人类转录组数据的综合生物信息学分析识别出肺腺癌的三个关键诊断和预后生物标志物

摘要

本研究利用TCGA-LUAD和GEO GSE115002转录组数据，鉴定了肺腺癌的诊断和预后生物标志物。 B3GNT3、 FERMT1和 SPP1 上调，将肿瘤与正常组织区分开来。这些基因与上皮-间充质转变和免疫抑制有关。结合基因表达与TNM阶段的命名图显示出可靠的预测价值。

摘要

肺腺癌（LUAD）是全球癌症相关死亡的主要原因。尽管手术、靶向治疗和免疫疗法取得了进步，晚期LUAD的5年生存率仍低于20%，表明急需可靠的分子生物标志物以实现早期检测和预后。在这项研究中，作者假设三个持续上调的基因可以作为LUAD的有效诊断和预后生物标志物。作者分析了两个独立队列TCGA-LUAD（535个肿瘤，59个正常样本）和GSE115002（52个肿瘤，52个正常样本匹配）的转录组数据，以筛选表达差异的基因。三个核心基因——B3GNT3、FERMT1和SPP1——在LUAD肿瘤中均持续过度表达。这些基因表现出优异的诊断性能，TCGA-LUAD中AUC值超过0.95，GSE115002中准确率较高。生存分析显示，每个基因的高表达与整体和无病期显著缩短相关，多变量Cox回归验证了其独立的预后价值。功能富集分析表明，这三个基因参与上皮-间充质转变、细胞外基质重塑和免疫抑制，这些都与LUAD的侵入和转移密切相关。作者进一步构建了结合三基因和TNM阶段的预后指标，达到0.743的一致性指数，并展现出良好的预测表现。这些发现证实B3GNT3、FERMT1和SPP1是LUAD的有前景的诊断和预后生物标志物，支持其在风险分层和管理中的临床应用。

引言

肺癌是全球癌症死亡的主要原因，2020年约有180万人^死亡。肺腺癌（LUAD）占所有肺^癌病例的近40%。尽管手术、靶向治疗和免疫治疗取得了进步，晚期LUAD的5年生存率仍低于20%，^3,4。急需可靠的分子生物标志物以实现早期检测和精确预测。高通量测序和公共数据库如癌症基因组图谱（TCGA）和基因表达综合目录（GEO）使癌症的系统转录组谱化成为可能 ^5,6。整合跨队列生物信息学提高了候选生物标志物发现的可靠性⁵.

许多基因和通路被认为与LUAD有关，包括细胞增殖、EGFR信号传导和免疫逃逸⁷。然而，很少有研究被转化为临床应用。结合基因特征和临床病理特征的风险模型——尤其是计型图——能提高LUAD⁸的预后准确性。虽然 B3GNT3、 FERMT1和 SPP1 已单独与癌症进展相关，但它们在LUAD中的综合诊断、预后和免疫-微环境调控价值尚未在独立队列间得到系统性验证。本研究首次作为LUAD统一生物标志物面板，实现了这三个基因的综合跨平台分析，并提供了临床适用的预后计量组。

B3GNT3编码一种糖基转移酶，能够稳定PD-L1并促进免疫逃避 ^9,10。FERMT1（kindlin-1）调控整合素活化，并推动非小细胞肺癌（NSCLC）的转移^11,12。SPP1（骨质素）介导细胞外基质重塑、上皮-间充质转变（EMT）和化学抵抗性 13,14,15。昼夜节律相关基因也被证明能预测LUAD的预后和诊断¹⁶，而LUAD中的性别差异则通过多组学整合蛋白信号网络被发现¹⁷。B3GNT3和SPP1为分泌或膜定位，支持其作为微创生物标志物的潜在应用。通过重叠的特征^{选择方法，}还可以实现有效的LUAD分类和生物标志物鉴定，多组学相互作用在肺癌进展中发挥重要功能作用¹⁹。通过全面的多组学整合识别线粒体基因特征，对LUAD预后和个体化治疗也有价值²⁰。B3GNT3和SPP1为分泌或膜定位，支持其作为微创生物标志物的潜在应用。本研究旨在利用整合生物信息学识别强健的LUAD生物标志物，评估其诊断和预后表现，探索其生物功能和免疫关联，并构建临床有用的预后指标。

