本研究结合网络药理学与体内实验，探讨右归丸治疗前列腺炎的潜在作用。网络药理学分析及右归丸在大鼠前列腺炎模型中的治疗效果表明，右归丸的治疗作用可能与调控炎症反应相关，提示右归丸在前列腺炎中具有抗炎作用。
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本研究结合网络药理学与体内实验，探讨右归丸治疗前列腺炎的潜在作用。网络药理学分析及右归丸在大鼠前列腺炎模型中的治疗效果表明，右归丸的治疗作用可能与调控炎症反应相关，提示右归丸在前列腺炎中具有抗炎作用。
前列腺炎是一种常见的泌尿系统疾病，目前治疗选择有限。右归丸（YGP）显示出潜在的治疗价值，尤其在与炎症相关的疾病中。本研究旨在评估其疗效并探讨可能的作用机制。通过TCMSP数据库筛选右归丸的活性成分，筛选标准为口服生物利用度（OB ≥ 30%）和类药性（DL ≥ 0.18），并收集相应的靶点。从GeneCards数据库获取与前列腺炎相关的靶点，通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析鉴定共有的靶点。共鉴定出126种活性化合物和208个潜在靶点，其中180个为与前列腺炎相关的共有靶点。PPI分析显示TP53、IL6、AKT1、TNF和IL1B为关键枢纽基因。KEGG富集分析提示炎症相关通路参与其中，包括IL-17、TNF、MAPK和PI3K-Akt信号通路。通过前列腺内注射角叉菜胶建立大鼠前列腺炎模型。通过组织学检查以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）水平的测定来评估治疗效果。右归丸治疗改善了前列腺组织病理学表现，并在蛋白和mRNA水平上降低了TNF-α和IL-6的表达。这些结果表明，右归丸在前列腺炎中具有抗炎作用，但其具体的分子机制仍需进一步验证。
前列腺炎是一种前列腺组织发生炎症、肿胀和刺激的疾病1。该病约占全球泌尿科临床就诊病例的25%2。美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）将前列腺炎分为四类：急性细菌性前列腺炎、慢性细菌性前列腺炎、慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）以及无症状性前列腺炎3。其中，CP/CPPS是最常见的类型，与持续性炎症和免疫调节紊乱密切相关。尽管对前列腺炎炎症机制的理解已有所进展，但目前的治疗策略仍较为有限，尤其是针对非细菌性亚型的治疗4,5。抗生素在临床实践中被广泛使用，但其在非细菌性前列腺炎中的疗效仍存在很大争议6。其他治疗方法，如α-受体阻滞剂和非甾体抗炎药（NSAIDs），主要旨在缓解症状，但疗效往往不理想，且存在不可忽视的胃肠道紊乱、体位性低血压等风险7,8,9,10。这些局限性凸显了开发能够有效调节前列腺炎炎症反应的替代治疗策略的迫切需求。
传统中医药可能具有更广泛的治疗益处，且安全性与耐受性更佳11右归丸（YGP）是《景岳全书》中记载的经典方剂，数百年来在临床上用于温补肾阳并缓解相关病症12先前的研究报道，其部分成分具有抗炎活性13,14,15,16临床证据表明，YGP 能有效缓解前列腺炎症状，但其潜在机制尚不明确17网络药理学是一种强大的整合性方法，结合了系统生物学与药理学，用于揭示传统医学的复杂作用机制18. 据推测，YGP 可能通过调控多个靶点及与炎症相关的通路发挥抗炎作用。这些预测随后通过一项 体内 前列腺炎模型，通过注射卡拉胶诱导前列腺炎。模型建立后，对动物给予YGP治疗。采集前列腺组织，进行苏木精-伊红（HE）染色以进行组织病理学检查，并采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）对炎症标志物进行定量评估。
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所有动物实验均经北京中医药大学机构动物护理和使用委员会批准（BUCM-2024110107-4103）。
活性成分及靶点的收集
右归丸（YGP）由地黄（Rehmannia glutinosa）、附子（Aconitum carmichaelii）、肉桂（Cinnamomum cassia）、山药（Dioscorea opposita）、山茱萸（Cornus officinalis）、菟丝子（Cuscuta chinensis）、当归（Angelica sinensis）、杜仲（Eucommia ulmoides）、鹿角胶（Cervi Cornus Colla）和枸杞子（Lycium barbarum）组成。将这些中药名称输入中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），以获取其化学成分。采用口服生物利用度（OB ≥ 30%）和类药性（DL ≥ 0.18）作为筛选条件，筛选出活性化合物19,20,21。各化合物对应的靶点从TCMSP数据库中获取，并通过UniProt数据库标准化为基因符号。通过GeneCards数据库，以"prostatitis"为关键词检索与前列腺炎相关的靶点，筛选出相关性评分高于平均值的基因纳入本研究。
YGP 抗前列腺炎调控网络的构建
确定并定义了 YGP 相关靶点与前列腺炎相关靶点的交集，作为一组潜在治疗靶点。将这些靶点导入 Cytoscape（版本 3.9.1）以构建化合物-靶点-疾病网络。利用 CytoHubba 插件进行网络拓扑分析，并基于最大团中心性（MCC）值确定关键组分22。
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析
