冷冻组织切片中转录组和表观基因组靶点的空间分辨、集成多组分析

Summary

本研究提出了一种空间Trekker–CUT&Tag多组方案，结合了组织切片的直接空间条形码与单细胞多组分析。该方法能够实现基因表达和组蛋白H3K27ac修饰的空间分辨，同时实现，为组织微解剖学背景下的基因调控提供机制性见解。

Abstract

空间多组学技术结合单细胞剖析，为阐明复杂组织的分子和细胞结构提供了前所未有的机遇。将单个冷冻切割中由嵌入最佳切割温度（OCT）冷冻培养基中的组织块制备的空间条形结构与单细胞多组分析结合，形成一个简单高效的工作流程，有助于对组织类型中细胞进行注释和空间分辨的分子分析。本研究报告了一种目标与标记空间切割（CUT&Tag）多组方法，能够同时分析单个冷冻脑切片中组蛋白H3K27ac修饰和基因表达。在空间条码处理后，单核被分离并进行CUT&Tag、标签DNA、RNA和空间条码的联合捕获、文库制备和测序。该工作流程从同一细胞核生成空间注释的表观基因组和转录组谱，使多组信息能够被分配到解剖坐标上。将表观基因组信息与空间转录组数据整合，提高了细胞类型识别的准确性，揭示了完整组织内空间组织的调控程序和细胞间相互作用。

Introduction

空间生物学是一个快速发展的领域，旨在绘制分子、细胞和组织在其原生环境中的位置、组织和相互作用（^1,2,3）。与需要组织解离并导致位置信息丧失的大规模或传统单细胞方法不同，空间方法保留分析物或细胞/细胞核的物理坐标，从而能够直接研究组织结构如何影响细胞身份、细胞间通讯和生物功能 4,5,6,7 .虽然空间转录组学和空间蛋白质组学目前是最广泛采用的模态，但该领域正迅速向空间多组学谱扩展，^3,8,9。在同一组织内共谱基因表达和表观基因组状态尤为强大，因为它直接将转录输出与调控机制（如染色质可及性和组蛋白修饰）联系起来，这些机制调控基因活性，且已知在不同空间域中有所变化 10,11,12.因此，综合空间表观基因组和转录组分析将为调控程序如何塑造细胞身份和组织组织提供关键见解。

已开发出多种空间多组策略，以实现同时表貌基因组和转录组的分析。组织测序中的确定性条码（DBiT-seq）利用微流控通道直接或间接地将空间条码通过用凝胶板压制，传递到组织切片，从而实现分析物的空间注释。该方法有助于空间分辨表观基因组和转录组特征的共谱，12,13,14,15。Slide-tag方法，商业化为Takara Trekker平台，在解离前直接将空间条码引入完整组织，使空间索引的核能够使用标准单细胞工作流程处理，并计算投影回其原始组织坐标¹⁶。相比之下，可及染色质、细胞谱系和基因表达的空间测定（SPACE-seq）采用了靶点输出策略，即在空间转录组第¹⁷块的多dT捕获序列上捕获多（A）尾表观遗传目标和mRNA。

靶点与标记下的切割（CUT&Tag）是一种强大的工具，用于绘制极低^{输入样本中}DNA与组蛋白或非组蛋白蛋白质相互作用的地图。CUT&Tag依赖Tn5转座酶介导的染色质断裂和DNA标记（标记），采用抗体引导的蛋白A结合Tn5进行位点特异性切割和分子标记。虽然传统的CUT&Tag检测包含多个孵育和洗涤步骤，但采用了简化和精简的CUT&Tag工作流程，以提升下游单细胞多组应用中的CUT&Tag效率¹⁹。

图1：空间Trekker–CUT&Tag多组测定的工作流程与质量控制概述。 （A） 空间 Trekker–CUT&Tag 多组工作流程的示意图。新鲜冷冻小鼠脑组织的冠状切片被安装在Trekker空间瓷砖上，并进行空间条码处理。组织裂解后，细胞核被分离并评估产率和质量。H3K27ac CUT&Tag约使用50,000个核，标记核在计数后使用10倍基因组铬多组凝胶珠进行单细胞条码处理。单细胞条形DNA经过预扩增并分为两组。索引的CUT&Tag库由索引PCR直接生成。对于基因表达和空间条码库，预扩增的DNA会进一步扩增并进行尺寸选择。对应典型cDNA大小的片段用于基因表达文库的制备，而较短的DNA片段则用于生成空间条形码库。文库的测序和定位遵循10倍基因组学和Curio Trekker指南。左侧显示了预期的实验时间线。（B）关键的质量控制（QC）检查点及整个工作流程中的关键考量。核质量控制包括产量、完整性、聚集性和碎片含量的评估。测序前质控包括评估所有文库的DNA尺寸分布和引物二聚体污染情况。CUT&Tag文库特异性通过定量PCR（qPCR）评估，测量目标基因组区域在背景中的富集情况。 请点击此处查看该图的放大版本。