方案

1. 数据源与预处理

1. 在R中处理原始数据（版本4.1.3;Windows 10 Pro）。
2. 对于GSE115002，使用limma（版本3.52.3）进行分位数归一化。
3. 过滤TCGA低表达基因：在≥50%的样本中保留CPM>0.5的基因。
4. 过滤低表达基因以进行GSE115002：保留信号平均为>50的基因。
5. log₂变换表达式值，伪计数为 +1。
   注：LUAD基因表达和临床数据来源于TCGA-LUAD（版本33.0，GDC门户，下载时间2025年8月7日）和GSE115002（安捷伦微阵列，GEO，下载时间2025年8月7日）。TCGA-LUAD包含535个肿瘤和59个正常样本。GSE115002包括52个肿瘤和52个匹配正常样本。

2. 鉴定差异表达基因

1. TCGA RNA-seq使用DESeq2（版本1.36.0），GSE115002用LIMMA（版本3.52.3）进行差异表达分析。使用本贾米尼–霍赫伯格方法计算调整后的P值（FDR）。
2. 为确保跨数据集可比性，统一的 |log₂FC|≥1.0适用于两个群体。DEG定义为FDR（自由脱< 0.05和|log₂FC|≥ 1.0。通过VennDiagram（版本1.7.3）识别重叠的DEGs。 B3GNT3、 FERMT1和 SPP1 被选为持续上调且已知癌症相关候选药物。

3. 诊断价值评估

1. 为每个候选基因构建ROC曲线。
2. 利用尤登指数确定最优截止值。
3. 计算每个基因的AUC、敏感性和特异性。
4. 利用多元逻辑回归构建综合诊断面板。
   注：ROC分析使用pROC软件v1.18.0。使用带有二项族的glm函数构建诊断模型。

4. 生存分析

1. 利用中位表达将患者分层为高表达组和低表达组。
2. 为每个基因生成Kaplan–Meier生存曲线。
3. 进行对数秩检验以比较生存差异。
4. 进行单变量Cox回归分析。
5. 进行多元Cox回归分析。
6. 在回归模型中包含临床协变量。
7. 利用舍恩菲尔德残差验证比例风险假设。
8. 计算三基因风险评分。
   注意：使用的是Survival v3.3.1和survminer v0.4.9。协变量包括年龄、性别、T阶段、N阶段和M阶段。风险评分计算方式为：
   风险得分 = （0.328 × B3GNT3） + （0.331 × FERMT1） + （0.321 × SPP1）。(1)

5. 基因集富集与功能注释

1. 使用DEG进行GO富集分析。
2. 使用DEG进行KEGG通路富集分析。
3. 进行基因集富集分析（GSEA）。
4. 通过皮尔逊相关性与候选基因表达对基因进行排序。
5. 使用调整后的P <0.05识别显著词。
   注：clusterProfiler v4.6.2 用于 GO 和 KEGG 分析。GSEA 使用 了 FGSEA v1.22.0 和 MSigDB Hallmark v7.5。

6. 相关性与网络分析

注意：Pearson相关分析用于正态分布的基因表达;斯皮尔曼相关性与免疫细胞分数。PPI网络使用STRING（版本11.5，置信度>0.7）生成，并在Cytoscape（版本3.9.1）中可视化。免疫浸润使用CIBERSORT（绝对模式，100种排列）估算。单细胞RNA测序已被证明能揭示NSCLC微环境中的生态位转变，这与免疫浸润分析^21,22相关，整合单细胞分析还能进一步剖析免疫细胞（如CD8+记忆细胞）在LUAD^{中的作用 23,24,25}。

7. 诺莫图的构建与验证

注：命名组变量基于多变量Cox显著性（P < 0.05）选定：T期、N期、 B3GNT3、 FERMT1和 SPP1。该计程图采用了有效方值（6.5.0版本）构建。内部验证使用了1000引导重采样并替换。校准曲线和决策曲线分析（DCA）使用RMDA（版本1.7）进行。计算环境包括R 4.1.3、Windows 10 Pro和Bioconductor 3.15。分析脚本可根据合理要求在 https://github.com/[已编辑]/LUAD-biomarker-2025 获取。

8. 统计分析

注意：所有统计检验均为双面;P<0.05被认为具有显著性。

结果

LUAD中的全局基因表达变化

肺腺癌组织与正常肺组织的转录组比较发现了广泛的基因表达变化。图1A显示了TCGA-LUAD数据集中差异表达基因的火山图，图1B显示了GSE115002数据集中的基因。在TCGA-LUAD队列（图1A）中，1865个基因显著上调，1247个基因被下调。在GSE115002队列（见图1B）中，645个基因上调，609个下调。两组数据中共计421个基因持续上调。在这些重叠基因中，B3GNT3、FERMT1和SPP1在图1A和图1B中被标记为肿瘤样本中明显过度表达。在TCGA-L...

