一种用于果 蝇 复眼高分辨率Z堆栈成像的磁带安装协议

Summary

该方案的主要目标是实现果蝇复眼的无损成像和定量分析。它结合了磁带安装策略、立体显微Z堆栈采集和扩展焦深重建技术，以生成高分辨率、无伪影的图像。

Abstract

本文介绍了一种用于果蝇复眼高分辨率表型分析的无损安装和成像方案。果蝇复眼的准确表型常受其凸几何和机械脆弱的操作限制。为此，我们详细介绍了一种多功能、非侵入式的成像工作流程，能够从多个角度实现高分辨率可视化。该方案采用定制的胶粘性安装策略，安装在倒置胶带平台上，固定飞蝇的身体和翅膀，同时完全不触碰头部。关键是，这种灵活的配置支持不同的安装方向：侧向位置以捕捉单个眼睛的全面凸性，正面位置用于评估整个头部的对称性。该方法还便于高密度阵列的布置，允许每次快速处理20至30个样本。通过将反射光立体显微镜与Z堆栈采集和扩展对焦深度（EDF）重建相结合，工作流程能够生成均匀锐利的准三维复合图像。该方法保留了自然色素沉着，并生成高保真度、对比度丰富的图像，适合定量器官尺度表型分析。

Introduction

果蝇黑胃复眼是一种经典且强大的模型，用于研究器官生长、模式和发育过程中的稳健性。蝇眼由约800个高度有序的全体组成，能够灵敏且可量化地读取影响增殖、分化和^{组织组织的}遗传扰动^1,2,3。眼部发育的遗传操作历来为保守信号通路提供了基础性见解。开创性研究表明，转录因子无眼异位表达足以诱导非视网膜组织中的眼球形成，确立了眼球作为器官指定和可^塑性的范式。后续研究确认黑胃大海马信号通路通过协调控制增殖和凋亡，将眼球大小和细胞数的中心调节因子^5,6。与此同时，Hedgehog和BMP信号传导被证明调控发育中的视网膜中的形态发生进展、生长精度和空间模式 ^7,8。

然而，由于复合眼具有凸状半球形结构，拍摄高保真图像存在显著光学挑战。标准的明场显微镜受限于浅景深，无法在单次曝光中同时聚焦眼睛的最背端点（极点）和边缘边缘（赤^道）。这种限制常导致视网膜表面的大部分图像模糊，阻碍了高分辨率图像分析和机器学习工具的应用，这些工具旨在量化斑驳表型。要全面表征视网膜表面，必须在无光学伪影的情况下观察整个曲率。因此，需要一种既能保留眼部原始形态，又能高分辨率显示整个弯曲视网膜表面的成像方法。

此外，传统的显微镜样品制备方法常常会破坏飞蝇头的结构完整性。传统安装技术通常依赖胶粘剂，这些胶粘剂可能遮盖表面细节，或涉及用镊子对头囊施加压力的物理操作。正如视网膜形态发生研究中指出的，眼睛的结构完整性至关重要。直接压力或穿刺会导致血淋巴渗漏，导致内压下降，随后眼表面塌陷或“凹陷”。这些机械伪影可能模仿神经退行性表型或遗传缺陷，导致大规模筛查中的假阳性结果。该方案的目标是提供无损的装载和成像工作流程，用于高分辨率的完整果蝇复眼成像。

本文介绍了一种快速且可重复的成像流程，实现完整果蝇复眼及全头形态的高分辨率可视化，无需直接接触头部。该方法通过柔性粘附方法固定成蝇，固定身体和翅膀，实现横向姿态（捕捉单眼完整弧度）或正面方向（评估头部对称性和眼间特征）的稳定定位。这种多功能安装方式最大限度地减少机械损伤，并在三维空间中保持了原生眼的几何形状。结合反射光立体显微镜、Z堆采集和扩展焦^深重建9，该方法可从多角度生成均匀锐利、高质量的图像，适用于定性检查和定量表型分析。该方法特别适用于果 蝇遗传扰动、发育表型以及高通量眼形态筛查的研究。

