本研究建立并初步验证了在高海拔低压低氧条件下大鼠延迟性伤口愈合的动物模型。
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本研究建立并初步验证了在高海拔低压低氧条件下大鼠延迟性伤口愈合的动物模型。
高海拔低压环境可能导致伤口长期缺氧并影响愈合，但目前仍缺乏标准化的动物模型。本研究建立了一种伤口延迟愈合模型，并通过可控的低压系统模拟高海拔缺氧环境对其进行初步验证。将大鼠置于模拟海拔3000米（大气压：70.1 kPa，氧分压：14.7 kPa）至8000米（大气压：35.6 kPa，氧分压：7.5 kPa）的环境中，以确定安全阈值，并评估氧化应激和皮肤缺氧情况。结果显示，在模拟海拔6000米时大鼠死亡风险增加，而海拔5000米以下则可耐受。随着海拔升高，氧化应激加重，皮肤缺氧加剧；伤口愈合呈现海拔依赖性延迟，组织灌注减少，胶原重塑受抑制，炎症反应加剧。尽管血管再生相关因子表达上调，但微血管密度仍下降。总体而言，本研究建立并初步验证了一种适用于研究高海拔缺氧所致慢性伤口机制及干预措施的大鼠模型。
皮肤伤口修复是一个普遍且重要的临床难题。从急性创伤到各种类型的难愈合伤口，这些状况给医疗系统和患者的生活质量带来了持续的负担1,2,3,4,5,6。伤口愈合并非单一事件，而是一个高度协调、多阶段重叠的过程：炎症细胞、间质细胞、角质形成细胞以及微血管系统在细胞外基质和多种信号网络的共同调控下，协同重建屏障并重塑组织7,8,9,10。鉴于修复过程能量消耗高且对内环境极度敏感，全身代谢和生理状态的改变——如氧化应激增强、免疫失调以及微循环灌注受损——可在多个环节破坏正常的修复级联反应，导致炎症持续延长、再生不足以及异常重塑9,11,12,13,14,15。
氧气供应是限制伤口修复过程的关键因素，它参与能量代谢和细胞迁移/增殖，同时通过缺氧信号通路调节血管生成和炎症反应16,17,18。伤口早期的短暂缺氧可稳定缺氧诱导因子并启动适应性修复程序。然而，当缺氧过度或持续存在时，尽管血管生成信号可能代偿性上调，却难以转化为有效的微血管重建。与此同时，巨噬细胞表型转换和炎症消退更易失衡，形成“"缺氧-炎症-再血管化障碍"”的恶性循环19,20,21,22。这一问题在高海拔环境中尤为突出：大气压降低导致吸入氧分压下降，引发持续性缺氧，增加伤口愈合障碍和感染相关并发症的风险23,24,25,26。
暴露于高海拔环境会引发人体显著的缺氧应激反应27。高海拔环境可导致持续性组织缺氧、伤口部位灌注不足以及炎症反应28。这些病理生理变化可能通过促进过量活性氧的产生、激活蛋白酶、诱导细胞衰老，同时破坏间充质干细胞的功能，从而损害伤口愈合过程29,30。目前直接评估高海拔暴露对人类皮肤伤口愈合影响的研究仍然有限。因此，使用低压低氧动物模型有助于验证海拔相关因素对伤口修复的影响。
既往在固定海拔高度下建立的动物模型已报道伤口愈合延迟现象；然而，海拔依赖性效应、长时间暴露于低压环境的安全阈值，以及皮肤局部缺氧的直接证据仍不明确26。此外，目前缺乏对愈合障碍的系统性评估，这限制了对潜在机制的研究以及干预靶点的识别31。在本研究中，我们基于低压控制系统建立并初步验证了一种皮肤伤口模型，用于在受控条件下模拟高原低压性低氧环境。通过采用梯度式模拟海拔暴露策略，我们首先界定了持续低压暴露的安全范围，并通过全身性指标评估了低压低氧的生物学效应。关键的是，我们进一步在体内验证了低压环境确实导致皮肤局部氧供受限。随后，我们证明持续的低压低氧会以海拔依赖的方式延缓伤口闭合，并伴随组织学改变及关键信号通路异常。总体而言，本研究建立并初步验证了一种与高原低氧相关的慢性伤口动物模型平台，为机制解析及后续治疗策略的系统性评价提供了支持32。
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所有涉及动物的实验程序均经过中国电子科技大学伦理委员会（编号：106142025091534170）和陆军军医大学伦理委员会（编号：AMUWEC20265509）的审查和批准。本研究中实验设计与分析的图形化工作流程见图1。此外，本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
实验动物与伦理声明
本研究采用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，购自中国成都达硕实验动物有限公司。所有动物在标准条件下适应性饲养7天后开始实验。
纳入与排除标准
动物纳入标准如下：雄性SD大鼠，6至8周龄，体重200–250 g，外观健康，行为正常，无皮肤损伤或感染。