本研究采用空间Trekker CUT&Tag多组测定，同时分析与活性顺式调控元件相关组蛋白H3K27ac修饰及新鲜冷冻组织切片中基因表达。该方案提供Takara Trekker空间条形码、组织解离与细胞核分离、核计数与质量控制、H3K27ac修饰低输入CUT&Tag分析、10倍基因组单细胞多组凝胶珠分子靶点捕捉及文库制备等步骤。该工作流程通过小鼠脑组织的冠状切片进行了演示。与标准的10x Genomics Multiome工作流程不同，后者通过高通量测序（ATAC-seq）测定转座酶可及染色质检测染色质可及性，该协议用CUT&Tag衍生的DNA片段替代ATAC片段，实现单细胞分辨率的组蛋白修饰景观直接探究。为了将Trekker空间条码与10倍基因组学单细胞条码连接，多组凝胶珠的poly-dT序列捕获多（A）尾空间条码和mRNA转录本，而CUT&Tag的DNA片段则由间隔序列捕获。这种双重捕获策略使得同一单核能够同时恢复表观基因组、转录组和空间信息。据我们所知，这是首个直接将条码内Trekker空间注释与单细胞多组分析法整合起来的空间多组学工作流程，以共同剖析组蛋白标记的全基因组分布和转录组。由此产生的空间分辨多组景观，整合了H3K27ac的占有率和基因表达数据，使单细胞谱能够投射回其原始组织坐标，并为表观基因组调控机制与转录程序之间与完整组织结构之间的直接联系提供了联系。

Protocol

成年小鼠在组织采集前通过吸入_CO2 进行安乐死（IACUC #： A48315-15-R24）。在矢状开颅术和切除半颅骨后，大脑被 整体 切除。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 将纸巾切片安装在Trekker条码磁贴上以实现空间条码

1. 开始前请准备以下内容。
   1. 切片前，在低温容器中平衡最佳切割温度（OCT）嵌入的组织块。准备缓冲液以进行紫外线切割、组织解离和细胞核分离。
      注意：切片的最佳温度可能因组织类型而异。
   2. 为分离核，使用摆桶预冷离心机，1.5毫升管至4°C。 用冰块上的Trekker O型圈预冷12孔板。
   3. 将紫外线计设置为最大电流限制（1.2 A）和最大功率。
2. 记录将要使用的Trekker图块的空间条形码瓦片ID（例如U0001_001）。
   注意：每块Trekker地砖都包含独特的条形码坐标。磁砖 ID 用于获取序列数据空间条码映射的正确文件。
3. 切开组织。在−18°C下，在布雷格玛约1毫米位置进行了厚度25微米的冠状切片（见图1A）。
   注意：在处理低细胞组织时，厚度可增加至30微米。
4. 将该切面（或感兴趣区域）放置在空间瓷砖上，轻轻用手指按在滑动玻璃底部将其熔化。
   注意：如有必要，请使用Trekker训练图块进行核质量控制测量。
5. 用镊子把瓷砖从透明胶上取下，然后把它放在12孔组织培养板的一个凹槽里，冰块上放在Trekker O型圈上。立即将30微升Trekker紫外线切割缓冲液移液移液到瓷砖上，确保整个组织都被缓冲液覆盖。
6. 将紫外线灯（1.2安培设置）放在井正上方的板上。照明1分钟以释放条形码，同时保持所有材料冰藏。
   注意：使用紫外线灯时请佩戴防护性紫外线眼镜。
7. 关闭紫外线灯，将瓷砖放在冰上孵化7.5分钟。培养期间，取出Trekker 10 x 10洗涤室，并在1号和2号腔室填充400微升冷Trekker核洗缓冲液，取样时冰上样品。
8. 用镊子小心地提起瓷砖，不要碰到珠子，然后在1号房间里清洗瓷砖5秒。在2号房间清洗瓷砖5秒。小心地将瓷砖放入12孔板中的冰井中。组织切片应涂成蓝色且易于辨认。