Protocol

1. 样本采集与同步

注意：为确保实验可比性，需严格控制爆发时间。在25°C的标准养殖条件下，卵壳化通常发生在产卵后10至12天。在此期间应密切观察蛹，因为蛹壳变暗表明即将羽化。

1. 直接敲击法（标准方法）
   1. 轻轻将标准的24 x 95毫米塑料果 蝇 培养瓶（用泡沫塞密封）敲击软垫，将成蝇驱散到底部。
   2. 迅速取出栓塞，并将新鲜采集瓶口与培养瓶对齐。
   3. 把设置反过来，让培养瓶放在上面。轻轻敲击壁，将蝇转移到采集瓶中。
      注意：如果标准玉米粉琼脂饲料是湿润的，不推荐使用此方法，因为新封闭的果蝇容易被捕捉并杀死。为减少死亡，最初将蝇类收集到一个空的24 x 95毫米小瓶中。麻醉后（步骤3），将飞蝇转移到装有新鲜培养基的24 x 95毫米小瓶内壁。
2. 负向地向态转移法（反粘附法）
   1. 将新采集瓶中的塞子取下，倒置放在工作台上，以防止游蝇进入。
   2. 将培养瓶口朝下握持。苍蝇会向上爬向食物侧，远离开口。
   3. 一旦开口清除苍蝇，迅速拔出培养瓶塞，并将其与工作台上倒置的24 x 95毫米收集瓶对齐。
   4. 轻轻敲击工作台的连接点，将假蝇放入采集瓶中。
      注意：该方法显著减少食物粘附导致的死亡率，但比直接抽取更耗时。
3. 二氧化碳麻醉法（高效方法）
   1. 将培养瓶倒转，使插头朝下。
   2. 小心地将二氧化碳麻醉枪的针头插入插头和瓶壁之间。
   3. 轻轻踩下脚踏板和手阀，以低温和的流量释放100%二氧化碳。
   4. 当苍蝇麻醉后落到塞子上后，将培养瓶水平放置。取下塞子，对准空的采集瓶，轻轻敲击培养瓶，将麻醉的果蝇转移到采集瓶中。
      注意：过多的气流可能会把苍蝇吹到食物表面，导致粘附甚至死亡;严格维持温和的_CO2 流量，足以麻醉蝇体，同时不使其物理排位。监视器密切观察早期恢复迹象，如翅膀和腿部的细微抽搐或活动。
4. 标签与维护
   1. 在采集瓶上标注性别、采集日期、细胞排泄日期、基因型和培养条件。
   2. 性别分离：如果影像飞行超过10天，应将雄性和雌性分开使用不同的含食物培养瓶，以防止交配和F2世代的出现，这可能干扰实验环境。
      注意：在之前的培养条件下（例如25°C），这些含食物小瓶可保持蝇体，直到达到成像所需的年龄。

2. 安装板的准备

1. 获取一张干净的标准玻璃显微镜载玻片。
2. 剪一条比幻灯片长约2厘米的白纸遮蔽胶带。
3. 把胶带贴在滑套上，胶带一面朝上（非胶面朝向玻璃）。确保胶带两端悬挂在滑套上方约1厘米。
4. 通过在滑套背面紧紧缠绕两条~5毫米的胶带，固定悬垂端。
5. 确保粘合面平整、紧致且无皱纹。
6. 标签：在胶带非粘性端端标记方向指示（如“顶/上”和“下/下”）或样品标识，便于显微镜下的定向和样品追踪。
   注意：在选择影像学用果蝇时，避免选择体型差异较大的个体。即使放大倍数相同，体型差异仍可能导致复眼面积无法比较。

