头戴光学透明颅骨（HOTS）窗口，用于对小鼠皮层进行深度经颅成像

摘要

该协议描述了基于优化的两步头骨清除程序的头戴光学透明头骨（HOTS）窗口。该方法可实现高度透明的头骨，使成年小鼠大脑皮层可通过双光子成像，深度可达~800微米。

摘要

成年小鼠大脑皮层的高分辨率双光子成像受头骨光散射的严重限制，这会削弱信号并限制体内成像深度。尽管已开发出颅骨清除方法，通过完整颅骨实现皮层的光学访问，但其实际性能受限于清理时间有限和清理组合不佳。在这里，我们介绍了实现头戴式光学透明头骨（HOTS）窗口的详细协议。该方法使用头戴式头盖以保持头骨表面的清除液，从而避免长时间麻醉或身体约束，并使小鼠在清醒且自由行为时能持续数小时清理头骨。此外，还进行了两步清除程序，使用试剂（HOTS-S1：10% wt/v EDTA，15% wt/v D-甘露糖，10% wt/v 磺烷，0.5% wt/v Tween 20;HOTS-S2：70% wt/v D-甘露糖，5% wt/v 磺烷，0.5% wt/v Tween 20）通过系统化学筛选优化。我们提供逐步方案，包括颅骨暴露与稳定、头戴帽的制作与安装、清除试剂的送达与补充，以及后续的影像准备。在6周大的小鼠（~20克）中，HOTS协议常规生成高度透明的头骨，支持对皮层结构进行双光子成像，深度可达pia下方~800微米，性能接近开放颅窗。HOTS窗口支持Thy1-GFP-M小鼠的结构成像，以及Thy1-GCaMP6s小鼠的功能性钙成像。我们认为，作为一种便捷且微创的方法，HOTS窗口将显著促进体内的深经颅成像以及光遗传学、光药理学及其他基于光的操作。

引言

皮层神经元的生命体监测对于理解大脑结构^{和功能至关重要}。双光子显微镜（TPM）是此类体内研究的关键工具 ^2,3。然而，其成像质量和深度受到来自覆盖^皮层4,5的不透明颅骨强烈散射的光线严重限制。

开放式颅骨⁶和薄颅窗^7,8大幅改善了对皮层的光学访问，且被广泛使用，但两种方法都有固有局限性。开颅窗可能引发急性脑损伤和炎症反应 ^9,10，而颅骨变薄技术要求高且难以实现均匀厚度^11,12。

体内颅骨光学清除技术提供了一种微创替代方案，使成年小鼠能够实现轴突分辨率的双光子成像。然而，可实现的成像深度仍然有限（通常位于pia下方150–400微米）12,13,14,15。实际上，颅骨清理通常限制在麻醉下短时间内，且头骨固定固定，且系统优化颅骨骨骼成分的清除鸡尾酒^{尚未被充分探索。}

为克服这些限制，我们此前开发了一种头戴式光学透明头骨（HOTS）窗口，支持在自由行为的小鼠中长时间离线清理头骨（见图1A）¹⁶。该方法采用了两步清除程序，使用试剂（S1和S2），这些试剂在我们之前的研究¹⁶中通过系统化筛选进行了优化。我们之前的研究¹⁶已报告了HOTS窗口清除效果、可逆性、生物安全和体内成像性能的系统优化，并显示HOTS处理后显示了良好的星相胶质反应。本文介绍了建立HOTS窗口以实现成年小鼠深度经颅双光子成像的逐步方案。在代表性准备中，成像深度可达pia下方~800微米，几乎与开放颅骨窗可达的深度相当。HOTS窗口支持Thy1-GFP-M小鼠的深度结构成像，以及清醒的Thy1-GCaMP6s小鼠的功能性钙成像。

方案

所有动物护理和实验程序均经广东省动物护理与使用委员会批准，并按照中国科学院深圳高级技术研究院动物实验伦理委员会的指导方针实施。本协议中使用的试剂和设备列于 材料表中。