2. 组织解离与细胞核分离

1. 对组织注射175微升Invent Minute缓冲液。再重复3次，总共达到700微升。每次涂抹时，瞄准瓷砖的不同部位，将整块组织从瓷砖上剥离。
   注意：避免因刮花瓷砖或珠子脱落而污染。
2. 继续通过从井侧吸取缓冲液，将缓冲液喷洒到被组织覆盖的瓷砖区域，同时尽量保持板材冰敷，从而将组织与瓷砖分离。重复直到瓷砖上没有组织残留。当所有组织从瓷砖上取出后，小心地用镊子将磁砖转移到空井中。
3. 使用P1000移液器在同一孔中机械解离核，重复研磨。反复操作，直到没有可见的组织块残留。
4. 小心地将细胞核悬浮液转移到带有Invent Minutul单核分离套件中神经组织/细胞收集管的滤芯。在-20°C下，打开盖子孵育10分钟。盖上滤芯，立即在冷藏微型离心机中以13,000 x g 离心30秒。
5. 丢弃滤芯，轻柔地移液10–20次，重新悬浮沉淀。在预冷离心机和摆桶中以600 x g 旋转管子5分钟。小心去除上清液，并将沉淀重新悬浮在200微升Trekker缓冲液C中。
6. 将1毫升冷的Invent Minute缓冲液B加入1.5毫升低结合的Eppendorf管，并缓慢地将200微升的核悬浮液覆盖在Minute B上，缓慢地喷出，避免层层混合。用预冷离心机和摆桶以500 x g 旋转管子10分钟。小心去除乳白色层和上清液。
7. 用24微升Trekker缓冲液C轻柔地重新悬浮核，然后对分离核进行质量控制测量。

图2：孤立核的质量控制评估。 小鼠脑组织中分离细胞核的代表性明场图像。核被染色为0.4%的锥蓝，并以40倍放大率成像，以评估核完整性及碎片存在。左侧显示的核制备显示了高质量、完整的核，适合下游检测，而右侧的制备显示了质量较差、组织聚集体部分溶解的核。受损或破裂的核状物通过填充箭头表示。比例尺为100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 分离核的计数和质量控制测量

1. 计数核时，将2微升核悬浮液放入8微升Trekker缓冲液C中。将10微升稀释的核悬浮液与10微升AO/PI染色溶液混合。按照制造商的说明数核。
2. 为评估分离核的质量，将2微升核悬浮液稀释至8微升4%的锥蓝溶液中。用40倍倍的荧光显微镜检查核，检查核膜形态和非核碎片的完整性（见图2）。
3. 立即进行单核CUT&Tag多组实验（H3K27ac + 基因表达上的CUT&Tag）检测。
   注意：如果回收了至少3万个高质量核，请继续下一步。

4. CUT&Tag 在孤立核上的标记

1. 准备CUT&Tag孵化缓冲液I。将其冰敷。
2. 制备由引导酶（TAG）激活的初级抗体和转座酶。
   1. 将46.23微升CUT&Tag培养液I和1.33微升TAG酶加入冰上PCR管。在试管中添加最优量的原抗体。慢慢用移液法搅拌10次。
      注：在反应中添加了2.43微升抗H3K27ac抗体。抗体批块已通过大宗和 原位 CUT&Tag检测验证。通过体质检测优化TAG酶结合抗体量。最佳抗体定义为通过qPCR在阳性和阴性靶位点实现最大信噪比的最低浓度。
   2. 短暂旋转，将管子装到18转/分钟的旋转器上。在室温下孵育1小时。制成的混合物可以预先制作，并放在冰上保存长达5小时。
      注意：抗体-TAG培养可与细胞核分离同时进行或提前进行。
3. 用抗体-TAG酶偶联物孵育分离的细胞核。
   1. 在预冷离心机中用摆动桶以500 x g 旋转分离核管（步骤2.7）10分钟。去除上清液时不扰动沉淀，留下~5微升上清液。
   2. 加入25微升CUT&Tag孵育缓冲液I（步骤4.1），并轻柔移液10次重新悬浮。使用同一移液器尖端将细胞核转移到含有抗体-TAG偶联物的管子（步骤4.2.2）。用移液器轻轻混合10次，然后将管子放在温和的旋转器上。
   3. 在4°C下孵育一夜。
4. 第二天（第2天），准备1个CUT&Tag核缓冲液并冰敷。
5. CUT&Tag 标签
   1. 从旋转器上取回反应管（步骤4.3.3）。加入5微升CUT&Tag激活剂，并将混合物转移到新的1.5毫升管中。在37°C、550转/分钟的热搅拌器上孵育1小时。
   2. 取出管子，加入20微升CUT&Tag淬火缓冲液，并通过移液10次轻柔混合反应。用预冷离心机用摆桶在500 x g 下离心10分钟。在不扰动核团的情况下去除上清液，在管底留下~5微升的上清液。
   3. 加入100微升1X CUT&Tag核缓冲液，并通过轻柔移液10次重新悬浮核。用预冷离心机和摆桶以500 x g 旋转管子10分钟。去除85微升上清液，留下~15微升。通过轻柔且缓慢的移液管重新浮出10次。
6. 计数带标记核数及确定靶向数
   1. 将1微升标记的核悬浮液加入9微升磷酸盐缓冲盐水中，并与10微升AO/PI染色溶液混合。按照步骤3.1描述，计数带标记的核。
   2. 单细胞GEM生成时，使用目标核数的1.6倍以获得所需的捕获核数。
   3. 在预冷离心机中用摆动桶以500 x g 旋转管子10分钟，小心去除上清液，最终留下8微升的体积。

