多中心流式细胞术检测急性髓系白血病可测量残留病：基于LAIP/DfN及CD34+CD38- 白血病干细胞富集群体

摘要

本方案描述了一种多中心流式细胞术工作流程，用于通过白血病相关免疫表型/与正常细胞不同（LAIP/DfN）分析以及表型定义的CD34⁺CD38⁻富集的白血病干细胞群体，对急性髓系白血病可测量残留病进行定量。

摘要

根据ELN 2025指南，建议在急性髓系白血病（AML）临床试验中采用可测量残留病（MRD）随访来评估治疗反应。本研究旨在通过在参与AML临床试验的30个法国血液学实验室中采用统一的MRD流式细胞术方法，实现患者随访的标准化。为获得可比结果，该网络制定了从湿实验操作到临床报告的全流程推荐方案。我们设计了一个3管试剂 panel，每管均包含ELN推荐的8色必选通用标记物，用于在总细胞群及CD34⁺CD38⁻组分中富集的白血病干细胞（LSC）群体中识别白血病相关免疫表型/与正常细胞不同（LAIP/DfN）的模式。该方案采用CD34/CD38/CD45/CD117作为基础标记组合，第一管补充谱系标记物，第二管补充LSC相关标记物，第三管补充单核细胞及分化标记物。该panel可适用于8色、10色和12色检测体系，并可在多种常规流式细胞仪平台上实施。我们为各平台提出了适配的流式细胞仪设置建议。

使用8峰彩虹微球对四种平台之间的灵敏度进行了标准化。在大量裂解后进行免疫染色。为了检测各平台之间的偏差，采用新鲜的健康骨髓样本在四种平台上平行检测染色指数。各实验室共享常规骨髓质量控制样本，进行湿法外部质量评估（EQA），以验证方案的各个步骤。最后，通过共享MRD的FCS数据文件，采用干法EQA评估各中心数据分 析策略的标准化情况。该多中心方法的可行性依赖于仪器灵敏度和样本制备的协调统一，以及对分析操作人员的培训和系统化教育。

引言

可测量残留病（MRD）是指在治疗期间或治疗后仍持续存在的少量白血病细胞，这些细胞通过形态学方法无法检测到，尤其是在骨髓中原始细胞比例低于5%的完全缓解病例中。根据ELN 2025指南，建议在临床急性髓系白血病（AML）试验中采用MRD监测来评估治疗反应¹。除分子生物学方法（包括逆转录定量PCR（RT-qPCR）和高通量测序（NGS））外，多参数流式细胞术（MFC）也是一种常用的方法²。

为了获得一致的微小残留病（MRD）检测结果，特别是在临床试验中，可采用两种策略：将MRD检测集中在一个中心实验室进行，或实施一项确保各参与MRD检测的实验室之间结果可重复的方案。样本数量、试验规模以及各实验室处理大小不同样本量的能力，可能决定对这两种策略的选择。如果选择多中心策略，则必须解决不同流式细胞仪平台之间的差异，以及跨中心分析结果可比性的需求。

为此，我们描述了一种标准化的多中心、多平台MRD流式检测方法，该方法结合了白血病相关免疫表型/与正常表型不同（LAIP/DfN）分析以及表型定义的CD34⁺CD38⁻白血病干细胞（LSC）富集检测，已在30个法国血液学实验室中根据ELN建议及既往研究报告^3,4实施。

流式细胞术可在诊断时定义白血病的“特征”，即患者原始细胞上标志物的特异性表达模式：LAIP。治疗后，微小残留病（MRD）流式细胞术可用于监测在诊断时确定的LAIP。由于白血病原始细胞在治疗压力下可能发生演变并改变其免疫表型，因此必须系统性地实施第二种策略：DfN方法，该方法基于识别出与正常造血细胞不同的异常特征的细胞。该技术还可检测原始细胞在疾病进程及治疗过程中出现的新标志物。

在法国AML流式细胞术研究组中，该检测方案的设计基于先前发表的HOVON研究中关于白血病细胞模式定义的方法。目前尚无通用的LSC或LAIP标志物，因此我们设计了一个三管检测方案，可同时鉴定LAIP、DfN以及CD34⁺CD38⁻富集的LSC群体。所有三管均采用以CD34/CD38/CD45/CD117为基础的核心抗体组合，第一管补充了谱系标志物，第二管加入了与LSC相关的标志物，第三管则包含单核细胞谱系或分化标志物，以完善具有单核样原始细胞的AML病例中的LAIP定义。这三管样本均需在诊断时及随访样本中进行检测。

