1β-羟基-5α-氯-8-表-艾卡明通过靶向IKKα/β抑制NF-κB信号通路从而抑制炎症反应

摘要

倍半萜内酯XTT可有效减轻脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症反应。XTT通过靶向IKKα/β抑制NF-κB信号通路，而不影响MAPK的活化，从而发挥强大的抗炎作用 体外.

摘要

核因子-κB（NF-κB）信号级联的失调与炎症性疾病的发展密切相关。IκB激酶（IKKs）被公认为是调控NF-κB活性的核心分子，因此成为治疗炎症性疾病的潜在治疗靶点。倍半萜内酯类化合物1β-羟基-5α-氯-8-表-艾草素（XTT）已被证实具有显著的抗肿瘤作用，但其抗炎活性及潜在的分子机制尚不清楚。本研究中，XTT显著抑制了一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE₂）的生成。₂在脂多糖（LPS）激活的RAW264.7巨噬细胞中，XTT显著降低了诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的mRNA水平。此外，XTT还下调了LPS处理所诱导的iNOS和COX2蛋白表达水平。在作用机制方面，XTT对丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的活性无明显影响；相反，XTT通过与IKKα/β相互作用，显著抑制了LPS诱导的抑制性κBα（IκBα）的磷酸化及其降解，从而阻碍NF-κB的核转位。综上所述，这些结果表明XTT具有显著的抗炎作用。 体外 通过 靶向IKKα/β并阻断NF-κB信号通路。这些结果表明，XTT可能作为开发抗炎药物的有前景的先导化合物。进一步的生化和 体内 需要开展研究以验证直接抑制 IKKα/β 的作用及其治疗潜力。

引言

炎症是一种受到严密调控的生物学过程，使生物体能够应对感染、组织损伤及其他环境挑战¹。尽管急性炎症反应通常具有保护作用，但炎症通路的持续激活可能破坏组织稳态，并促进炎症性肠病（IBD）和类风湿性关节炎（RA）等慢性疾病的发生与发展²。多种细胞内信号网络参与炎症调控，其中核因子-κB（NF-κB）通路是研究最为广泛的通路之一³。

NF-κB 家族成员包括 p50、p52、p65（RelA）、RelB 和 c-Rel，它们以二聚体转录因子的形式发挥作用，调控参与免疫和炎症反应的基因表达^4,5。在基础状态下，NF-κB 二聚体通过与κB抑制蛋白（IκB）结合而在细胞质中保持非活性状态。当受到脂多糖（LPS）或肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症介质刺激后，IκB激酶（IKK）复合物被激活，并对 IκBα 进行磷酸化，导致其发生泛素化并降解。该过程使得 NF-κB 复合物得以在细胞核内积累，进而启动炎症介质和细胞因子的转录⁶。由于过度或持续的 NF-κB 激活与多种炎症性和自身免疫性疾病密切相关，因此针对 IKK 信号通路的药物干预已受到广泛关注^7,8,9。

天然产物长期以来一直是药物开发的重要来源，包括抗炎治疗药物¹⁰1β-羟基-5α-氯-8-表-艾草素（XTT）是一种从中国苍耳（Xanthium sibiricum）中分离得到的倍半萜内酯^11,12先前的研究表明，XTT可抑制人肝细胞癌细胞的增殖并诱导其发生凋亡。 通过 谷胱甘肽耗竭导致的活性氧介导的ERK/p38 MAPK激活及JAK2/STAT3抑制¹³然而，XTT 的抗炎潜力及其相关的分子机制仍不清楚。

目前的研究结果表明，XTT 在体外具有显著的抗炎作用。in vitro 机制研究表明，XTT 可与 IKKα/β 相互作用并抑制 NF-κB 信号通路，从而抑制活化巨噬细胞中的炎症反应。这些发现提示，XTT 可能是开发抗炎药物的一个有前景的先导化合物。

方案

本研究仅涉及已建立的商用细胞系，未包括人类受试者、临床样本或动物实验。因此，无需机构伦理审批和知情同意。所有实验均依照机构实验室安全指南进行。危险试剂在指定的通风橱中操作，并使用适当个人防护装备（PPE）。化学和生物废弃物均按照机构规定进行处理。本实验方案中使用的化学品、试剂盒和试剂列于材料表中。