动物排除标准如下：造模后伤口出现明显感染；伤口愈合异常或存在撕裂伤；实验期间死亡或因麻醉导致的意外死亡。
数据点排除标准如下：伤口图像存在广泛结痂、毛发遮挡或照明不均；激光散斑对比成像（LSCI）图像显示运动伪影；组织切片出现明显皱褶、碎裂或缺失目标区域；血清样本出现明显溶血；免疫荧光（IF）或免疫组织化学（IHC）图像存在过度曝光或抗体定位错误
排除项的处理：
对于所有被排除的动物或数据点，均通过补充实验重新获得了有效数据，以确保每组最终的有效样本量在所有终点分析中均达到 N ≥ 3。
低压控制系统与模拟高海拔缺氧环境
采用低压控制系统构建模拟高海拔缺氧环境。该系统可精确调节舱内气压，以重现对应不同海拔高度的大气压力，从而降低环境氧分压，实现可控的缺氧暴露（图2A）。
舱内压力调节以模拟海拔3000 m、4000 m、5000 m、6000 m、7000 m和8000 m的环境，详细参数见表1。实验期间，SD大鼠根据实验分组进行群养。在舱体运行过程中，持续监测舱内压力、温度和湿度，以确保除压力外，其他环境条件均与标准实验室饲养条件相近。饲养环境保持温度22–24 °C、相对湿度50%–60%、12小时光照/黑暗循环，并可自由获取标准饲料和饮用水。
低气压暴露的安全性评估与生存分析
为评估持续低气压暴露的安全范围，采用计算机生成的随机数字序列（Excel 中的 RAND 函数）对大鼠进行个体编号并随机分配至实验组。分组由未参与后续动物护理、数据收集或结果评估的研究人员完成。根据涉及高海拔梯度暴露的参考动物研究，每组样本量设定为 1233。大鼠被分为常氧对照组（海拔 500 米）以及模拟海拔 3000 米、4000 米、5000 米、6000 米、7000 米和 8000 米的实验组。各组大鼠在其相应环境中持续饲养 30 天。每 2 天，低气压控制系统会短暂恢复至海平面条件 30 分钟，以便进行笼具清洁以及提供食物和水。在减压和加压过程中，压力变化速率维持在约 300 m/min，以最大限度降低气压伤风险。在此期间，每日观察并记录所有大鼠的一般状况及死亡事件。采用 Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，并通过 log-rank 检验比较各组间的生存差异。
血清氧化应激相关标志物的检测
在低压暴露第21天，从麻醉状态下的大鼠采集静脉血样本。室温静置后，通过离心（4 °C下1,000 × g 离心15分钟）分离血清，并于-80 °C保存以备后续使用。使用相应的检测试剂盒测定血清中乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的水平。
皮肤组织中缺氧状况的评估
采用缺氧检测试剂盒对皮肤组织中的缺氧情况进行评估。简言之，在低压暴露的第4天和第7天，大鼠经腹腔注射匹莫齐特（60 mg/kg）；注射后1小时实施安乐死，并采集背部皮肤组织用于分析。详细的安乐死操作步骤如下：根据美国兽医协会（AVMA）的安乐死指南，将动物置于诱导室中，使用含4–5%异氟烷的氧气进行麻醉诱导。当动物意识丧失后，将异氟烷浓度降低至2–3%，并维持至少10分钟。在实施颈椎脱位作为确认死亡的方法之前，必须确认心跳和呼吸已完全停止。组织样本经液氮速冻后，于-80 °C保存以备后续使用。使用冷冻切片机制备组织切片。通过免疫荧光染色标记组织内的缺氧区域。
所有荧光图像均使用自动载玻片扫描仪获取。荧光参数设置如下：DAPI（激发波长365 nm ± 10 nm，发射波长440 nm ± 40 nm）、Cy3（激发波长542–566 nm，发射波长579–611 nm）和Cy5（激发波长628 nm，发射波长692 nm）。缺氧信号使用ImageJ软件进行定量分析。
大鼠全层皮肤伤口模型
为评估持续低压条件下皮肤伤口愈合的变化，首先将大鼠分组并适应各自环境，随后进行伤口建模。每只大鼠进行个体编号，并通过计算机生成的随机数序列（Excel 中的 RAND 函数）随机分配至常氧对照组或模拟海拔 3000 米、4000 米和 5000 米的低压暴露组。分组由未参与后续造伤、术后护理及结局评估的研究人员完成。各组详细参数如下：常氧对照组位于海拔 500 米处（大气压：101 kPa，氧分压：21 kPa）；3000 米组（70.1 kPa，14.7 kPa）；4000 米组（61.6 kPa，13.1 kPa）；5000 米组（54 kPa，11.3 kPa）。