鉴于白血病发生的病理生理机制，研究重点已从白血病原始细胞群体转向识别最不成熟的细胞组分，即富含白血病干细胞（LSC）的细胞群。Dick 及其同事通过描述具有在免疫缺陷小鼠体内引发白血病潜能的 CD34⁺CD38⁻ LSC，证明了白血病的异质性^5,6。在诊断及随访过程中对 LSC 进行定量分析时，ELN DAVID 工作组正在努力标准化抗体组合及分析策略^1,7。目前，HOVON 和 ALFA 两个方案均采用二分类的 LSC 标志物，以在 CD34⁺CD38⁻ 细胞群中区分出富含 LSC 的细胞群体与正常的造血干细胞^8,9。

本文所述方法结合了标准化的样本制备、通用的抗体组合设计、平台适配的灵敏度设置、LAIP/DfN及CD34⁺CD38⁻ LSC富集分析、外部质量评估以及统一的临床报告，用于多中心急性髓系白血病微小残留病（AML MRD）流式监测。

方案

本方案遵循法国大学医院中心伦理委员会的建议和指南。所有患者均根据法国法律签署知情同意书。研究方案已获得里昂大学医院人类伦理委员会和里尔大学医院机构审查委员会伦理委员会的批准，符合《赫尔辛基宣言》的要求（HDF-AML 观察项目，CNIL 2214454v0）。对于异体移植，供者已纳入基于欧洲互联网的 ProMISE 数据库，并已提供知情同意，允许收集其个人数据。数据的提取与分析均按照当地伦理委员会的要求进行（CNIL2093819）。用于网络审查的所有 FCS 流式文件均通过 Python 脚本进行了完全匿名化处理。

1. 细胞仪设置

1. 使用8峰彩虹微球确定适用于每台流式细胞仪的目标值。
2. 根据表1所示目标值设置每台仪器，确保每个通道达到目标值±5%范围内。系统性验证该设置，以维持各平台的纵向灵敏度。
3. 针对每种抗体，使用单染管并结合补偿微球和/或细胞，建立补偿矩阵，具体方法依据各平台要求而定。
4. 将设置参数和补偿矩阵保存为鉴定为MRD LAIP/DfN、LSC和MonoGran（T1、T2、T3）的检测方法或实验方案，并在急性髓系白血病微小残留病（AML MRD）流式定量检测的样本采集过程中使用该检测方法或实验方案。

2. 湿实验步骤

1. 骨髓穿刺液
   1. 在诊断时以及包括 MRD1、MRD2、MRD3、MRD4 和复发在内的监测时间点，采集 1–2 mL 含 EDTA 的骨髓样本。
   2. 在 24–48 小时内将样本管送至参考流式实验室。
2. 用于形态学检查的骨髓涂片制备
   1. 将一滴骨髓穿刺液置于载玻片上，使用盖玻片或另一张载玻片轻轻涂布样本。
   2. 干燥 30 分钟后，用 May-Grünwald-Giemsa 染色（补充文件 1）。
3. 全细胞裂解
   1. 向 1–2 mL 骨髓样本中加入 15 mL NH₄Cl 裂解液，轻轻混匀，在室温下孵育 10 分钟。
   2. 在室温下以 450 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   3. 将细胞沉淀重悬于 10 mL PBS/0.1% BSA 中，在室温下以 450 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   4. 将细胞沉淀以 30 × 10⁶ 白细胞/mL 的浓度重悬于 PBS 中。
4. 细胞悬液的免疫染色
   1. 根据平台要求，将单克隆抗体分配至 T1、T2 和 T3 管中（表 2）。在抗体表格中注明每种抗体的克隆号、体积、目录编号和供应商。
      注：对于使用亮 violet 染料的每管，添加抗体前应使用亮染色缓冲液。
   2. 每管加入 2–3 × 10⁶ 个裂解后的细胞，总体积为 100 µL 细胞悬液。将细胞与抗体在室温避光条件下孵育 15 分钟。
   3. 用 3 mL PBS 洗涤细胞，在 450 × g 下离心 5 分钟，弃去上清液。
   4. 将染色后的细胞重悬于 300 µL PBS 中。
      注：可使用预混抗体混合物或经验证的干粉抗体管。

