利用光学衍射层析技术对巨噬细胞形态动力学进行实时无标记成像与定量分析

摘要

本方案描述了一种基于无标记光学衍射层析成像的工作流程，用于巨噬细胞形态动力学的实时成像与定量分析。该方法能够持续追踪单个细胞的形态变化与迁移行为，在长期活细胞成像过程中提供时间分辨的投影面积、周长以及平均迁移速度的测量结果。

摘要

本研究建立了一种基于无标记光学衍射层析成像（ODT）的工作流程，用于活细胞成像与分析，以观察巨噬细胞随时间变化的形态学改变。该方法可在稳定的环境条件下长期连续记录单个细胞的形态和运动，并能够提取定量参数，包括投影面积、周长和平均迁移速度。该工作流程为在无需外源性标记的情况下捕捉单细胞水平的动态细胞行为提供了实用方案。以RAW264.7巨噬细胞为模型，在脂多糖刺激下进行黄芩素预处理，开展延时成像，以捕捉不同条件下的动态细胞变化。选取代表性细胞进行追踪和定量分析。结果表明，该工作流程支持稳定的长期单细胞追踪，并能反映细胞形态和运动能力随时间的变化。该方法为观察细胞在不同刺激下的动态行为提供了一种无标记手段，可作为传统终点检测方法的有益补充。该方法还可适用于其他贴壁细胞类型，用于细胞形态动力学的研究。

引言

巨噬细胞在先天免疫反应和组织稳态中发挥核心作用，其功能状态可随微环境刺激发生动态变化。传统上，巨噬细胞被认为可极化为促炎性或抗炎/修复相关表型。^1,2然而，越来越多的证据表明，巨噬细胞的活化是一个连续且具有可塑性的过程，而非一种离散的二元状态3,4。在不同刺激条件下，巨噬细胞会随着时间推移发生渐进性变化，伴随细胞形态和迁移行为的改变⁵因此，在单细胞水平上对形态和迁移变化进行时间分辨表征，为研究细胞动态响应提供了重要方法。

研究巨噬细胞状态的现有方法主要依赖于免疫染色、流式细胞术以及转录组学或蛋白质组学分析⁶这些方法通常基于固定样本或离散的时间点，因而限制了其在活细胞条件下连续追踪同一细胞动态变化的能力⁷基于荧光的活细胞成像可实现动态观察，但在长期实验中可能受到光毒性和光漂白的影响^8,9光学衍射层析成像（ODT）是一种无标记成像技术，通过重建细胞的三维折射率分布，提供定量的结构信息。¹⁰由于无需外源性标记，ODT适用于长期活细胞成像，并能减少对细胞行为的干扰。近年来，ODT已被应用于多种细胞模型的动态研究。¹¹，以往的研究主要集中在成像能力和结构表征方面。相比之下，本研究建立了一种标准化的、无需标记的流程，用于在明确条件下对巨噬细胞形态动力学进行长期、时间分辨的单细胞分析 体外 刺激条件

该工作流程使用一个 体外 经脂多糖（LPS）刺激及黄芩素（BAI）预处理的RAW264.7巨噬细胞模型。BAI作为代表性实验调节剂，用于建立明确的实验条件以展示该操作流程。通过连续成像可提取定量的单细胞参数，包括投影面积、周长和平均迁移速度，从而实现对形态学和行为变化的时间分辨表征。该方法旨在对动态表型变化进行描述性分析，而非定义细胞功能状态或极化表型，可作为基于终点检测方法的补充，提供时间维度信息。该操作流程已在本模型系统中得到验证，未来可能适用于其他贴壁细胞类型。