1. 细胞培养
RAW264.7 小鼠巨噬细胞、HeLa 人宫颈癌细胞和 HEK293T 人胚胎肾细胞购自中国科学院细胞库（中国上海）。所有细胞均在含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。培养环境为 37 °C、5% CO₂ 及饱和湿度。

2. 细胞活力检测
细胞活力通过以下方法评估 通过 CCK-8 细胞计数试剂盒检测。RAW264.7 细胞（2.5 × 10⁴ 将细胞以每孔一定数量接种至96孔板中，于37 °C培养过夜。随后，细胞用不同浓度的XTT处理24小时，同时设置或不设置LPS（0.5 µg/mL）。LPS浓度和处理时间通过预实验优化，以诱导适度的炎症反应，同时不引起显著的细胞毒性。之后，每孔加入10 µL CCK-8试剂，将培养板置于37 °C孵育2小时。使用酶标仪在540 nm波长处测定吸光度。

3. 细胞培养基中一氧化氮和前列腺素 E₂ 水平的测定
将 RAW264.7 细胞以每孔 2.5 × 10⁵ 个细胞的密度接种于 24 孔板中，在 37 °C 培养过夜。细胞在脂多糖刺激或 TNF-α（15 ng/mL）处理前，先用 XTT 预处理 2 小时，随后继续培养 24 小时。选择 2 小时的预处理时间是为了在炎症刺激前使 XTT 与细胞靶点充分作用。培养基中一氧化氮（NO）和前列腺素 E₂（PGE₂）的水平按照试剂盒制造商的说明书进行定量检测。

4. 定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）
将RAW264.7细胞（2 × 10⁶ 个细胞）接种于6孔板中，过夜培养后，用不同浓度的XTT预处理2小时，随后加入LPS（0.5 µg/mL）刺激24小时。使用TRIzol试剂按照制造商说明书提取总RNA。采用分光光度计测定RNA浓度和纯度，A260/A280比值>1.8的样品用于后续分析。

使用cDNA合成试剂盒，将2 µg总RNA在20 µL终反应体系中反转录为cDNA。采用SYBR Green法在实时PCR检测系统上进行定量实时PCR。引物序列如下：

iNOS 正向引物：5′-GGA TCT TCC CAG GCA ACC A-3′
iNOS 反向引物：5′-AAT CCA CAA CTC GCT CCA AGA TT-3′

COX2 正向引物：5′-CAA CAC CTG AGC GGT TAC-3′
COX2 反向引物：5′-GTT CCA GGA GGA TGG AGT-3′

IL-1β 正向引物：5′-GCC TTG GGC CTC AAA GGA AAG AAT C-3′
IL-1β 反向引物：5′-GGA AGA CAC AGA TTC CAT GGT GAA G-3′

IL-6 正向引物：5′-TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G-3′
IL-6 反向引物：5′-TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3′

TNF-α 正向引物：5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT-3′
TNF-α 反向引物：5′-GGC TAC AGG CTT GTC ACT C-3′

GAPDH 正向引物：5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′
GAPDH 反向引物：5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′

PCR扩增程序如下：95 °C预变性5分钟，随后进行39个循环，每个循环为95 °C变性15秒，60 °C退火30秒。相对基因表达水平采用2^−ΔΔCt法计算，以GAPDH作为内参对照。

5. 蛋白质印迹法
处理后，将RAW264.7细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液中进行匀浆。这些抑制剂在使用前新鲜配制，以防止蛋白质降解和去磷酸化。采用BCA法试剂盒测定总蛋白浓度。等量蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜。转膜后，用含Tween-20的TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶于室温封闭1小时，随后在4 °C下与一抗（1:1,000稀释）孵育过夜。接着在室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5,000稀释）孵育1小时。使用化学发光检测系统显影蛋白条带，并对条带强度进行分析 通过 密度测定定量分析

6. 免疫荧光检测
将 HeLa 细胞接种至 6 孔板中，并在 TNF-α 刺激（15 ng/mL）前，预先用 XTT（8 µM）处理 4 小时。选择该 4 小时预孵育时间是为了在 NF-κB 激活前实现靶点结合的最大化。细胞在室温下用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟，并用 0.25% Triton X-100 在室温下透化 15 分钟。用含 2% 牛血清白蛋白（BSA）和 10% 山羊血清的磷酸盐缓冲液（PBS）封闭后，细胞在 4 °C 下与抗 p65 一抗（1:250 稀释）孵育过夜，随后在室温下与 TRITC 标记的二抗（1:1,000 稀释）孵育 1 小时。细胞核用 DAPI（0.5 µg/mL）避光染色 5 分钟。使用荧光显微镜采集荧光图像。选择 HeLa 细胞的原因是其较大的胞质与细胞核比例，有利于观察 p65 的核转位。