3. 流式细胞仪数据采集

1. 打开MRD检测或数据采集方案，使用针对MRD LAIP/DfN和LSC检测优化的设置及补偿矩阵。
2. 在诊断样本和MRD随访样本中，每管至少采集500,000至1,000,000个白细胞（WBC），以改善MRD细胞的聚类效果并提高低水平MRD检测的可靠性。
   注：对于LSC检测，Tube 2中至少采集1,000,000个WBC，以确保LSC定量具有足够的灵敏度（定量限LOQ为0.002%，检测限LOD为0.001%）^10,11。
3. 保存来自诊断和MRD样本的FCS数据文件。记录采集日期和患者标识信息，以便后续进行MRD和LSC分析。

4. 分析策略

1. 采用通用模板和通用点图序列，结合预定义的标准化设门策略，并根据各中心所使用的分析软件进行调整。
2. 应用设门策略，通过三种方法在 CD34⁺CD38^- 细胞群中识别白血病细胞：LAIP、DfN 和 LSC 分析。
3. 识别并排除潜在的非特异性事件和正常的生理性细胞群体，包括嗜碱性粒细胞、浆细胞样树突状细胞、造血前体细胞（hematogones）、浆细胞、有核红细胞、血小板聚集体、碎片及未裂解的红细胞。

5. LAIP/DfN 及生理群体的定义

1. 为在大量原始细胞中捕获LAIP，基于FSC-W与FSC-H绘制单细胞门。
2. 基于FSC与SSC绘制活细胞门。
3. 在CD45^dim/SSC上绘制原始细胞门。
4. 使用CD34/CD117绘制原始标志物门。
5. 使用固定的双参数点图绘制相关的LAIP门，包括LAIP1、LAIP2、LAIP3、LAIP4、LAIP5、LAIP6、LAIP7和LAIP8。
6. 生理性细胞群
   1. 使用以下顺序绘制造血祖细胞门：活细胞、FSC/SSC点图上的单个核细胞（MNC）、CD19/SSC点图、CD34/CD38点图，并使用CD45/SSC进行反向回溯门控。
   2. 使用以下顺序绘制嗜碱性粒细胞门：活细胞、FSC/SSC点图上的MNC、CD123/CD45RA（CD123⁺⁺CD45RA^-），排除CD19⁺造血祖细胞，并使用CD45/SSC进行反向回溯门控。
   3. 使用以下顺序绘制浆细胞样树突状细胞门：活细胞、FSC/SSC点图上的MNC、CD123/CD45RA（CD123⁺⁺CD45RA⁺），排除CD19⁺造血祖细胞，并使用CD45/SSC进行反向回溯门控。
   4. 使用CD36/CD45点图识别成红细胞、血小板聚集物、碎片及未裂解的红细胞，并使用CD45/SSC和FSC/SSC进行反向回溯门控。
7. LAIP方法
   1. 使用布尔运算符定义CD34⁺ 或CD117⁺原始急性髓系白血病（AML）中的微小残留病（MRD），如下所示：LAIP1 AND LAIP2 AND LAIP3 AND LAIP4 AND LAIP5 AND LAIP6 AND LAIP7 AND LAIP8 AND NOT 纯净CD36^bright+/CD45 AND 单细胞 AND 活细胞 AND CD34^+/CD117^+/原始标志物 AND (CD45/SSC原始细胞门 OR MNC CD34⁺)（图1）。
   2. 使用布尔运算符定义CD34^-CD117^- AML中的MRD，如下所示：LAIP1 AND LAIP2 AND LAIP3 AND LAIP4 AND LAIP5 AND LAIP6 AND LAIP7 AND LAIP8 AND NOT 纯净CD36^bright+/CD45 AND 单细胞 AND 活细胞 AND CD34CD117 AND CD45/SSC原始细胞门（图2）。
8. DfN方法
   1. 采用与LAIP方法相同的模板，并应用在参考骨髓样本上定义的空白区域（表3）。
   2. 当异常细胞簇与正常细胞在对数尺度上相隔0.5个数量级时，定义为异常细胞群¹²。
   3. 为在大量原始细胞中捕获DfN，使用FSC/SSC绘制活细胞门。
   4. 基于FSC峰值/SSC面积去除双联体，以绘制单细胞门。
   5. 使用FSC/SSC绘制单个核细胞（MNC）门。
   6. 应用去污染门（cleanup gate），利用CD45/CD36/SSC去除淋巴细胞。
   7. 应用去污染门，利用CD45/CD36去除成红细胞和碎片。
   8. 使用两个输入门CD34⁺/CD45/SSC和CD117⁺/CD45/SSC，根据先前发表的研究^12,13定义空白区域。
   9. 基于内部对照细胞群绘制每个DfN空白区域，包括用于跨系列表达标志物的淋巴细胞，以及用于缺失、减少或过表达标志物的正常髓系前体细胞。
   10. 将空白区域与参考骨髓样本进行比较，包括再生期、炎症状态及健康供体的骨髓样本。