方案

1. 巨噬细胞培养

注意：所有操作均须在生物安全柜中进行，并佩戴实验室手套和实验服。

1. 准备完全培养基（高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素）。
2. 将一管 RAW264.7 巨噬细胞在 37 °C 水浴中解冻，时间少于 1 分钟。
3. 将细胞悬液转移至含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的高糖 DMEM 培养基中。
4. 以 300 × g 离心 5 分钟。
5. 弃去上清液。
6. 用新鲜的完全培养基重悬细胞。
7. 以每皿 2–5 × 10⁵ 个细胞的密度将细胞接种至 60 mm 培养皿中。
8. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞。
9. 解冻后 12–24 小时内不要更换培养基。
10. 每 2–3 天更换一次培养基。
11. 使用倒置显微镜监测细胞形态。
12. 当细胞融合度达到 80–90% 时，通过轻柔吹打进行传代。
    注意：避免使用胰蛋白酶。使用第 6–18 代的细胞。选择形态均一且无空泡化的细胞用于实验。该细胞系已通过 STR 分型鉴定，并经过质量控制检测。详细报告及英文摘要见补充文件。

2. 细胞处理

1. 通过轻柔吹打收集对数生长期的细胞。
2. 将细胞重悬于完全培养基中。
3. 使用细胞计数仪测定细胞密度。
4. 将细胞密度调整至 4 × 10⁴ 个细胞/mL。
5. 每35 mm培养皿中接种2 mL细胞悬液。
6. 将培养皿分为两组：(i) LPS组，(ii) BAI + LPS组。
7. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育12–16小时。
8. 用DMSO配制50 mM BAI储备液，于−20 °C保存。
9. 向BAI + LPS组加入BAI，使其终浓度为100 µM。将BAI储备液直接用培养基稀释至所需工作浓度。
10. 向LPS组加入等体积的DMSO。
11. 用完全培养基配制LPS储备液（1 mg/mL）。
12. 向两组均加入LPS，使其终浓度为1 µg/mL。将LPS储备液直接用培养基稀释至所需工作浓度。
13. 立即进行成像，成像过程中不得更换培养基。

3. 光学衍射层析成像采集

1. 打开ODT成像系统并启动环境控制模块。
2. 将载物台温度设置为37 °C。
3. 将CO₂浓度设置为5%。
4. 让系统平衡至少20分钟。
5. 启动采集软件。
6. 将培养皿放置在成像载物台上。
7. 使用60倍物镜（NA = 1.42）定位细胞。
8. 选择边界清晰的孤立细胞进行成像。
9. 将成像时间间隔设置为8分钟。
10. 设置总帧数为181帧。
11. 启用自动对焦功能，以在延时成像过程中保持聚焦。
12. 开始延时采集。
13. 在采集过程中监测系统稳定性。
    注意：整个实验过程中应用了自动对焦稳定功能，以最小化焦平面漂移。

4. 图像重建与定量分析

1. 图像采集完成后，软件将自动进行图像重建。
2. 使用内置的标准算法。 
3. 等待进度条完成。
4. 打开分析软件（Intellyseg，v2.1.0）。
5. 通过选择“导入原始数据”来导入原始数据集。
6. 浏览至目标文件夹。
7. 选择目标文件并导入数据集。 
8. 点击“细胞”以使用一致的设置对数据集进行自动分割¹³。
9. 根据以下标准选择细胞：(i) 与邻近细胞无重叠，(ii) 不与图像边界接触，(iii) 在整个时间序列中可连续追踪。
10. 每个视野选择固定数量的细胞（n = 8），以确保在不同数据集间分析的一致性。
11. 打开“长期追踪”模块。
12. 输入起始帧和结束帧。
13. 点击“追踪”以启动追踪，该过程基于连续帧之间细胞位置的一致性¹⁴。
14. 如有必要，手动校正追踪错误以确保轨迹连续性：(i) 右键单击错误的掩膜并选择“删除项目”，(ii) 打开“手动分割”，(iii) 选择“细胞”并点击“添加”，(iv) 使用“点击”或“框选”添加正确的掩膜。
15. 点击 "导出"，然后选择 "数据导出"。
16. 选择“视频导出”并选择输出元素。
17. 输入起始帧和结束帧。
18. 选择保存路径和文件格式。
19. 点击“确定”以导出视频。
20. 点击 "导出"，然后选择 "图表系统"。
21. 选择“轨迹图”。
22. 选择“细胞”作为分割类别。
23. 输入追踪帧范围。
24. 选择输出参数（例如，面积、周长）。
25. 点击“导出图像或Excel”并保存文件。
26. 根据整个时间序列中每个细胞质心的位移计算平均迁移速度（µm/h）。