将交集靶点导入 STRING 数据库（版本 11.5），物种设定为 Homo sapiens。设定最低相互作用评分 ≥ 0.7，并隐藏无连接的节点23。将相互作用数据以 TSV 格式导出，并在 Cytoscape 中进行可视化。进一步利用 CytoHubba 插件基于度中心性识别枢纽基因。
KEGG通路与GO富集分析
将共有靶点上传至Metascape平台，进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。设定输入物种与分析物种均为Homo sapiens。进行KEGG通路富集分析，并根据已发表文献及数据库注释中与前列腺炎的相关性对通路进一步筛选。剩余通路依据其Log P值进行排序。利用气泡图对富集最显著的KEGG通路进行可视化展示。
分子对接
根据度中心性从蛋白质-蛋白质相互作用网络中筛选关键靶点，并基于MCC值从YGP-前列腺炎调控网络中鉴定活性化合物，用于后续对接分析。蛋白质结构以PDB格式从AlphaFold蛋白质结构数据库获取，配体结构以mol2格式从TCMSP数据库下载24。分子对接采用CB-Dock2在线平台进行25。对接前，蛋白质结构通过自动去除水分子、添加氢原子以及补全缺失残基进行预处理。记录结合亲和力，并使用GraphPad Prism（版本10.1.2）生成热图。利用ChimeraX可视化结合能最低的配体-蛋白质复合物的三维结构，使用LigPlus生成二维相互作用图。
YGP水提取物制备
YGP 的草药成分按传统配方比例制备，包括 24 g 炮制后的根 的 地黄 （熟地黄），6 克炮制过的侧根 Aconitum carmichaelii （附子），6 g 的树皮 Cinnamomum cassia （肉桂），12 g 莪术根茎 Dioscorea opposite （山药），9 克果实 山茱萸 （山茱萸），12克种子 Cuscuta chinensis （菟丝子），12 克炮制过的鹿角胶 鹿角胶 （鹿角胶），12 g 鹿角胶果实 枸杞 （枸杞），9 克的根部 当归 （当归）和12克的皮 杜仲 （杜仲）。除以下列出的药材外，其余均需 乌头 和 鹿角胶 用6倍于其总重量的蒸馏水浸泡30分钟，同时 乌头 用六倍于其重量的蒸馏水分别浸泡。 乌头 先用电动加热装置煎煮1小时，随后加入其余药材（除...外） 鹿角胶，加水煎煮两次，每次1小时。 鹿角胶 随后在60–70 °C水浴中加热至完全溶解并混入提取物中。冷却后，煎液经双层纱布过滤，分装，于-20 °C冷冻48小时，再经冻干获得粉末状提取物。
动物模型与实验设计
雄性Sprague-Dawley大鼠（8周龄，200–220 g）饲养于特定病原体阴性环境中，光照/黑暗周期为12小时，自由摄食和饮水。经过1周适应性饲养后，将大鼠随机分为三组（每组n = 6）：对照组、模型组和YGP组。通过前列腺内注射3%卡拉胶溶液建立慢性前列腺炎模型26。简言之，使用异氟烷（诱导浓度3–4%，维持浓度1.5–2%）对大鼠进行麻醉，经腹部正中切口暴露前列腺，向每侧腹叶前列腺注射25 µL的3%卡拉胶溶液。对照组仅接受前列腺内注射生理盐水（生理氯化钠溶液）。术后连续3天肌肉注射青霉素（2.5 × 105 U/kg）。
YGP 冻干提取粉末由煎剂制备而成，并用0.9%无菌生理盐水重悬，制成均匀混悬液用于灌胃（10.54 g/kg/天）。YGP组大鼠灌胃给予YGP提取物（10 mL/kg），对照组和模型组大鼠给予等体积的0.9%无菌生理盐水。4周后，大鼠以戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉，按照伦理指南处死后采集前列腺组织。
组织病理学检查
前列腺组织经4%多聚甲醛固定24小时，梯度乙醇脱水（75%乙醇4小时、85%乙醇2小时、90%乙醇2小时、95%乙醇1小时、无水乙醇1小时），二甲苯透明，石蜡包埋。随后将切片（4–5 µm）按照标准程序进行苏木精-伊红（HE）染色27。简言之，切片经脱蜡、水化后，用苏木精染色，分化，再用伊红复染。染色完成后经脱水、封片，于光学显微镜下观察，进行组织病理学评估。
组织病理学炎症通过半定量评分系统进行评估，依据包括炎性细胞浸润、成纤维细胞增殖、腺泡形态及分泌状态。炎性细胞浸润评分标准为：0分（无浸润）、2分（轻度浸润）、4分（中度浸润）和6分（重度浸润）。成纤维细胞增殖程度分为：0分（无增殖）、1分（轻度）、2分（中度）和3分（重度）。腺泡形态评估标准为：0分（腺泡腔较大）、1分（腔径中度缩小）、2分（腔径明显缩小）、3分（腺泡闭塞或消失）。分泌状态评分标准为：0分（分泌物丰富）、1分（分泌物中等）、2分（分泌物稀少）和3分（无分泌物）。总组织病理学评分由上述四项参数得分相加得出，评分越高，表明前列腺组织损伤和炎症越严重28。
ELISA
前列腺组织（100 mg）用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中进行匀浆。匀浆液在 4 °C 下孵育 30–120 分钟，随后在 4 °C 下以 5000 × g 离心 15 分钟，收集上清液。采用 ELISA 试剂盒按照制造商说明书检测 TNF-α 和 IL-6 的蛋白水平。将标准品和样品加入 96 孔板中，在 37 °C 下孵育，随后依次与生物素标记的抗体和酶结合物孵育。洗涤后加入底物溶液显色，并用终止液终止反应。使用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度。根据标准曲线计算细胞因子浓度。
qRT-PCR
采用基于柱的方法从前列腺组织中提取总RNA，并通过测定260 nm和280 nm处的吸光度来定量并评估其纯度。使用逆转录试剂盒在42 °C下反应15分钟，将RNA样本逆转录为cDNA。qRT-PCR在热循环仪中进行，反应条件如下：95 °C预变性3分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性10秒和60 °C退火/延伸30秒。本研究所用引物序列见补充表1。荧光信号在退火/延伸阶段采集。TNF-α和IL-6的表达水平以内部参照基因GAPDH进行标准化。相对基因表达量采用2−ΔΔCt法计算。