5. 标记核的单细胞条形码及条形DNA的预扩增

1. 将7微升ATAC缓冲液B加入8微升标记核，配合实验预期的靶核数。
   注意：请参见Chromium Next GEM单细胞多组ATAC + 基因表达试剂盒用户指南（CG000338 Rev G）中“GEM生成与条码”协议中Chromium X仪器的反应设置和操作详情。
2. 利用铬X仪器生成GEM和条形码。
   1. 向含有标记核的管子中加入60微升GEM主混合物。通过移液轻柔混合，并装入Chromium Next GEM芯片J的第1行。
   2. 准备单细胞多组凝胶珠，并在第2排装入50微升凝胶珠。向第3排井注入45微升分油。
   3. 将组装好的芯片J和垫片放入Chromium X仪器的托盘中，开始运行仪器。
   4. 从回收井的最低点缓慢抽取100微升GEMs，位于上排3。缓慢地将GEM注入冰上的新PCR管中，移液器尖端贴着孔壁。
   5. 将收集到的GEMs放入热循环器（盖子温度为50°C）中，按照以程孵育：一个37°C循环45分钟，一个25°C循环30分钟，4°C循环保持。
   6. 加入5微升淬灭剂，缓慢用移液法混合10次。
3. GEM孵育后清理与DNA纯化
   注意：更多详情请参阅Chromium Next GEM单细胞多组ATAC + 基因表达试剂盒用户指南（CG000338版G）的“GEM孵育后清理”协议。
   1. 在室温下向管内加入125微升粉色回收剂，轻轻倒置管子10次。短暂离心。缓慢地从管底取出并丢弃125微升的回收剂/分油（粉色）。
   2. 向管子中加入200微升Dynabeads净化液，并用移液法搅拌10次。在室温下孵育10分钟。将管子放在磁性支架上，直到溶液清空。去除上清液。
   3. 向沉颗粒中加入300微升新鲜制备的80%乙醇。培养30秒，去除上清液。向沉淀中加入200微升80%乙醇，培养30秒，并去除上清液。短暂旋转管子，然后放在磁铁上。去除剩余的上清液。
   4. 把磁铁管子从磁铁上取下来。立即加入50.5微升洗脱液I。通过移液混合，并在室温下培养1分钟。短暂旋转，将管子放在磁铁上，直到溶液溶解。将50微升清除的溶液转移到新管子中。
   5. 顺磁珠的DNA纯化
      1. 向每个样品加入90微升顺磁珠（1.8倍），通过彻底移液混合。在室温下孵育5分钟。短暂旋转，将管子放在磁铁上，直到溶液溶解。去除上清液。
      2. 向沉淀中加入200微升80%乙醇。孵化30秒。去除乙醇。再重复一次。
      3. 短暂旋转，将管子放在磁铁上。去除剩余的上清液。
      4. 把磁铁管子从磁铁上取下来。加入46.5微升缓冲液，通过移液混合。在室温下孵育2分钟。旋转后放在磁铁上，直到溶液变清。
      5. 将46微升纯化DNA转移到新管子。
4. 条码DNA的预扩增。
   1. 向每个样品加入54微升预放大混合物。用移液器混合并短暂离心。
   2. 在热循环器中孵育（盖子温度为105°C），按照以下步骤进行：一个72°C循环5分钟;一个98°C循环3分钟;共计7个周期，分别为98°C持续20秒，63°C持续30秒，72°C持续1分钟;一个72°C循环，持续1分钟;以及4°C的暂停。 在4°C下过夜保存。
   3. 第二天（第3天），按照步骤5.3.5描述，用顺磁珠（1.6倍）纯化预扩增的DNA。向管内加入80.5微升缓冲液，通过移液混合。在室温22°C下孵育2分钟。短暂旋转，将管子放在磁铁上，直到溶液溶解。
   4. 将80微升预扩增的DNA转移到新管子中。使用40微升生成CUT&Tag库。将剩余的预扩增DNA储存在4°C。
      注意：剩余的40微升预扩增DNA将用于基因表达和空间条码库。