注意：该方案针对6周大小鼠（体重~20克），其头骨厚度约为100微米。

1. 头骨清除液的制备

1. 制备颅骨清除液S1（10% wt/v EDTA，15% wt/v D-甘露糖，10% wt/v 磺烷，0.5% wt/v Tween 20;罗德岛：1.38;最终pH值：7.0-7.4）
   1. 秤重0.35克氢氧化钠（NaOH）。将它加入20毫升去离子水中，放入烧杯中搅拌至完全溶解。这会提高溶液的pH值，促进EDTA的后续溶解。
      注意：NaOH具有腐蚀性。请佩戴适当的个人防护装备（手套、实验服、护目镜），并在化学排气柜内处理。
   2. 向氢氧化钠溶液中加入4克乙二胺四乙酸（EDTA）。将烧杯放入40°C的水浴中，持续搅拌直到EDTA完全溶解。
   3. 将混合物冷却至室温。在溶液中加入6克D-甘露糖、4克磺烷和0.2克Tween 20。在室温下搅拌，直到所有成分完全溶解。
   4. 加入去离子水，使最终体积达到40毫升。充分混合以获得S1。
      注意：S1可以在室温下保存数月。
2. 准备颅骨清除液S2（70% wt/v D-甘露糖，5% wt/v 磺烷，0.5% wt/v Tween 20;最终 RI：1.44;最终 pH：7.0-7.4）
   1. 称重28克D-甘露糖、2克磺烷和0.2克Tween 20，然后转移到一个干净的烧杯中。
   2. 将去离子水加入约30毫升，并在室温下搅拌，直到所有组分完全溶解。
   3. 加入去离子水，使最终体积达到40毫升，并充分混合以获得S2。
      注意：温和加热（25–30°C）和持续搅拌加速D-甘露糖的溶解。S2可以在室温下储存数月。

2. 手术准备

1. 所有手术器械都用高压灭菌消毒，并用75%酒精彻底消毒手术室。
2. 通过腹腔内注射1%戊巴比妥钠（每20克体重150–200微升）麻醉小鼠。
   注意：其他可逆麻醉剂也可作为戊巴比妥钠的替代品。
3. 使用脚趾夹压反射测试监测麻醉深度，并确保小鼠在手术开始前已完全麻醉。
4. 将鼠标置于立体定位框架中，并用耳杆固定头部。
5. 使用热敷垫保持体温在37°C。
6. 在双眼涂抹眼药膏以防止角膜干燥。
   注意：密切监测呼吸和反射，以避免麻醉过量和呼吸抑制。

3. 手术与头板安装

1. 颅骨暴露与清洁（图1Ba）
   1. 用细小镊子和外科剪刀切除整个背部颅骨表面的头皮。侧面修剪皮肤，露出颞肌边缘，向后部靠近颈部肌肉。
   2. 用细镊子轻轻切除颅骨表面的骨膜。
   3. 用湿润的棉花头涂抹器清洁头骨表面，并用轻柔的气流吹干头骨。
   4. 如果需要精确定位大脑皮层的功能区，使用立体定向装置在颅骨表面标记1毫米间距的参考点。
2. 牙科胶水和头板的应用（图1Bb）
   1. 按照制造商的说明准备牙胶。建议使用附着力强、耐久性良好、适合长期固定的牙科胶水，以确保牢固附着。
   2. 在暴露的颅骨表面及周围组织上涂一层薄薄的牙科胶水以保护，保持清理窗口区域不涂覆。
      注意：将牙胶的粉末和液体成分以1：1的体积比例混合后，等待大约10秒，使胶水附着在牙签尖端后再施用。这降低了其流畅性，提升了操控性。施工时，将水泥从窗外向指定的清理窗口涂抹，并保持窗户区域完全无水泥。清除区域由颅骨表面的牙齿密封剂（牙科胶水和软衬里材料）边界定义。因此，其大小可以调整，但受限于颅缝线或头盖的大小。在一个半球的常见应用中，清理区域直径通常为~3–5毫米。
   3. 用牙科胶水将一个小型钛合金头板固定在颅骨上（用于后续影像检查时固定在定制支架上）。
      注意：头部固定可采用不同设计的头板。在这项研究中，成功使用了市售的头板和定制的双孔钛板。无论设计如何，头板应提供足够的机械稳定性以支持后续成像，且不应阻挡预期的清空/成像窗口。