7. 胞质与核蛋白分离
将 HeLa 细胞预先与 XTT 共同孵育 4 小时，随后用 TNF-α（15 ng/mL）刺激 30 分钟。收集细胞，用预冷的 PBS 洗涤，并按照生产商说明书，使用 commercially available 的核与胞质蛋白提取试剂盒提取胞质和核蛋白。所有操作均在冰上进行，以保持蛋白完整性。

8. 细胞热迁移分析（CETSA）
CETSA 按照先前所述方法进行¹⁴. 约 1 × 10⁷ HeLa 细胞被收集并重悬于含有蛋白酶抑制剂的 500 µL 冷 PBS 中，随后进行裂解 通过 在液氮中进行三次冻融循环。细胞裂解物在4 °C下以20,000 × g离心15分钟。将所得上清液均等分为两组，分别用XTT（100 µM）或DMSO在室温下处理1小时。使用XTT（100 µM）以增强CETSA实验的检测灵敏度。随后将样品分装至七个管中，在指定温度下加热3分钟，接着在室温下再孵育3分钟。收集可溶性蛋白组分用于免疫印迹分析。

9. 分子对接
分子对接分析按照先前所述方法进行¹⁴。从蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）获取IKKβ的晶体结构（PDB编号：3BRT和4KIK）。使用PyMOL（版本2.3.4）对蛋白质结构进行预处理，去除水分子、原始配体和杂质，并添加氢原子。计算Gasteiger电荷，使用AutoDock Tools（版本1.5.6）识别活性口袋。随后将蛋白质结构保存为PDBQT格式。

XTT 的结构在 Chem3D（版本 15.1）中生成，并通过能量最小化进行优化。via 采用 AutoDock Vina（版本 1.1.2）进行半柔性分子对接。构建的网格框完全覆盖活性口袋，其余所有参数均保持默认设置。选择结合能最低且构象最稳定的对接构象进行分析。根据已发表的标准，结合能低于 −5 kcal/mol 被认为表明具有较强的结合亲和力。进一步使用 PyMOL 可视化结合模式，并评估氢键、疏水相互作用、范德华相互作用以及潜在的结合位点。

10. 统计学分析
所有统计学分析均使用 GraphPad Prism 5.0 软件进行。数据以三次独立实验的均值 ± 均值标准误（SEM）表示。采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计学显著性检验，随后进行 Dunnett's 事后检验。当 p < 0.05 时，认为具有统计学显著性。

结果

XTT 抑制 LPS 或 TNF-α 刺激的 RAW264.7 巨噬细胞中 NO 和 PGE₂ 的产生
为了确定 XTT 的抗炎作用是否独立于细胞毒性，检测了在有或无 LPS 存在的情况下，XTT 处理后 RAW264.7 细胞的活力。在 0.5 至 8 µM 浓度范围内未检测到细胞活力明显下降，表明该化合物在实验条件下具有良好的耐受性（图 1）。基于这些结果，后续分析选用了 2–8 µM 的浓度。

LPS 刺激显著增加了培养基中 NO 和 PGE₂ 的累积。XTT 预处理以浓度依赖的方式减弱了这两种反应，而对未受刺激的细胞影响甚微。当 RAW264.7 细胞受到 TNF-α 刺激时，也观察到 NO 产生的类似减少。此外，形态学检查显示，经 LPS 刺激后，细胞从静息状态的圆形表型转变为活化形态，表现为细胞铺展增加和伪足形成¹⁵。在 XTT 处理的细胞中，这些变化明显减少（图 1