经过7天的适应期后，采用2%异氟烷吸入麻醉并维持麻醉状态。同时，在标记的手术部位进行局部浸润注射含肾上腺素的5%利多卡因（稀释比例：1:100,000），以提供围手术期镇痛和止血。使用皮肤活检打孔器（底部带有直径10 mm的圆形刀片）进行皮肤切口。将活检打孔器压在大鼠背部皮肤上，然后轻轻旋转，使圆形刀片逐渐切割皮肤直至达到浅层皮下筋膜。取出活检打孔器后，即可形成一个直径约10 mm的规则圆形皮肤切口。
造模后，每组大鼠均被放回并维持于其原始环境中，直至实验终点，以确保整个伤口愈合过程在预设的氧浓度条件下进行。
伤口愈合过程的大体评估
在伤口形成后的第0、2、4、6、8、10、12和14天，在光照条件一致、成像距离固定的条件下拍摄伤口照片。使用Image J软件测量伤口面积。简言之，将各时间点获取的伤口图像导入Image J，根据比例尺进行标定，手动勾画伤口边缘以确定伤口面积34。伤口愈合率的计算公式如下：伤口愈合率（%）=（初始伤口面积 − 当前伤口面积）/ 初始伤口面积 × 100%。
伤口微循环的评估
在伤口愈合的第7天，使用激光散斑血流成像系统（LSCI）评估伤口区域的微循环血流灌注。检查前，通过吸入2%异氟烷对大鼠进行麻醉，并将其固定在温度可控的手术台上以维持体温。充分暴露背部伤口区域，将激光散斑探头垂直置于伤口上方约20 cm处。探头功率设为110 mW，采样频率为30 Hz，曝光时间为3秒。在黑暗条件下，采集伤口区域的血流灌注伪彩图像。使用LSCI软件在血流灌注伪彩图像上手动勾画伤口区域；软件将自动计算该区域在3秒内的血流灌注值（以任意单位[A.U.]表示）。最后，将灌注值导出至适当的软件用于绘图。
组织学染色与胶原重塑分析
在预定时间点处死动物，取完整伤口及周围皮肤组织，进行固定、脱水、石蜡包埋并切片。苏木精-伊红（HE）染色：用于评估伤口宽度、再上皮化程度及再生表皮厚度；Masson三色染色：用于评估胶原纤维沉积情况并计算胶原体积分数；天狼星红染色：在偏振光显微镜下区分I型胶原（COL I）与III型胶原（COL III），并计算COL I/COL III比值。
免疫组织化学染色
石蜡切片在进行免疫组织化学（IHC）或免疫荧光（IF）染色前，需经过脱蜡、再水化及抗原修复。一抗于4 °C孵育过夜，随后加入相应的二抗。具体的抗体信息及稀释比例见材料表。IHC切片使用DAB显色，而IF切片则采用带DAPI复染细胞核的荧光二抗35,36。所有图像均在相同条件下采集，并使用ImageJ软件进行定量分析。
统计学分析
所有数据均以均值 ± 标准差表示。统计学分析使用 GraphPad Prism 软件进行。对于单个时间点多个组之间的比较，采用单因素方差分析（ANOVA）；当检测到总体差异显著时，进一步采用 Tukey 多重比较检验进行组间分析。对于在多个时间点评估的伤口愈合数据，采用双因素方差分析（ANOVA），将处理组别和时间作为独立因子，以评估主效应及其交互作用。事后分析同样采用 Tukey 多重比较检验。为进一步评估统计效能，基于主要终点指标（第14天的伤口愈合情况），使用 G*Power 软件进行事后效能分析。
采用Kaplan-Meier法进行生存分析以绘制生存曲线，并使用log-rank检验比较各组间的生存差异。对于多组之间的两两比较，采用Bonferroni校正以控制多重比较导致的I类错误风险。所有统计检验均为双侧检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
所有结局评估，包括创面面积测量、组织学和免疫组织化学定量分析以及激光散斑血流成像分析，均由一名对研究分组情况设盲的研究人员完成。
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低气压诱导持续性缺氧的安全边界验证
Kaplan–Meier 生存分析显示，随着模拟海拔升高，生存曲线呈逐渐下降趋势，死亡事件首次出现在 6000 m 组（图 2B）。经 Bonferroni 校正的两两比较结果显示，对照组与 6000 m 至 8000 m 各组之间的生存率差异无统计学意义。至第 30 天时，对照组、3000 m 组、4000 m 组、5000 m 组、6000 m 组、7000 m 组和 8000 m 组的最终生存率分别为 100%、100%、100%、100%、83.33%、75.00% 和 58.33%。在持续 30 天暴露期间，暴露于 ≤5000 m 模拟海拔的大鼠未观察到生存风险显著增加。基于上述生存数据，确定了后续研究的最高实验海拔限值。选择 5000 m 作为相对安全的阈值，因为在该海拔及以下未发生死亡，而更高海拔（≥6000 m）存在显著的死亡风险，可能干扰后续的伤口愈合研究。从生物学角度来看，5000 m（氧分压 ≈ 11.3 kPa）代表了一种可靠且持续的低氧环境，足以诱导伤口愈合延迟，但不会导致严...