6. LSC CD34⁺CD38^- 群体的定义

1. 根据具有双相表达且在健康骨髓来源的正常造血干细胞中无表达的LSC标志物，在CD34⁺CD38^-细胞群中识别诊断时富集的LSC细胞。
2. 使用以下设门顺序定义LSC输入门为MNC34⁺：活细胞、单细胞、单个核细胞（MNC），以及在CD45/CD34散点图中的CD34⁺细胞。
3. 基于CD38荧光减一对照（FMO）水平设定严格阈值，定义CD34⁺CD38^-细胞亚群（P6）。
4. 在试管1的P6亚群中，使用布尔运算符定义LSC富集细胞：P6CD7⁺ 或 P6CD33⁺ 或 P6CD19⁺ 或 P6CD56⁺，且非纯净的CD36^bright+，并满足单细胞、活细胞、MNC及MNC CD34⁺条件。
5. 在试管2的P6亚群中，使用布尔运算符定义LSC富集细胞：P6CD45RA⁺ 或 P6MIX⁺ 或 P6CD123⁺，且非纯净的CD36^bright+，并满足单细胞、活细胞、MNC及MNC CD34⁺条件。
6. 使用CD36去除最终MRD LSC门控中的非特异性事件（图3）。

7. CD34⁺ 群体中 CD38^- 阈值的确定

1. 将 CD38 通道设置得足够高，以清晰区分 CD38^- 群体与 CD38^+/ 群体。
2. 定义 P6 为 CD34⁺CD38^-，P7 为 CD34⁺CD38^low，P8 为 CD34⁺CD38^high。
3. 根据 CD38 强表达群体设定 CD38 通道，以浆细胞作为最亮的群体，并依据各平台的检测范围确定造血前体细胞（hematogones）的位置。
4. 采用经同型克隆 CD38 对照验证的 CD38 FMO 方法，定义 CD34⁺CD38^- 群体（P6）。
5. 利用造血前体细胞的阴性水平定义 CD34⁺CD38^low 群体（P7）。
6. 结合造血前体细胞的阳性水平与浆细胞的阴性水平，定义 CD34⁺CD38^high 群体（P8）（图 4）。
7. 在标准化组中，采用稳健的方法（如 CD38^- FMO 或同型克隆 CD38 对照）统一使用相同的 CD38^- 阈值水平。
8. 在 CD34⁺CD38^- 组分中至少使用一种异常免疫表型来定义富含白血病干细胞（LSC）的细胞。可包括 LSC 标志物如 CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123，或谱系标志物如 CD7/CD19/CD56/CD33。
9. 应用以下阈值：检测方法的定量限（LOQ）为 10^-4，检出限（LOD）为 10^-5；诊断时 LSC 阳性定义为占 CD45/SSC 门控原始细胞 ≥ 1%；MRD 随访中 LSC 阳性定义为占白细胞（WBC）≥ 0.01%。