统计学分析
所有数据均以均值 ± 标准差（SD）表示。统计学分析使用 GraphPad Prism 软件（版本 10.1.2）进行。在分析前对数据分布进行正态性检验。多个组之间的差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验（Tukey's post hoc test）进行多重比较。以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。
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生物活性成分及靶基因的鉴定
共鉴定出126种符合筛选标准（OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18）的玉桂汤（YGP）生物活性成分，对应208个预测靶基因。GeneCards数据库共获得与前列腺炎相关的基因9,845个。Venn分析显示，YGP预测靶基因与前列腺炎相关基因之间存在180个交集基因，提示这些共有靶基因可能介导了YGP对前列腺炎的治疗作用（图1）。各药材所含成分的分布情况如下（括号内数值表示从各药材中鉴定出的成分数量）：Angelica sinensis（3）、Eucommia ulmoides（26）、Aconitum carmichaelii（7）、Lycium barbarum（37）、Dioscorea opposita（12）、Cornus officinalis（15）、Rehmannia glutinosa（2）、cortex cinnamomic（1）和Cuscu...
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前列腺炎在病理学上定义为前列腺实质或间质中炎性细胞数量增加28,29。在一项针对超过500万名韩国男性、随访长达九年的研究中，Kim等人通过多变量分析证实，前列腺炎显著增加患前列腺癌的风险30。然而，目前的临床管理手段仍然有限，尤其是对于非细菌性前列腺炎，其治疗方案仍不理想31,32。在此背景下，植物疗法因其具有抗炎特性及相对良好的安全性而受到越来越多的关注。在本研究中，通过网络药理学分析发现，槲皮素（quercetin）是YGP中的关键活性成分之一，该结果与既往报道中强调其在炎症相关疾病中的重要作用一致33。分子对接分析进一步表明，槲皮素、豆甾醇（stigmasterol）和山奈酚（kaempferol）等关键化合物与核心靶点蛋白（如AKT1和TP53）具有良好的结合亲和力。这些结果提示活性成分与靶点蛋白之间...
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作者在本研究中无利益冲突报告。
作者衷心感谢中央高校基本科研业务费专项资金（2022-JYB-JBZR-037）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | Beyotime | P0099-3L | |
| AlphaFold 蛋白质结构数据库 | AlphaFold 蛋白质结构数据库 | https://alphafold.ebi.ac.uk/ | |
| BeyoFast SYBR Green qPCR Mix (2X) | Beyotime | D7260 | |
| 生物信息学在线平台 | 生物信息学在线平台 | http://www.bioinformatics.com.cn/ | |
| 卡拉胶 | OriLeaf | S30559 | |
| CB-DOCK2 | CB-DOCK2 | http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php | |
| Cytoscape | Cytoscape | https://cytoscape.org/ | |
| GeneCards | GeneCards | https://www.genecards.org/ | |
| 苏木精-伊红（H&E）染色试剂盒 | Beyotime | C0105S | |
| Metascape | Metascape | https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1 | |
| 中性树胶 | Servicebio | WG10004160 | |
| 石蜡（用于包埋） | Servicebio | RP-15 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物（100X） | Epizyme | GRF101 | |
| 大鼠 IL-6 ELISA 试剂盒 | Beyotime | PI328 | |
| 大鼠 TNF-α 检测试剂盒 | Beijing 4A Biotech Co., Ltd | CRE0003 | |
| RNAeasy 动物长链 RNA 离心柱提取试剂盒 | Beyotime | R0026 | |
| STRING | STRING | https://string-db.org/ | |
| TCMSP | TCMSP | https://www.tcmsp-e.com/#/database | |
| Uniprot | Uniprot | https://www.uniprot.org/ |