6. CUT&Tag、基因表达和空间条码的库制备

1. scCUT&Tag库的准备
   1. 将40微升预扩增的DNA转移到新管子中，加入60微升样本指数PCR混合物。用移液器混合，短暂旋转。
   2. 在热循环器中孵育（盖子温度为105°C），按照以下步骤进行：一个98°C循环周期，持续45秒;共计12个周期，分别为98°C20秒、67°C30秒、72°C20秒;一个72°C循环，持续1分钟;保持时温度为4°C）。
      注意：最佳周期数取决于起始核数和被分析的组蛋白标记。实验中H3K27ac标记使用了十二次放大周期。
   3. 双倍尺寸选择与顺磁性珠DNA纯化（0.6X，1.55X）
      1. 向每个样品加入60微升顺磁性珠（0.6X），通过彻底移液混合。在室温下孵育5分钟。短暂旋转，将管子放在磁铁上，直到溶液溶解。
      2. 将150微升上清液转移到新管子。向每个样品（上清液）加入95微升顺磁性珠（1.55X），并通过移液法混合。在室温下孵育5分钟。将管子放在磁铁上，直到溶液变清。去除上清液。
      3. 向沉淀中加入300微升80%乙醇。等30秒。去除乙醇。再重复一遍。短暂旋转，将管子放在磁铁上。去除剩余的上清液。
      4. 把磁铁管子从磁铁上取下来。向管内加入20.5微升缓冲液EB，并通过移液混合。在室温下孵育2分钟。旋转后放在磁铁上，直到溶液变清。
      5. 将20微升纯化并分标的CUT&Tag文库转移到新的试管中。
2. CUT&Tag库的质检
   1. 图书馆中DNA尺寸分布分析
      1. 将1微升纯化文库DNA与1微升低TE缓冲液混合。
      2. 将稀释后的DNA与片段分析仪的工作缓冲液混合，并使用高灵敏度HS NGS片段套件（1-6000碱基）（见图3A）在仪器上运行。
   2. 测序和定位前评估H3K27ac阳性基因组位点的富集情况。
      1. 将1微升纯化文库DNA与4微升无核酸酶水混合。使用1微升稀释文库DNA进行三个基因组位点的qPCR测量。
         注：对于H3K27ac CUT&Tag，阳性引物由 Actb-TSS位点设计，而靶向 T1-TSS和基因间位点的引物则作为负面对照²⁰ （见表1）。使用小鼠基因组DNA作为输入对照，以规范PCR效率（见图3B）。
      2. 共制备20微升反应混合物，分别为：1微升稀释文库DNA、2微升10微米引子混合物、10微升2倍SYBR绿色主混合液和7微升无核酸酶水。
      3. 使用相应的循环程序在CFX Opus实时PCR系统上运行预备好的qPCR板，以实现SYBR Green检测。
3. cDNA和空间条形码DNA的扩增。
   1. 将35微升预扩增的DNA（步骤5.4.4）转移到新管子，并加入65微升cDNA扩增反应混合物。用移液器混合，短暂旋转。用于cDNA和空间条形码DNA扩增的引物是Feature cDNA Primers 2。
   2. 在热循环器中孵育（盖子温度为105°C），按照以下步骤进行：一个98°C循环周期，持续45秒;共8个周期，分别为98°C持续20秒，63°C持续30秒，72°C持续1分钟;一个72°C循环，持续1分钟;保持时4°C。
      注意：最佳周期数必须根据细胞类型、RNA含量和起始核数确定。该实验进行了8个放大周期。
   3. 扩增cDNA的纯化
      1. 双倍尺寸选择和顺磁珠（0.6X、2.0X）DNA纯化，详见第6.1.3步。向每个样品加入60微升顺磁珠（0.6倍），并通过移液法混合。在室温下孵育5分钟。把磁铁放在溶液上直到它变清。
      2. 在不扰动沉淀的情况下，将75微升上清液转移到新管中保存。保持室温。
         注意：不要丢弃上清液，因为其中包含富含DNA的短片段，用于生成空间条码库。
      3. 去除沉淀中剩余的上清液。按照步骤6.1.3，用80%乙醇洗两次。
      4. 向管内加入40.5微升缓冲液，并通过移液法混合。在室温下孵育2分钟。短暂旋转后放入磁铁，直到溶液变清。
      5. 将40微升扩增的cDNA转移到新管子。将其冰藏起来，用于制备索引基因表达库。