8. 标准化临床流式报告

1. 每次报告结果时需提供以下信息：骨髓质量、MRD检测策略、LAIP描述、检测下限（LOD）和定量下限（LOQ）、阈值，以及结果解读。
2. 血液稀释与骨髓代表性
   1. 对每份MRD流式临床报告评估血液稀释情况，以评价结果的可靠性。
   2. 在适用情况下，采用先前描述的血液稀释方法之一（表4）^{7,14,15,16,17,18,19,20,21}。
   3. 作为补充方法，通过比较患者样本中观察到的CD34/WBC45比值与参考骨髓样本中的预期比值，计算骨髓代表性（图5）。
   4. 使用以下公式：
      P：纯度% = 100 × (n/L - s) / (m - s)
      s：正常外周血单个核细胞（MNC）中CD34⁺细胞比例：0.0005
      m：正常骨髓单个核细胞（MNC）中CD34⁺细胞比例：0.035
      L：MRD患者样本中WBC45⁺白细胞数量
      n：MRD患者样本中MNC CD34⁺细胞数量
   5. 将骨髓代表性作为样本质量评估的一部分进行报告。不得使用该值对MRD结果进行标准化校正。
   6. 按如下方式解读骨髓代表性：100%至10%，对骨髓来源CD34⁺细胞比例影响较小；10%至1%，提示MRD结果解读需谨慎；< 1%，结果不可解读。
3. 诊断时LSC定量
   1. 报告用于识别LSC富集细胞的免疫表型谱，例如CD34⁺CD38^-CD90^-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺。
   2. 以CD45/SSC设门的原始细胞中所观察到的百分比报告诊断时LSC结果。
   3. 将LSC占总原始细胞≥1%作为预后不良的阈值。
4. 随访期间通过LAIP/DfN检测MRD
   1. 报告用于识别MRD的LAIP表型谱，例如CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33⁺⁺CD117⁺CD7⁺。
   2. 将分析的灵敏度报告为技术阈值与LAIP表型谱相对于参考骨髓样本所观察到的稳健性值之间的较低者。
   3. 以采集的白细胞事件中至少包含50个细胞的最小细胞簇作为定量限。例如，采集500,000个白细胞时，LOQ为0.01%（1 × 10^-4）。
   4. 将LAIP/DfN结果报告为阳性、阴性、可检出但低于临床阈值，或不可检出。
   5. 将LAIP/DfN阳性定义为≥0.1%，以总CD45⁺白细胞百分比表示。
   6. 将LAIP/DfN阴性定义为< 0.1%。
   7. 对于可检出但低于阈值的结果，应报告代表性数值及灵敏度阈值。
   8. 对于不可检出的结果，应说明结果低于分析的灵敏度阈值，并根据需要添加备注，如血液稀释、LAIP特异性低或技术阈值不足等。
5. 随访期间通过LSC检测MRD
   1. 报告用于识别LSC富集细胞的免疫表型谱，例如CD34⁺CD38^-CD90^-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺。
   2. 以采集的白细胞事件中至少包含20个细胞的最小细胞簇作为定量限。例如，采集1,000,000个白细胞时，LOQ为0.002%（2 × 10^-5）。
   3. 将LSC结果报告为阳性、阴性、可检出但低于临床阈值，或不可检出。
   4. 将LSC阳性定义为≥0.01%，以总CD45⁺白细胞百分比表示。
   5. 将LSC阴性定义为< 0.01%。
   6. 对于可检出但低于阈值的结果，应报告代表性数值及灵敏度阈值。
   7. 对于不可检出的结果，应说明结果低于分析的灵敏度阈值，并根据需要添加备注，如血液稀释、LSC特异性低或技术阈值不足等。
6. 将本次MRD流式结果与既往监测时间点的结果进行整合分析。注明治疗过程中免疫表型谱的变化及MRD动态趋势，包括再次转阳、升高、稳定或下降。
7. 根据参考流式实验室规定的时间框架，通过临床流式报告将结果发送给申请检测的临床医生和研究人员。
8. 使用以下项目汇总标准化的临床流式报告：骨髓质量、MRD检测策略、LAIP描述、LOD和LOQ、阈值，以及结果解读（MRD阳性、MRD阴性（注明LOD值）或MRD可检出但无法定量）。

结果

平台镜像

在CANTO与NAVIOS两个平台的初步比较中，通过采集未补偿的8峰彩虹微球，调整电压设置以达到预设的目标MFI值。参考CANTO平台的目标值通过以下换算公式转至第二个NAVIOS平台：新MFI目标值 = 参考MFI目标值 / 256²²。为检测平台间的偏差，平行检测了10份新鲜EDTA抗凝的再生障碍性骨髓样本。比较了各样本及各平台间阳性与阴性群体的染色指数，结果显示分离效果相当（补充文件-图S3）。

研究期间，检测平台逐步从8色和10色配置升级为LYRIC以及DxFLEX的12色和13色配置（补充文件1）。使用8峰彩虹微球和采用相同抗体组合染色的健康骨髓样本，在四个平台上实现了跨平台镜像校准。仅通过调整对数显示尺度来检查峰的重叠情况。在应用所定义的设置后，细胞染色模式实现重叠，主要差异表现为细胞群在对数尺度上的平移（图6 和 补充文件-图S4与图S5）。

