤应答（DDR）蛋白的募集与组装动态的分析。因此，该方法可用于评估TLS活性以及与复制偶联的修复过程。
TLS效率也可通过含有TLS特异性DNA损伤的报告基因质粒在报告基因检测中进行评估。此外，针对TLS相关蛋白的Western印迹和免疫荧光检测可间接评估该通路的活性。
10. 实验设计中的质量控制与可重复性考量
- 生物学重复与技术重复
在DNA修复研究中，明确区分生物学重复和技术重复对于确保实验的可靠性和可重复性至关重要。通常情况下，每个实验应至少包含三个独立的生物学重复，而技术重复的数量则应根据检测平台的变异性来确定。
对于单细胞检测方法，如彗星实验和基于免疫荧光的焦点分析，每个生物学重复应分析至少50–100个细胞，以尽量减少取样偏差。在基于流式细胞术的报告系统检测中，包括DR-GFP和FM-HCR检测，每个样本应收集不少于10,000个活细胞事件，以确保统计学上的稳健性。 - 标准化策略
为了在不同样本或不同实验批次之间进行准确的修复效率定量比较，必须采用严格的归一化程序，以尽量减少因转染效率、细胞活力、上样量和仪器性能差异所引起的系统性变异。常用的归一化策略包括以下几种：- 共转染归一化质粒
在HCR检测、基于报告基因的修复检测以及基于质粒的修复检测中，建议共转染一个不受DNA损伤影响的归一化质粒。常用的对照包括pRL-TK海肾荧光素酶质粒或组成型表达的GFP载体。修复效率通过计算实验报告信号与对照报告信号之间的比值进行归一化。 - 使用看家蛋白或总蛋白染色进行归一化
在通过Western blot分析修复蛋白表达水平或残留CPD水平时，应使用看家蛋白（如GAPDH、β-actin或组蛋白H3）或总蛋白染色方法（如Ponceau S或REVERT染色）进行归一化。 - 未损伤对照
在基于qPCR的修复检测中，应同时扩增未受损的基因组区域作为内参对照，并使用ΔCt法计算相对损伤水平。类似地，HCR检测应包含代表最大报告基因表达水平的未损伤质粒对照，从而使修复效率能够相对于未损伤的参考质粒进行表达。 - 细胞数量归一化
在基于流式细胞术的检测中，包括FM-HCR和DR-GFP检测，各样本间应分析相同数量的活细胞。修复效率应以阳性细胞百分比或荧光强度的相对变化形式报告。
- 共转染归一化质粒
- 修复效率测量的时间动力学维度
DNA修复是一个动态过程，仅基于单一时间点的测量可能无法区分修复延迟与修复通路完全缺陷。因此，强烈推荐采用时间序列实验设计。
在诱导DNA损伤后，应在多个连续时间点（如0、0.5、1、2、4、8、12和24小时）采集样本，以监测损伤标志物或修复产物的积累与清除情况。信号消失的动力学特征可提供有关修复速率、通路完整性及整体修复效率的重要信息。 - 多重假设检验校正：
高通量和多重检测方法通常涉及对多个修复通路或实验条件的同时分析，从而因多次统计比较而增加假阳性结果的风险。例如，使用FM-HCR检测同时评估BER、NER、HR和NHEJ活性；使用BLESS或BLISS进行全基因组DSB分析；以及基于qPCR阵列的DNA修复基因表达分析。
因此，在实验设计阶段应预先确定多重假设检验的统计校正方法。所选用的校正方法及调整后的显著性阈值应在材料与方法部分以及统计分析部分中明确说明。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结论
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
准确检测和定量分析DNA损伤修复过程对于理解DNA修复的分子机制、评估环境暴露的生物学效应以及评价治疗反应至关重要78。因此，深入研究DNA损伤修复通路及修复效率在基础研究和临床应用中均具有重要意义79。
大量研究表明，肿瘤细胞可通过DNA修复通路的异常激活获得对化疗的耐药性80。靶向抑制特定的修复机制可增强肿瘤对治疗的敏感性，并有助于发现用于癌症诊断和治疗的新型生物标志物81。例如，分析肿瘤细胞中DNA修复通路的活性可能有助于预测患者对化疗或放疗的反应，并为制定个体化治疗策略提供支持。
对DNA损伤修复系统的研究不仅有助于深入理解细胞如何维持基因组稳定性，而且为癌症治疗、基因编辑以及衰老相关研究提供了重要的理论和实践基础。此外，为了提高DNA修复检测结果的可重复性和不同实验室之间的可比性，实验设计应明确定义生物学重复和技术重复，纳入适当...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
作者声明不存在可能影响本研究工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
本工作由江苏省慢性病防控关键技术开发与转化工程研究中心、江苏省高校科学技术创新研究团队（2021年）、江苏省高职院校工程技术研究项目（2023年）、中国江苏省高等教育机构自然科学重点基金（项目编号：24KJA310008）、苏州卫生职业技术学院重点项目（项目编号：szwzy202406）以及苏州大学放射医学与防护国家重点实验室（项目编号：GZK1202506）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可