         注意：此比例会增强典型cDNA大小的DNA含量。
   4. 扩增空间条码DNA的纯化
      1. 将70 uL顺磁性珠（2.0X）加入先前保存的75微升上清液（步骤6.3.3.2）。用移液器混合，短暂旋转。在室温下孵育5分钟。将管子放在磁铁上，直到溶液变清。去除上清液。
      2. 按照步骤6.1.3，用80%乙醇洗两次。
      3. 向管内加入40.5微升缓冲液，并通过移液法混合。在室温下孵育2分钟。短暂旋转后放入磁铁，直到溶液变清。
      4. 将40微升扩增纯化的空间条码DNA转移到新管子中。存储在−20°C，以便后续生成索引空间条码库。
   5. 片段分析仪对cDNA的尺寸进行分析。将1微升扩增的cDNA与1微升低TE缓冲液混合。按照步骤6.2.1的步骤，用片段分析仪检测稀释后的DNA。
   6. 索引基因表达库的制备
      1. 将10微升扩增的cDNA转移到新管中（步骤6.3.3.5）。加入25微升缓冲液EB和15微升碎屑混合物。用冰块移液混合。短暂旋转后，将管子转移到4°C的预冷热循环器中。
      2. 在热循环器中孵育（盖子温度为65°C），启动以下方案：一个32°C循环5分钟;一个65°C循环30分钟;保持时4°C。
      3. 双倍尺寸选择和顺磁性珠（0.6X、0.8X）DNA纯化，详见第6.1.3步。加入50.5微升缓冲液 EB，并通过移液混合。在室温下孵育2分钟。短暂旋转后放入磁铁，直到溶液变清。
      4. 将50微升样品转移到新管子中。加入50微升转接连接液，并用移液法混合。旋转一下。在热循环器中孵育（盖子温度为30°C），按照以程进行：一个周期20°C，持续15分钟，4°C保持。
      5. 通过顺磁性珠（0.8X）进行DNA纯化，详见步骤5.3.5。加入30.5微升缓冲液，通过移液混合。在室温下孵育2分钟。短暂旋转后放入磁铁，直到溶液变清。将30微升样品转移到新的试管中。
      6. 基因表达库的PCR索引。每个样品加入50微升的安培混合比，并加入20微升的双指标TT组A。
      7. 在热循环器中孵育（盖子温度为105°C），按照以下步骤进行：一个98°C循环周期，持续45秒;共计11个周期，分别为98°C持续20秒，54°C持续30秒，72°C持续20秒;一个72°C循环，持续1分钟;保持时4°C。
         注意：最佳周期数需根据细胞类型、RNA含量和起始核数确定。该实验共使用了11个放大周期。
      8. 双倍尺寸选择和顺磁性珠（0.6X、0.8X）DNA纯化，详见第6.1.3步。向管内加入35.5微升缓冲液，通过移液混合。在室温下孵育2分钟。短暂旋转后放入磁铁，直到溶液变清。
      9. 将35微升纯化并索引的基因表达文库转移到新管子中。
4. 基因表达库中DNA尺寸分布分析。将1微升文库DNA与1微升低TE缓冲液混合。按照步骤6.2.1的描述进行稀释DNA检测。（图3A）
5. 索引空间条码库的制备
   1. 制备总共100微升样品指数PCR混合物，具体如下：50微升AMP混合物（来自GEM-X单细胞3'特征条码套件）、25微升缓冲EB、20微升双指标板TT组A引物，以及1微升纯化空间条码DNA（步骤6.3.4.4），稀释于4微升EB缓冲液中。
   2. 在热循环器中孵育（盖子温度为105°C），按照以下步骤进行：一个98°C循环周期，持续45秒;共计7个周期，分别为98°C持续20秒，54°C持续30秒，72°C持续20秒;72°C持续1分钟;保持时4°C。
   3. 通过顺磁性珠（1.2X）进行DNA纯化，详见步骤5.3.5。向管内加入35.5微升的抗变缓冲液，并通过移液法混合。在室温下孵育2分钟。将管子放在磁铁上，直到溶液变清。
   4. 将35微升纯化并索引的空间条码库DNA转移到新管子。保存温度为4°C，最长可保存72小时，长期保存则为−20°C。
6. 检查索引空间条码库中的DNA尺寸分布。将1微升纯化文库DNA与1微升低TE缓冲液混合。按照步骤6.2.1（图3A）描述，用片段分析仪检测稀释后的DNA。