3. 安乐死与装裱

1. 安乐死
   1. 将果蝇转移到密封且空的采集瓶中。
   2. 将密封瓶放入-80°C的冷冻室，冷却15至20分钟。
      注意：切勿用细镊尖刺破或挤压拉蝇。即使是轻微的血淋巴渗漏也会迅速失去内部静水压，导致复眼立即凹陷和不可逆塌陷，从而破坏影像质量。
2. 横向视角安装（单眼复眼）
   1. 定位：在标准立体显微镜（如尼康SMZ745）下，使用细尖镊子将被安乐死的苍蝇定向侧卧。
   2. 转移：使用细尖镊子，轻轻抓住飞翼（保持侧向姿势），将其转移到预备好的粘合安装板上。
   3. 固定：将果蝇身体的一侧粘在胶带上。张开翅膀并贴平贴在胶带上以增加稳定性。
   4. 附肢管理：安装时，确保双腿不阻挡复眼。如果前腿挡住视线，使用镊子小心地将它们从眼睛上拉开，并牢牢固定在胶带上（例如向下伸展或夹在胸部下方）。
   5. 固定方法：倾斜镊子，用镊子侧面（不是尖锐的尖端）轻轻将胶带贴合，确保牢固粘合。
   6. 微调：检查头是否水平。如果眼睛不在单一焦平面上，可以用镊子微调身体角度。
3. 正面视角安装（整个头部）
   1. 姿势：在麻醉垫上，将飞蝇调整为腹侧朝下（趴下）姿势。
   2. 转移：用镊子夹住一只翅膀，抬起飞蝇。把它转移到粘贴安装板上。
   3. 初步固定：轻轻将双翼向外展开（左右），并牢固压在胶粘面上以固定飞蝇。
   4. 身体稳定：轻轻按压胸部，确保与粘板完全接触。用镊子轻轻夹住后腹部（尾巴），轻轻拉扯以矫正身体轴线，然后将腹部固定在胶带上。
   5. 头部方向：用细镊子调整头部角度，确保正面面与粘合面平行。两只复眼应在同一焦平面上水平且可见。
4. 排列
   1. 将多个飞蝇平行排列或网格状阵列安装在粘合面上。确保单个飞蝇不重叠以防止Z堆叠干扰，但允许紧密堆积以最大化通量（例如每张滑梯20–30次飞）。将所有果蝇头部朝向相同方向（如步骤2.6所示）对齐，以便系统成像。
   2. 准备不同样本阵列用于侧向和额部成像，使用同一队列中不同安乐死的果蝇。一旦假蝇粘附在胶带上，就无法安全移除或重新定位，否则会对试样造成严重机械损伤;因此，无法从同一个体连续成像多个视图。
      注意：强烈建议在安乐死和安装后立即拍摄样本影像，以防止组织干燥。

4. 图像采集

1. 电动立体显微成像系统的启动与初始化
   1. 电脑、显示器和显微镜单元依次开机。
   2. 启动 LAS X软件。
   3. 当出现“初始化/自我测试”提示时，确保目标下方空间无障碍，并点击 确认。让显微镜完成完整的Z轴校准移动。
      注意：以下步骤针对配备LAS X软件系统的立体显微镜进行了优化。
2. 样品放置与照明
   1. 将预备好的安装板转移到电动立体显微镜的底座平台，手动将其定位，使数字相机物镜下方的第一个样品置中。
   2. 打开透射光（基座）和入射光（顶部）光源。复眼成像主要使用反射光。调整光圈以确保均匀的照明。
3. 软件配置
   1. 将 采集模式 设置为Z叠加。在项目设置中，将多维移动优先级设置为“Z-first”，以确保电机驱动连续稳定运行。
   2. 将 成像模式 设置为反射光。
   3. 启用 扩展对焦 深度（EDF），以便合成完全聚焦的图像。
   4. 在图像高级设置中，启用高动态范围（HDR）。强烈建议这样做，以减轻复眼高度反光、几丁质表面常见的镜面高光和过度曝光。
4. 定位与白平衡
   1. 将放大角调整到合适的水平（例如，侧面单眼视角的放大倍数为16倍，正面全头视角为12.5倍），确保特定感兴趣区域占据视野的一半到三分之二。
   2. 手动调整安装板，使假蝇胸部进入视野中心。
   3. 用胸部进行白平衡校准以校正色温。
5. 曝光和成像参数（参考值）
   曝光时间：60–80毫秒。
   增益：0–5（保持低音以减少噪声）。
   强度：60%–80%。
   Z叠栈步长：标准：8–12微米。
   注意：对于光滑健康的复眼（如 w¹¹¹⁸ × GMR-GAL4），步长可达15微米，因为连续且规律的曲率需要较少的光学切片。然而，对于粗糙或不均匀的眼状特征是截然变化的拓扑，需要更小的步长（低至5微米）以捕捉细微结构细节并显著提升EDF重建精度。
6. Z-栈定义与捕获
   1. 横向视图：使用8–12微米的步长设置从轨道边缘（起始）到中心全体（末）的Z叠加范围。
   2. 正面视角：调整对焦旋钮，直到复眼的外轮廓刚好清晰（开始）。将焦点调整到相反方向，直到头顶的中央眼斑（黄色单眼）刚好聚焦（结束）。点击 “Set End”。
   3. 点击 停止直播 以冻结预览。
   4. 点击 开始获取。系统会自动捕捉定义的焦平面，并合成高分辨率、全焦的图像。
7. 文件保存：
   1. 完成EDF重建后，在软件界面点击“保存”图标（或导航到文件>另存为“）。
   2. 选择目标目录，输入指定的文件名，然后点击 保存。
   3. 注意，每次采集都会生成三个不同的图像文件：a.原始/通道图像（灰度）;b.彩色预览图;c. EDF 合成图像（带有“_Composite”后缀）
      注意：原始/通道图像和EDF合成图像均应保留以供分析和记录