4. 创建HOTS窗口

1. 用自固化的牙科软衬材料封闭颅骨（图1Bc）
   1. 当牙科胶水完全固化约5分钟后，在除清窗区域外的水泥层上覆盖一层自固化的软衬里材料，形成连续的密封。
      注意：软衬材料提升密封性，减少长时间暴露于净化剂时的泄漏。
   2. 将自固化的牙科软衬材料平滑地围绕计划的清空窗口边缘塑形，为盖子创造平坦的密封面。
2. 安装盖子（图1Bd）
   1. 切割一次性塑料移液器（聚乙烯，PE）的头，形成一个小型圆柱形盖子，顶部封闭，底部开放。PE表现出良好的化学稳定性，在清除过程中与S1或S2清除液无明显降解或反应。
      注意：从1 mL转移移液球头切下的盖子通常直径约为12毫米，高度约为10–14毫米。
   2. 将盖子盖在指定的清空窗口区域，轻轻按压在柔软的衬里材料上。
      注意：盖子比清理区域大，盖子下方未用于清除区域的部分头骨可以用牙齿密封剂保护头骨不被清除。
   3. 用额外的软衬里材料固定盖子底部，确保盖子与头骨的连接处完全密封。
   4. 使用1毫升注射器配26克针头，在帽壁上穿出一个或多个小孔，作为注射和抽取清除溶液的通道。
   5. 让软衬材料完全固化。确认电容牢固固定，且接口处没有明显缝隙。
   6. 将鼠标从立体定位框架中取出，放入温暖的笼子中，直到麻醉完全恢复。
      注意：这是一个合适的停车点。在牙胶和软衬里材料完全固化后，进行颅骨清理手术。在我们的诊所中，HOTS窗口可以在下午安装，第二天早晨在小鼠完全康复后进行清理头骨。或者，可以在HOTS窗户安装后约15分钟开始清理头骨。在HOTS窗户安装过程中，头骨结构保持完整，尽管骨膜被移除。

5. 清醒自由行为小鼠的头骨清理

注意：在清理阶段，老鼠保持清醒，在笼子内自由活动。仅在溶液注射和头戴帽更换时使用短暂异氟醚麻醉。

1. S1的初始加载
   1. 将小鼠置于诱导舱中，并以3–4%异氟醚在空气中以300–500毫升/分钟的流量诱导短暂麻醉，直到小鼠变得无法活动。未进行维持性麻醉。
   2. 轻柔地固定鼠标，并用手固定头戴的盖子。
   3. 使用1毫升注射器，配合26克针头，缓慢注射约1毫升S1到头顶盖子内。
   4. 把老鼠放回家用笼子，让S1对头骨产生2小时的反应。
      注意：在S1和S2孵化期间，将老鼠单独关在标准笼子中。
2. 令人耳目一新的第一季
   1. 在初始S1加载后2小时，再次用异氟醚短暂麻醉小鼠。
   2. 用1毫升注射器从盖子抽取S1。
   3. 用1毫升注射器重新填充新鲜的S1。
   4. 把鼠标放回笼子，让S1再行动2小时。
   5. 在初始加载后4小时重复步骤5.2.1–5.2.4，进行第二次S1替换。
   6. 第二次替换后，让S1继续作用，直到S1的总曝光时间达到6小时。
      注意：该方案（1毫升S1,6小时）针对6周大小鼠（~20克）进行了优化。对于头骨较厚的老年动物，S1的孵化时间可能会逐渐延长。任何调整都必须伴随对动物福利和最终影像质量的密切监测，以避免颅骨过度软化。
3. S2的应用
   1. S1治疗6小时后，用异氟醚短暂麻醉小鼠。
   2. 用1毫升注射器从盖子中抽取S1，换成0.7毫升的S2。
   3. 将鼠标放回笼子，让S2作用于头骨1小时，以进一步增强透明度并提供折射率匹配。
      注意：在此条件下，S1和S2的合并清理阶段通常在7小时内完成（6小时S1+1小时S2）。成功清除的标志是颅骨表面可见透明且无出血。头骨清理后可能略微变软;用细镊子轻轻触摸时，应表现出轻微顺从性，但结构保持完整。避免对颅骨表面施加过大压力。

6. 成像准备

1. 麻醉与头部固定用于成像
   1. S2培养结束时，通过腹腔内注射1%（w/v）戊巴比妥钠，剂量为150–200微升，剂量为20克体重，使小鼠麻醉。
   2. 用脚趾夹反射测试确认麻醉效果充足。
   3. 通过将钛合金头板拧到定制设计的头座上来固定鼠标头部。
   4. 在影像检查时，在双眼涂抹眼药膏以防止干裂。
   5. 使用加热垫保持体温在~37°C。
2. 暴露清理后的颅骨表面（图1Be，Bf）
   1. 用注射器从盖子中抽取S2溶液。
   2. 用细剪小心剪断塑料盖，用镊子取出，避免对头骨施加过大力道。
   3. 轻轻撕下包围清空窗的柔软内衬材料，完全露出清空后的头骨区域。
   4. 在成像过程中，直接在清理后的颅骨上滴一小滴S2溶液，作为折射率匹配的浸渍介质。
      注意：本研究使用标准水浸物镜，包括16×/NA 0.8物镜（N16XLWD-PF，尼康）和25×/NA 1.1物镜（N25X-APO-MP，尼康）。使用S2作为浸入介质时，如果有，调整物镜的校正圈，以降低球面像差。在这些实验中，清理后的头骨保持了足够的光学清晰度，支持大约2小时的双光子成像，树突状脊柱观察期间图像质量没有明显下降。大约两天后，需要重新清除以进行进一步成像，且重新清除时间明显缩短于初始清除，使同一动物能够高效重复成像。
3. 清醒头部固定成像（可选）
   注意：对于清醒成像，实验前请让老鼠习惯于固定头部。用异氟醚短暂麻醉小鼠，然后每次将植入的头板固定在支架上15–30分钟，重复2–3天。
   1. 使用短暂的异氟醚麻醉以促进处理。只需将植入的头板固定在支架上，使身体能够在行车轮或平台上自由移动。
   2. 按照步骤6.2.1–6.2.4暴露清理后的颅骨表面，并在影像检查前涂抹S2。