不同流式实验室间的质量评估与可重复性

在实施初始的标准操作程序以及平台升级期间的更新后，各参与中心定期使用新鲜的参考骨髓样本进行湿式外部质量评估（EQA）。湿式EQA用于验证湿实验操作流程、平台设置以及通用的设门分析策略。报告的细胞群包括以白细胞CD45⁺为分母的单个核细胞中CD34⁺细胞，以及以白细胞CD45⁺为分母的P6阶段CD34⁺CD38⁻细胞。结果通过z分数和/或图形化表示进行分析（图7）。

自2017年以来共进行了五轮湿样本室间质量评价（EQA），参与的实验室数量分别为22、15、17、26和25家。对于白细胞CD45⁺中%CD34⁺CD38⁻细胞和白细胞CD45⁺中%单个核细胞（MNC）CD34⁺细胞的结果如下：EQA1，平均值分别为0.015%和1.01%（标准差SD为0.09%和0.24%）；EQA2，0.09%和1.02%（SD为0.046%和0.36%）；EQA3，0.097%和1.46%（SD为0.024%和0.32%）；EQA4，0.024%和2.16%（SD为0.015%和0.59%）；EQA5，0.027%和1.9%（SD为0.008%和0.45%）。

为了在各中心之间实现MRD分析策略的标准化，湿性EQA通过使用共享的FCS文件进行干性EQA作为补充，这些文件用于诊断、MRD随访以及参考骨髓样本。在基于系列均值±2SD的中心化区间内，纳入了超过90%的本地分析数据：DryEQA2017中，23个参与实验室中的22个实验室的数据符合该标准，占比为95.6%和91.3%；DryEQA2024中，25个参与实验室中的24个实验室的数据全部符合标准，占比达100%（图8）。针对WBC CD45⁺中的%MRD LAIP和WBC CD45⁺中的%MRD LSC CD34⁺CD38⁻，共进行了两轮干性EQA。DryEQA2017显示LAIP的平均值为11.9%（SD 1.35%），LSC的平均值为0.16%（SD 0.05%）。DryEQA2024显示MRD LAIP的平均值为0.35%（SD 0.26%），MRD LSC CD34⁺CD38⁻的平均值为0.18%（SD 0.06%）。

使用LAIP/DfN和LSC策略进行多模态AML MRD流式检测的示例

为了定量微小残留病（MRD），系统地采用了三种方法。第一种方法在诊断时使用布尔门控法建立白血病原始细胞的LAIP图谱，并将该图谱应用于随访的骨髓样本（图9A）。第二种方法采用DfN分析，识别具有非典型表达模式的异常细胞，这些模式在正常髓系分化定义的“空盒”区域中未观察到（图9B）。第三种方法利用二分型LSC标志物和布尔门控法，在CD34⁺CD38⁻组分中定量富集的白血病干细胞（LSC）细胞（图10）。

参考骨髓样本

共研究了135份参考骨髓样本，包括25份健康供者骨髓样本、34份炎症性骨髓样本和76份再生骨髓样本。健康供者骨髓来自健康供者，中位年龄为31岁，年龄范围为21–49岁。炎症性骨髓来自因血细胞减少症（包括贫血、中性粒细胞减少或血小板减少）而就诊的患者，骨髓穿刺结果显示无血液系统恶性肿瘤；中位年龄为52岁，年龄范围为25–82岁。再生骨髓样本采集于急性髓系白血病（AML）随访期间的不同化疗时间点，包括诱导治疗或巩固治疗后，且NPM1或CBF转录本的分子微小残留病（MRD）检测结果为阴性；中位年龄为54岁，年龄范围为18–65岁。

通过显微镜检查对这些样本的质量进行了验证。预期的理论CD34百分比⁺ 使用 Brooimans 公式计算了未稀释骨髓样本中的细胞数量，结果 >所有样本的阈值为90%。这些样本用于建立LAIP/DfN和LSC分析的阈值，并计算血液稀释和纯度公式。针对健康供者、炎症性和再生性骨髓样本，研究了标志物表达MFI随骨髓状态的变化情况（补充文件-图S6）。已确定最相关参数的参考值，包括 %MNC CD34⁺ 来自白细胞，P6期CD34阳性百分比⁺CD38⁻ 在单个核细胞 CD34⁺，P7代CD34阳性率⁺CD38^暗淡 在单个核细胞 CD34⁺，以及 %P8 CD34⁺CD38^高 在单个核细胞 CD34⁺ (补充文件-图S6).