讨论

倍半萜内酯是一类具有多种药理活性的天然产物，包括抗菌、抗炎、解热和解毒作用¹⁵既往研究显示，XTT 是一种从植物中分离得到的醇内酯型倍半萜内酯 Xanthium sibiricum在人肝细胞癌细胞中表现出强烈的抗增殖和促凋亡作用¹³本研究评估了XTT在LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中的抗炎特性，并进一步探讨了其潜在的分子机制。活化的巨噬细胞可产生炎症介质和细胞因子，从而放大炎症信号。与该生物学过程一致，LPS刺激增加了NO和PGE₂的生成，而XTT则降低了这两种介质的水平，同时抑制了iNOS和COX2的表达^16,17,18,19在本研究中，LPS 刺激显著增加了 RAW264.7 细胞中 NO 和 PGE₂ 的产生，而已知的 IκB 抑制剂 BAY 11-7082 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
增强型化学发光试剂 D20A2:D21A2:D22A2:D23A2: D24A2:D25A2:D26A2:D27A2:D28A2: D29A2:D30A2:D29	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P90720	发光信号检测
辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗	Signalway Antibody  (南京)	L30118	特异性结合一抗
p65 一抗	Bioworld	BS4139	特异性识别 NF-κB p65 亚基蛋白
分光光度计	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000	SCR_018042
0.45 μm  聚偏氟乙烯膜	Millipore	PR05509	吸附蛋白质分子
1β-羟基-5α-氯-8-表-艾帕克汀	中国科学院成都生物研究所		天然单体化合物
All-in-One cDNA 合成超混合液	Bimake (上海)	B24408	逆转录
BAY11-7082	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	SF0011	IκB/IKK 抑制剂
Bcl2  抗体	Signalway Antibody  (南京)	32012	AB_3751037
双辛酸（BCA）试剂盒	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0010S	总蛋白定量
CCK-8 试剂	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	C0038	细胞活力测定
化学发光检测系统	Millipore, Bedford, USA	P90720	获取并处理发光信号
COX-2 抗体	Signalway Antibody  (南京)	33345	AB_3676692
DMSO	生工生物工程(上海)股份有限公司	A100231-0500	溶解化合物
GAPDH 抗体	Signalway Antibody  (南京)	41549	AB_3751036
凝胶成像仪	E-BLOT	Touch Imager Pro	图像采集与分析
梯度 PCR 仪	Biometra TADVANCED	Biometra Tadvanced 96SG	梯度退火温度
格里斯试剂	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	S0021S	NO 定量
人宫颈癌 HeLa 细胞	中国科学院细胞库	SCSP-504	人源性细胞
人 TNF-α	Novus Biologicals	210-TA	促炎性细胞因子
iNOS 抗体	Signalway Antibody  (南京)	48309	AB_2943634
激光共聚焦倒置显微镜	Olympus	FV1000	SCR_016840
LPS (E.coli 055:B5)	西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司	L6529	建立炎症模型
小鼠巨噬细胞 RAW264.7 细胞	中国科学院细胞库	SCSP-5036	鼠源性细胞
核蛋白与胞质蛋白提取试剂盒	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0027	分离胞质与核蛋白
PD98059	Selleck Chemicals  (上海)	S1177	MEK 抑制剂
P-ERK (Thr202/Thr185) 抗体	Signalway Antibody  (南京)	12548	检测 ERK 蛋白的磷酸化水平
p-IKKα/β (Ser176/Ser177) 抗体	Signalway Antibody  (南京)	11931	AB_3751034
p-IκBα (磷酸化-Ser32) 抗体	Signalway Antibody  (南京)	13776	AB_3751033
p-JNK (T183/T221) 抗体	Signalway Antibody  (南京)	13371	AB_3718662
p-p38 MAPK (Thr180) 抗体	Signalway Antibody  (南京)	11581	AB_3751032
前列腺素 E2 参数检测试剂盒	R&D Systems	KGE004B	AB_2894942
PS1145	Selleck Chemicals  (上海)	S7691	特异性 IKK 抑制剂
快速 SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0018S	蛋白质分离
实时荧光定量 PCR 系统	Bio-Rad	CFX96	SCR_018064
RIPA 裂解缓冲液	Bimake (上海)	P0013C	细胞裂解
SB203580	Selleck Chemicals  (上海)	S1076	p38 MAPK 抑制剂
SP600125	Selleck Chemicals  (上海)	S1460	JNK 抑制剂
SYBR Green	Bimake (上海)	B21202	用于实时定量
TRITC 标记的山羊抗小鼠 IgG	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	A0568	AB_2893016
TRITC 标记的二抗	北京百奥乐博科技有限公司‌	ZN1992	AB_3751143
TRIzol 试剂	Invitrogen	15596026	总 RNA 提取
Vinculin 抗体	Signalway Antibody  (南京)	41534	AB_3751035