图3：索引图书馆的质量控制评估。 （A）扩增DNA和索引文库中的尺寸谱。DNA通过片段分析仪分析，以评估DNA质量和大小分布。图中展示了索引CUT&Tag文库的代表性剖面、用于基因表达和空间条码库制备的扩增DNA、索引基因表达库以及索引空间条码库。（B） 通过qPCR分析CUT&Tag文库，以评估H3K27ac阳性基因组区（即 ACTB）相对于H3K27ac阴性背景信号（即 T1 和基因间位点）的富集情况。正负区域的折叠差计算为富集²¹。该测定²⁰中，折叠富集值大于10被视为理想值。 请点击此处查看该图的放大版本。

7. 图书馆的排序

1. 在每个捕获核深度为5000对读取时对Trekker空间条码库进行排序。
2. 在每个捕获核深度为25,000对处对H3K27ac CUT&Tag库进行测序。
3. 在每个捕获的核中，至少对20,000对读读对对基因表达进行测序。

8. 生物信息学与数据分析

1. 使用Cell Ranger ARC v2.0.2，处理基因表达和CUT&Tag读取，格式为--min-atac-count=100，--min-gex-count=1000。使用Trekker管道v1.3.0，将Cell Ranger的ARC输出与Trekker条码信息集成，并使用默认参数分配空间位置。
2. 使用Signac进行质量控制。满足以下任一标准的细胞已从下游分析中剔除：对于CUT&Tag，总片段数≥1,000,000或≤100，TSS富集≤2;基因表达方面，总UMI计数≥100,000个或≤1,000个，检测到的基因总数≥10,284个或≤200个。
3. 使用scDblFinder进行基因表达，使用AMULET进行CUT&Tag，去除双重态。符合以下任一标准的细胞被归类为双重体：（1）scDblFinder得分≥0.6;（2） scDblFinder 评分≥ 0.3，AMULET ≤ 0.01;以及（3）双重体比例高的簇中。
4. 使用LogNormalize规范基因表达数据，使用TF-IDF规范CUT&Tag数据。计算RNA PCA和CUT&Tag LSI嵌入，使用染色质模态的LSI维度2–50。利用FindMultiModalNeighbors构建加权最近邻图，并基于该图生成UMAP嵌入。
5. 基于FindTransferAnchors和PCA投影映射策略，使用基于默认参数的修拉标签转移，注释量检后Trekker数据。参考参考文献使用了ABC图谱（20230630版）中的scRNA-seq数据。在人工筛选过程中，去除了与已知组织解剖结构不符的细胞类型预测。
   注意：生物信息学分析脚本可在GitHub上获取：https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

使用新鲜冷冻小鼠脑组织的冠状切片（厚度25微米，约覆盖10×10毫米空间瓦的70%），此处描述的工作流程持续产生50,100个高质量细胞核（SD = 12,200，n = 8），足以进行下游单细胞多组组分析（见图1）。在对组织切片进行Trekker空间条码后，通过温和组织解离分离细胞核，并用Invent单核分离套件进一步纯化。该方法使碎屑极少，核聚集水平低，产生适合单细胞检测的核制剂。分离核的代表性图像见 图2。

对于下游单核检测，包括CUT&Tag多组分析（CUT&Tag+基因表达），通常在这里处理约50,000个核。为最大化核回收，采用了简化、流畅的低输入CUT&Tag协议，采用直接抗体pA/Tn5靶向和标记，从而最大限度地缩短了孵育时间和洗涤步骤¹⁹。采用此方法，回收了约25,000个标记核，平均产率为48.3%（标准差=6.1，n=3）。这些核随后被用于单细胞条形编码，使用10倍基因组铬多组凝胶珠。在GEM生成中，目标约15,000个核，预计在高质量过滤后回收约10,000个空间指标核。基于Trekker空间条码解码，单细胞数据集中81.3%的核（SD = 9，n = 3）可以自信地分配到瓷砖中的空间位置。

空间 Trekker–CUT&Tag 多组工作流程生成三个索引库：CUT&Tag、基因表达库和空间条码库。预扩增的条形码DNA被分为两个组，分别根据凝胶珠上靶点的捕获化学反应用于文库制备。CUT&Tag文库直接从预扩增的DNA中扩增，并显示出CUT&Tag标记特征的片段大小分布，对应于无核小体和核小体DNA的标记（见图3A）。文库显示H3K27ac阳性Actb位点相较H3K27ac阴性基因组位点^20,21有良好富集（即68倍差异，超过此前染色质免疫沉淀测序分析H3K27ac²⁰的10倍阈值）（见图3B）。对于基因表达和空间条码库，预扩增的DNA先按照10倍基因组cDNA扩增协议进行扩增，然后利用顺磁珠纯化根据片段大小分为两个组别。索引空间条码库由较短片段的富集分数制备，并在预期片段大小处表现出明显峰值。基因表达文库显示出以扩增的cDNA片段为中心的特征性大小分布（见图3A）。

图4：小鼠脑组织中空间Trekker–CUT&Tag多组测定的单细胞和空间表示。 （A）通过单细胞分析鉴定细胞类型。统一流形近似与投影（UMAP）图显示了仅由H3K27ac CUT&Tag、仅基因表达及集成多组数据集（CUT&Tag+基因表达）导出的注释细胞群体。 （B） 空间 Trekker–CUT&Tag 多重组数据的空间表示。整合多组数据集中的细胞核通过Trekker条码分配到空间坐标，揭示了小鼠脑组织切片中细胞类型的解剖分布。 请点击此处查看该图的放大版本。