灵敏度与线性的评估

通过检测一组参考骨髓样本（包括再生性、炎症性和健康供体骨髓）中异常事件的数量，评估LAIP/DfN和LSC特异性设门的灵敏度。将已知数量的原始细胞在健康骨髓中进行系列稀释，用于验证微小残留病（MRD）检测的定量下限和线性范围（图11 和 图12）。

图1：使用原始标志物（CD34⁺/CD117⁺）在1号管中对急性髓系白血病（AML）进行微小残留病（MRD）相关白血病免疫表型（LAIP）分析的设门策略。 第一行：依次进行时间设门、基于前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）的活细胞设门、基于FSC-W与FSC-H的单细胞设门、基于CD45与SSC的白细胞（WBC）CD45⁺细胞设门、基于CD45^dim/SSC的原始细胞设门、基于FSC-A/SSC-A的单个核细胞（MNC）设门、基于CD45与CD34图的MNC CD34⁺细胞设门，以及基于CD34与CD117图的原始标志物设门。第二行和第三行：用于定义最重要LAIP设门（LAIP1–LAIP8）的固定双参数点图。MRD LAIP通过以下布尔逻辑策略定义：时间 AND 活细胞 AND 单细胞 AND （原始细胞 OR MNC CD34⁺） AND 原始标志物（CD34^+/−CD117^+/−） AND LAIP1 AND LAIP2 AND LAIP3 AND LAIP4 AND LAIP5 AND LAIP6 AND LAIP7 AND LAIP8。在本示例中，MRD占WBC CD45⁺细胞的6.8%，而健康骨髓中的水平为0.04% ± 0.03。右侧：用于定量分析的最终MRD设门的反向设门，可用于排除非特异性事件、有核红细胞和碎片。缩写：AML = 急性髓系白血病；MRD = 可测量残留病；LAIP = 白血病相关免疫表型；FSC = 前向散射；SSC = 侧向散射；WBC = 白细胞；MNC = 单个核细胞；hBM = 健康骨髓。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：使用第3管中的成熟原始细胞（CD34⁻CD117⁻）进行急性髓系白血病（AML）MRD LAIP分析的设门策略。 第一行：按时间顺序设门，包括时间、基于FSC与SSC的活细胞、基于FSC-W与FSC-H的单细胞、基于CD45与SSC的白细胞CD45⁺细胞、CD45^dim/SSC上的原始细胞、FSC-A/SSC-A上的单个核细胞（MNC）、CD45与CD34图上的MNC CD34⁺细胞，以及CD34与CD117图上的成熟原始细胞门。
第二行和第三行：用于定义最重要LAIP门（LAIP1–LAIP8）的固定双参数点图。MRD LAIP通过以下布尔逻辑策略定义：时间 AND 活细胞 AND 单细胞 AND 原始细胞 AND CD34⁻CD117⁻原始细胞 AND LAIP1 AND LAIP2 AND LAIP3 AND LAIP4 AND LAIP5 AND LAIP6 AND LAIP7 AND LAIP8。在本示例中，MRD占白细胞CD45⁺的15%，而健康骨髓中的水平为0.09% ± 0.02。
右侧：用于定量分析的最终MRD门的反向设门，可用于清除非特异性事件。缩写：AML = 急性髓系白血病；MRD = 可测量残留病；LAIP = 白血病相关免疫表型；FSC = 前向散射；SSC = 侧向散射；WBC = 白细胞；MNC = 单个核细胞；hBM = 健康骨髓。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：正常造血干细胞（nHSCs）和富含白血病干细胞（LSC）的细胞在 CD34⁺CD38⁻ 细胞群（第2管）中的设门策略。（A）正常造血干细胞（nHSCs）和（B）富含白血病干细胞（LSC）的细胞在 CD34⁺CD38⁻ 细胞群（第2管）中的分析。第一行：依次设门步骤包括时间、基于FSC与SSC的活细胞、基于FSC-W与FSC-H的单细胞、基于CD45与SSC的白细胞CD45⁺细胞、CD45dim/SSC门控的原始细胞、FSC-A/SSC-A门控的单个核细胞（MNC），以及CD45与CD34图上的MNC CD34⁺细胞。