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高海拔环境通过诱导组织缺氧、血流灌注减少和炎症反应，损害伤口愈合过程，进而促进活性氧的过度产生、蛋白酶激活、细胞衰老以及间充质干细胞功能障碍27,28,29,30。鉴于目前关于高海拔影响的人体研究仍存在局限性，建立模拟高海拔缺氧的标准化动物模型具有重要意义。
生存分析表明，持续暴露于海拔5000米高度30天并未显著增加死亡风险，而更高海拔则产生累积的生存危害。在模拟海拔≥6000米组中，死亡事件主要集中于最初几天。这可能与高原病相关23,37,38，高原病通常在抵达高海拔地区后的数天内发生38
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作者声明无竞争利益。
本研究由中央高校基本科研业务费专项资金（电子科技大学，ZYGX2025YGLH006）；四川省卫生健康科研项目（2025-205）；中国西藏日喀则市自然科学基金（RKZ2024ZR-003）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 全自动切片扫描仪 | Olympus | VS200 | 组织切片扫描 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Servicebio | GC305010 | 免疫组化/免疫荧光封闭试剂 |
| CD206 抗体 | Proteintech | 18704-1-AP | M2 巨噬细胞检测（稀释比例 1:200） |
| CD31 抗体 | Abcam | ab182981 | 微血管密度检测（稀释比例 1:800） |
| CD86 抗体 | HuaBio | ER1906-01 | M1 巨噬细胞检测（稀释比例 1:200） |
| CK19 抗体 | HuaBio | ET1601-6 | 再上皮化评估（稀释比例 1:200） |
| DAB 底物试剂盒 | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | 免疫组化染色用显色底物 |
| FITC 标记的山羊抗兔 IgG | Servicebio | GB22303 | 免疫荧光用荧光二抗（稀释比例 1:100） |
| G*Power | 德国杜伊斯堡-埃森大学 | www.gpower.hhu.de | 统计功效计算 |
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad Software | https://www.graphpad.com/ | 统计分析与图表生成 |
| 苏木精染色液 | J&K Scientific | LM10N13 | 苏木精-伊红（H&E）染色 |
| HIF-1α 抗体 | Bioss | BS-0737R | 缺氧相关信号检测（稀释比例 1:100） |
| HRP 标记的山羊抗兔 IgG | Servicebio | GB23303 | 免疫组化二抗（稀释比例 1:100） |
| 低压控制系统 | 上海玉研仪器有限公司 | LP-1500 | 用于模拟梯度高海拔低压缺氧环境 |
| Hypoxyprobe-1 试剂盒 | Hypoxyprobe Inc. | HP1-100 | 用于活体缺氧检测 |
| IF555 酪胺信号放大试剂盒 | Servicebio | G1233 | 用于增强荧光信号放大 |
| IL-10 抗体 | HuaBio | HA722032 | 抗炎细胞因子检测（稀释比例 1:100） |
| IL-1β 抗体 | HuaBio | HA723965 | 促炎细胞因子检测（稀释比例 1:100） |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | https://imagej.net/ij/download.html | 图像定量分析 |
| 异氟烷 | RWD 生命科学有限公司 | R510-22-16 | |
| Ki-67 抗体 | HuaBio | HA721115 | 角质形成细胞增殖检测（稀释比例 1:400） |
| 激光散斑血流成像系统 | RWD 生命科学有限公司 | RFLSI ZW | 血流灌注评估 |
| LDH 检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | A005-1-2 | 血清 LDH 测定 |
| Masson’s 三色染色试剂盒 | Servicebio | G1006-100ML | 胶原沉积分析 |
| MDA 检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | A003-1-1 | 脂质过氧化评估 |
| 天狼星红染色试剂盒 | Servicebio | G1078-100ML | Ⅰ型/Ⅲ型胶原区分 |
| SOD 检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | A001-1-1 | 血清 SOD 活性测定 |
| TNF-α 抗体 | HuaBio | ER65189 | 促炎细胞因子检测（稀释比例 1:200） |
| VEGF-A 抗体 | HuaBio | ET1604-28 | 血管生成相关信号检测（稀释比例 1:200） |