CUT&Tag 和基因表达文库的测序和映射通过使用 Cell Ranger ARC v2.0.2 按照 10x 基因组学指南完成，而空间条码库则根据 Takara Trekker 建议使用 Trekker v1.3.0 处理。建议的单单元ATAC-seq映射选项被应用于CUT&Tag库。仅生成了单核数据集，分别用于CUT&Tag、仅基因表达以及组合多组（CUT&Tag+基因表达）。使用Signac²²滤除了CUT&Tag总UMI（≥1,000,000或≤100）或基因表达（≥100,000或≤1000）的细胞。双重态预测通过结合 scDblFinder²³ 进行基因表达和 AMULET²⁴ 进行 CUT&Tag 预测。已移除符合以下标准之一的细胞：1）scDblFinder.score > 0.6;2）scDblFinder.得分介于0.3到0.6之间，amulet.评分<0.01。细胞类型注释使用了基于Allen Brain Cell Atlas参考数据²⁶的修拉FindTransferAnchors²⁵进行的。本研究的基因表达库中，每细胞UMI中位数为15,378个，每个细胞的中位数基因数为4,378个。CUT&Tag文库共检测到11,860个细胞，每个细胞中位数为6,631个高质量片段，TSS富集得分为7.66。在Trekker空间条码库中，92.43%的原子核被分配到空间位置，51.54%的原子核被分配到单一空间位置。原始测序数据和二次分析处理数据可通过GEO获取，编号为GSE327406。最后一个QC后注释的Seurat对象可在Zenodo上以入品编号19475899获取。具有单元类型注释的代表性UMAP嵌入见图4A。通过将单细胞条码与空间条码连接，单个细胞核被重新分配到其在组织中的空间位置，从而生成空间图（见图4B）。该图谱与相邻剖面观察到的解剖特征高度匹配，并与Allen Brain^{Atlas 27}中的冠状脑剖面相符，该图谱是小鼠大脑解剖的标准参考文献。在单细胞分辨率下对空间基因表达和H3K27ac谱的联合分析，使得识别主要脑细胞类型成为可能，并揭示了组织切片中细胞分布的解剖结构模式。

Discussion

该协议描述了一种空间Trekker–CUT&Tag多组工作流程，集成了空间条形码、低输入的H3K27ac CUT&Tag画像、同时捕获10倍基因组单细胞多组凝胶珠上的多个分子靶点，以及Illumina测序的下游文库制备。通过将空间索引与单细胞表观基因组和转录组读出结合，该方法解决了传统单细胞多组检测的根本局限，因为传统单细胞多组检测缺乏原生组织背景。本研究成功证明了空间CUT&Tag多组分谱（H3K27ac CUT&Tag+基因表达）的可行性，并为基因表达及调控靶点（如组蛋白标记和染色质相关蛋白）的空间共谱奠定了基础。

在工作流程的多个阶段进行严格的质量控制对于成功实施该工作流程至关重要（见图1）。虽然此处描述的程序从切片后的步骤开始，但组织切片本身的质量对于最佳效果至关重要。切片厚度应根据组织类型和预期细胞密度进行调整。在组织解离和细胞核分离过程中，最大化细胞核产额同时保持核完整性对基于Trekker的单细胞多组测定的整体性能至关重要。细胞核产率低可能源于组织解离不优、细胞核分离效率低下或切片厚度不足。核完整性差可能源于过度机械干扰、延长加工时间或过度溶解。细胞核分离是成功实现基于Trekker的单细胞多组工作流程的重要排查点。因此，强烈建议在启动基于Trekker的单细胞多组检测前，对细胞核分离方案进行组织特异性优化。分离的原子核应进行定量和定性评估。使用核染料计数可以估算产率，而显微镜检查则可评估核膜完整性、聚集情况及非核碎片的存在。文库制备完成后，应评估所有文库的片段大小分布及是否存在适配二聚体。对于CUT&Tag文库，应通过定量PCR评估目标基因组区在背景中的富集情况，提前判断测序前的检测特异性和整体文库质量。测序后的质量控制对于准确解读空间多组数据同样重要。应根据10x Genomics和Takara Trekker推荐的指南评估定位率、每核片段计数、转录起始位点富集、CUT&Tag的片段峰值得分、基因复杂度及每细胞读段深度等指标。对表观基因组和转录组模式的联合评估这些指标，有助于识别技术伪影，并确保空间、表观基因组和转录信息的可靠整合。

虽然本研究展示了基于Trekker的条码输入方法与单细胞CUT&Tag多组测定结合的可行性，但该方法也存在局限性。例如，该方法目前仅限于新鲜冷冻组织，其可行性仅在没有生物复制的情况下，用于单一组织类型（小鼠大脑）中对单一组蛋白修饰（H3K27ac）进行分析。此外，该方法依赖于两个专有商业平台（Takara Trekker和10x Genomics Next GEM Chromium单细胞多组）。还需对多种组织类型及更多表观遗传标记进行进一步评估，以评估该技术的更广泛适用性、性能、普遍性和可重复性。

总之，本文介绍的空间Trekker–CUT&Tag多组协议展示了单细胞对表观基因组和转录组特征进行空间解析的能力。通过将空间条形码与已建立的单细胞多组化学结合，它实现了完整组织结构中基因调控的机制性研究，并为未来空间生物学应用提供了强大平台。值得注意的潜在用途包括评估各种实验和环境刺激对特定细胞类型基因表达表观遗传调控的影响——例如，神经刺激对中枢和外周神经系统特定神经元类型的影响可以分析，或者在炎症性疾病和癌症中揭示浸润的促炎和抗炎免疫细胞对邻近细胞的影响。