Results

从样本采集到图像采集的完整实验流程总结见 图1。修改后的协议通过创建高密度样本阵列得以展示其效率。如 图2A所示，20至30只麻醉飞蝇可以以网格状排列在单一倒置胶带平台上。磁带非粘性端部书写的定向标记确保磁头方向一致，便于快速、系统化成像，且只需最小的阶段调整。关键是，该方法标准化了固定过程，使得快速生成高密度阵列，实现野生型和突变表型的可重复成像。成功的制备可在整个弯曲视网膜表面产生均匀锐利的图像，且无变形或光学模糊。

该策略允许在两种截然不同的方向下实现稳定的固定。 图2B 展示了侧向安装的配置，即假蝇侧卧固定，暴露复合眼的半球形弯曲。 图2C 展示了正面安装配置，飞蝇在腹部固定，展开翅膀，呈现头部对称视图。在这两种配置中，头囊上没有物理约束（如镊子压力），这证实了该方法有效...

Discussion

果蝇复眼作为遗传筛查的强有力表型读数，眼径、粗糙度或色素^2,3,8的变化常常表明基本信号通路（如河马^5,6或刺猬⁷）出现扰动。然而，这类屏幕的效率长期以来一直受到传统成像工作流程的限制。以往的固定技术通常涉及用镊子手动定位或永久粘合，不仅劳动密集且耗时，而且容易损坏被分析的结构。为应对这些挑战，我们开发了一种多功能的安装策略，采用定制倒置胶带平台。这种方法不仅能在一次治疗中快速固定多只果蝇，更重要的是，能够在多种方向下实现稳定的固定，从而从不同的解剖学角度进行全面的表型评估（^10,11）。...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
二氧化碳（CO2）气瓶	本地供应商	无
CO2麻醉吹箭	T&L	DG-08
数码显微镜相机	徕卡	DMC6200
细镊子	维图斯	MOS-167B
泡沫塞	东平	无
图像采集软件（LAS X）	徕卡	3.7.1
图像处理软件（FIJI/ImageJ）	美国国立卫生研究院	开源
LED圆顶照明器	徕卡	LED5000 HDI
LED鹅颈照明器	科西姆	LG-10
电动立体显微镜	徕卡	M205 FCA
物镜	徕卡	1.0x PlanApo NA0.2
气动脚踏阀	德利克西	FV-320
标准果蝇培养瓶	莱博尔	2424951
标准果蝇食介质	无	玉米粉琼脂糖蜜
标准玻璃显微镜载玻片	Citotest	10127101P-G
标准立体显微镜	尼康	SMZ745
白纸遮蔽胶带	乌布温	25毫米宽