7. 恢复

1. 影像检查后，轻轻吸出并去除颅骨表面残留的S2溶液。
2. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）多次冲洗清理的头骨区域，以促进头骨本有不透明状态的逐步恢复。
3. 用无菌棉签轻柔干燥颅骨及周围组织的残留液体，避免对骨骼造成机械损伤。
4. 如果动物在后续实验中被保留活体，应在颅骨窗户上涂一层生物相容性密封剂Kwik-Cast（WPI），以保护骨骼在存活期。
5. 让保护层完全固化。
6. 把老鼠从头部支架上取下来，放进温暖的笼子里。观察动物直到完全从麻醉中恢复，然后将其送回原处笼子。

结果

按照该方案，头戴式光学透明颅骨（HOTS）窗口实现了成年小鼠的深度经颅双光子成像，同时保持颅骨完整性。成功的准备表现有两个关键结果：（1）清除后皮层血管通过颅骨清晰可见（见图1Bf），（2）清除后的颅骨在轻微压力下出现轻微凹陷，表明有效的脱钙和胶原蛋白松弛。HOTS窗必须位于完整颅骨上方，远离缝线，以避免毛细血管出血，这是HOTS窗户失效的常见原因。另一种常见失效模式是密封不良的盖子与软衬垫材料界面导致试剂泄漏，导致透明度不完全。

为评估光学清除效果，我们考察了体 外 和 体内透明度的逐步改善。颅骨碎片置于分辨率靶上的 体外 成像显示，S1和S2处理后清晰度递增（见图2A）。 体内 明场成像显示清空颅骨中的松孔血管（见图2B）。通过H...

讨论

HOTS方法采用头戴式光学透明颅骨窗（HOTS），结合装有透明试剂的盖子和两步颅骨清除程序，增强成年小鼠的颅骨透明性，同时保持颅骨完整性。根据标准方案（6周大小鼠S16小时，S211小时1小时），所得窗口可靠支持深度经颅双光子成像，并允许在PIA下方~800微米处观察结构。

获得稳定透明窗口的关键步骤是若干程序步骤。头骨必须保持清洁干燥，仔细去除头皮和骨膜，以确保牙胶牢固附着在骨骼上，并在后续影像检查中牢固固定头板。水泥层应覆盖暴露的骨骼及周围组织，提供坚硬的基础。然后在牙科胶结和窗户周围覆盖一层薄自固化的软牙科衬里材料，以防止后续清除试剂泄漏。HOTS窗应尽可能远离颅缝，因为直接清理缝线上方可能导致毛细血管出血，且常导致窗户破裂。如果窗户必须靠近缝线，用软衬里材料封闭缝线可以降低风险。成像过程中，S2作为浸入和折射率匹配介质，物镜的矫正环应调整以补偿折射率不匹配。

这里使用的清除参数针对6周龄且头骨厚度适中的小鼠进行了优化，但可针对其他年龄进行调整。对于较厚...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1毫升一次性移液器	北京生物顶层及nbsp;科学  &技术 有限公司	无
牙科胶水	上海荣祥牙科材料有限公司	无
D-甘露糖	麦克林	D813082
EDTA	阿拉丁	埃尔16428
异氟醚	后驱	无
快投	工人共产党	无	一种生物相容性封闭剂
不	麦克林	S832169
自固化    牙科     软衬里材质	杨马胡生物技术（Hebi）有限公司	无
戊巴比妥钠	生物长矛	无
立体定向装置	后驱	无
无菌一次性注射器	米南克	无	1毫升;26 G 针
磺胺	麦克林	S817950
Thy1-GFP-M小鼠		无	提供 杨湛教授
Thyl-GCaMP6s 老鼠	杰克逊实验室
二十岁以上	Sigma-Vetec	V900548
水浸目标	尼康	N25X-APO-MP	25×/NA 1.1 目标
水浸目标	尼康	N16XLWD-PF	16×/NA 0.8 目标