讨论

该组图基于TCGA-LUAD队列，采用多元Cox回归分析构建。预测因子包括病理性T阶段、病理性N阶段，以及B3GNT3、FERMT1和SPP1的基因表达状态（根据中位表达分为高与低）。对于每位患者，将每个变量的得分相加生成“总积分”值，对应估计的1年、2年和3年总体存活概率。总分越高表示死亡风险越高。该工具提供个性化的生存预测，并有助于LUAD风险分层。机器学习已被用于揭示LUAD预后和治疗中的多样细胞死亡模式^21,22,23，这有望进一步优化我们的命名模型。

本研究通过综合生物信息学分析鉴定B3GNT3、FERMT1和SPP1作为LUAD中稳健的诊断和预后生物标志物。这三种基因在肿瘤中均持续过度表达，能够高精度区分肿瘤与正...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
公开可用数据集	TCGA-LUAD 数据集	癌症基因组图谱（TCGA）门户网站（https://portal.gdc.cancer.gov/）；535 个 LUAD 肿瘤样本，59 个相邻的正常肺组织样本（RNA 测序计数/FPKM 值 + 临床数据：生存、TNM 分期）	用于差异表达、生存和列线图分析的转录组和临床数据；主要研究队列
	GSE115002 数据集	基因表达综合数据库（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE115002）；Agilent 微阵列，52 个 LUAD 肿瘤组织，52 个匹配的相邻正常肺组织（未经治疗的原发性肿瘤）	差异表达、诊断性能和免疫渗透分析的独立验证队列
生物信息学软件 & 编程环境	R 编程语言	版本 4.1	所有转录组、统计和图形分析的核心平台
	R 包（差异表达）	DESeq2，limma	DESeq2：TCGA RNA-seq 原始计数差异表达分析；limma：GSE115002 微阵列归一化和差异表达分析（Benjamini-Hochberg FDR 校正）
	R 包（诊断分析）	pROC	ROC 曲线的构建，AUC（95% CI）的计算，诊断性能评估的最佳切割点确定（Youden 指数）
	R 包（生存分析）	survival，survminer	Kaplan-Meier 生存曲线生成，log-rank 检验，单变量/多变量 Cox 比例风险回归（HR + 95% CI）；患者按中位基因表达分层
	R 包（功能富集）	clusterProfiler，fgsea	clusterProfiler：GO（BP/CC/MF）和 KEGG 通路富集分析（调整后的 P < 0.05）；fgsea：MSigDB 标志基因集的 GSEA（FDR < 0.25）
	R 包（列线图构建 & 验证）	rms	预后列线图的开发（基因表达 + TNM 分期的整合）；Harrell 的 C-index 计算，用于偏差校正的引导重采样（1000 次重复），校准图生成
	R 包（统计 & 可视化）	ggplot2，ComplexHeatmap，corrplot	火山图、气泡图（富集）、热图（免疫渗透相关）、散点图（基因共表达）的生成；Pearson/Spearman 相关性分析
生物信息学数据库 & 工具（网络/免疫分析）	STRING 数据库	置信度得分 > 0.7	构建 B3GNT3/FERMT1/SPP1 和一级相互作用物的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络
	Cytoscape	-	PPI 和基因共表达网络的可视化（边缘权重按相关强度，中心基因识别）
	免疫解卷积算法	CIBERSORT	估算 LUAD 样本中的免疫细胞渗透丰度（M2 巨噬细胞、CD8+ T 细胞、中性粒细胞、NK 细胞等）；与候选基因表达的相关性
其他工具	Microsoft Office/LaTeX	-	手稿准备，图形组装和表格格式化；统计结果编译