5. 数据展示

1. 定量测量结果以描述性方式呈现，未进行统计推断。每个处理组包含五个独立样本。
   实验工作流程概览见图1。主要试剂、仪器和软件列于材料表中。成像条件总结于表1。

结果

为了评估基于ODT的工作流程的性能，对两个处理组（LPS和BAI + LPS）进行了延时成像，每组包含五个独立的样本。所有样本均在相同的成像条件下获取。由于长期单细胞追踪和定量分析的工作量较大，每组选择一个代表性样本进行单细胞分析和可视化。结果以描述性方式呈现，不用于统计推断。

延时形态动力学

延时ODT成像表明，该方法能够连续记录单细胞形态学变化（图2）。与分析样本对应的代表性延时视频见于补充视频1（LPS，样本1）和补充视频2（BAI + LPS，样本1），而完整数据集（每组样本1–5）作为补充材料提供。在早期时间点（0–6 h），两组细胞均表现出相对规则的圆形形态，边界清晰，变异程度较小。随着时间推移（约8 h后），细胞逐渐呈现更多样化的形态，部分细胞出现铺展、不规则边缘和突起。在后期阶段（12–24 h），形态学变化更加显著，表现为轮廓复杂性增加以及细胞间异质...

讨论

本研究建立了一种基于无标记光学衍射层析（ODT）的工作流程，用于在单细胞水平上对巨噬细胞形态动力学进行连续成像和定量分析。该方法可在长期活细胞成像过程中实现投影面积、周长和平均迁移速度的时间分辨测量。细胞接种密度是影响分割和追踪性能的关键因素。密度过高会导致细胞重叠，而密度过低则会减少可分析细胞的数量。因此，应在成像前优化接种条件。成像时间间隔根据预实验确定，以平衡时间分辨率、数据量以及长期细胞追踪的连续性。较短的间隔可提高时间分辨率，但同时增加数据量和光毒性风险；而较长的间隔可能降低捕捉动态变化的能力。

长期成像需要稳定的环境条件。在整个实验过程中，应维持恒定的温度、CO₂浓度，并尽量减少机械扰动。自动对焦稳定同样重要，以尽量减少长时间成像过程中的焦平面漂移。在图像分析过程中可能会遇到技术挑战，特别是在细胞密度较高或形态复杂的区域。本研究中，所有数据集均采用一致的分割参数，并选择每视野固定数量的细胞以提高可比性。当出现分割或追踪错误时，必要时进行人工校正。这些措施有助于在长期（24小时）单细胞追踪过程中实现稳定的图像采集和可靠的定量分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ODT 成像系统	Pellucid Optics	MH-PanoView	用于无标记活细胞成像
采集软件	Pellucid Optics	Lucida-Pano v2.1.0	用于图像采集
分析软件	Pellucid Optics	Intellyseg v2.1.0	用于图像重建、分割和追踪
RAW264.7	武汉籽山生物科技	STCC20020P	用于体外极化和成像实验的小鼠巨噬细胞系。
黄芩苷（BAI）	上海源叶	JB246114	用于细胞预处理
脂多糖（LPS）	Solarbio	L8880	用于刺激巨噬细胞
DMEM 培养基	Gibco	C11995500BT	细胞培养用培养基
胎牛血清	Procell	164210	细胞培养添加剂
青霉素–链霉素（100x）	Procell	PB180120	细胞培养用抗生素
60 mm 培养皿	Corning	CLS430166	用于细胞培养
35 mm 玻璃底培养皿	Cellvis	D35-10-1.5-N	用于 ODT 成像
倒置显微镜	OLYMPUS	CKX53	用于常规细胞观察及培养过程中的监测。
细胞计数仪	RWD 生命科学	C100	用于细胞密度测定