第二至第四行：用于定义P6（CD34⁺CD38⁻）、P7（CD34⁺CD38^low）和P8（CD34⁺CD38^high）的固定双参数点图，同时结合最关键的二分型LSC标志物，包括MIX（CLL1/TIM3/CD97）、CD123和CD45RA。微小残留病（MRD）LSC通过以下布尔逻辑策略定义：时间 AND 活细胞 AND 单细胞 AND 原始细胞 AND MNC AND MNC CD34+ AND P6 AND (P6 LSC MIX⁺ OR P6 LSC CD123⁺ OR P6 LSC CD45RA⁺)。
右侧：用于定量分析的最终MRD LSC门的反向设门，可用于清除非特异性事件。
（A）健康骨髓样本中的nHSCs：nHSCs（紫色事件）为CD34⁺CD38⁻、MIX⁻（CLL1/TIM3/CD97）、CD45RA⁻、CD123⁻、CD117⁺、HLA-DR⁺、CD36⁻和CD90⁺。nHSC CD34⁺CD38⁻细胞群占白细胞CD45⁺的0.02%，LSC CD34⁺CD38⁻细胞为阴性。报告的检测方法阈值为定量限（LOQ）0.0001%和检测限（LOD）0.001%。
（B）急性髓系白血病（AML）样本中的LSC富集细胞：LSC富集细胞（橙色事件）为CD34⁺CD38⁻、MIX⁺（CLL1/TIM3/CD97）、CD45RA⁺、CD123⁺、CD117⁺、HLA-DR⁺、CD36⁻和CD90⁺。LSC CD34⁺CD38⁻细胞群占白细胞CD45⁺的3.7%。缩写：nHSCs = 正常造血干细胞；LSC = 白血病干细胞；MNC = 单个核细胞；WBC = 白细胞；SSC = 侧向散射；MIX = CLL1/TIM3/CD97；HLA-DR = 人类白细胞抗原-DR；LOQ = 定量限；LOD = 检测限。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：使用 CD38 荧光减一（FMO）通道在 CD34⁺ 群体中定义 CD38⁻ 阈值。 第一行：参考群体的设门，包括基于 CD45/SSC 的原始细胞、单个核细胞（MNC）中的 CD19⁺ 细胞以及 MNC 中的 CD34⁺ 细胞。
第二行：CD38 FMO 通道中的信号水平。第一行为原始细胞，第二行为 MNC CD19⁺ 细胞，第三行为 MNC CD34⁺ 细胞。橙色线表示定义 P6 CD34⁺CD38⁻ 设门的阈值。
第三行：CD38 PE-Cy7 信号水平。第一行为原始细胞，第二行为 MNC CD19⁺ 细胞（其 CD38 血岛细胞水平用于定义 P8 CD34⁺CD38^high），第三行为 MNC CD34⁺ 细胞，其中橙色为 P6 CD34⁺CD38⁻ 细胞，绿色为 P7 CD34⁺CD38^low 细胞，蓝色为 P8 CD34⁺CD38^high 细胞。缩写：FMO = 荧光减一；MNC = 单个核细胞；SSC = 侧向散射；PE-Cy7 = 藻红蛋白-花青素 7；P6 = CD34+CD38− 组分；P7 = CD34+CD38low 组分；P8 = CD34+CD38high 组分。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：基于单个核细胞CD34⁺细胞评估骨髓样本的代表性。（A）单个核细胞CD34⁺细胞的设门策略及用于公式计算的参数：n，单个核细胞CD34⁺细胞数量；L，白细胞CD45⁺细胞数量；s，正常外周血中单个核细胞CD34⁺细胞的比例；m.，参考正常骨髓中观察到的单个核细胞CD34⁺细胞比例。（B）外周血（PB）稀释骨髓（BM）对骨髓样本中CD34⁺细胞来源影响的示意图。（C）用于解读骨髓纯度的标准。缩写：BM = 骨髓；PB = 外周血；MNC = 单个核细胞；WBC = 白细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：四个流式细胞仪平台间表达模式的比较。
使用各平台的预设参数及比例调整设置，对一份正常的骨髓（BM）样本在四个流式细胞仪平台上同时进行检测。第一行显示单个核细胞（MNC）在CD45/CD33散点图中的分布；第二行显示MNC细胞在原始细胞标志物CD34/CD117散点图中的分布；第三行显示原始细胞在CD34/CD38散点图中的分布；第四行显示P6阶段CD34⁺CD38⁻细胞在CD45RA/CD90散点图中的分布。缩写：BM = 骨髓；MNC = 单个核细胞；P6 = CD34⁺CD38⁻细胞群。请点击此处查看该图的放大版本。

图 7：参与流式实验室间湿实验EQA的重复性。（A）小提琴图显示在五轮湿实验EQA及参与的流式实验室中，白细胞CD45⁺细胞内%P6 CD34⁺CD38⁻细胞的分布情况。（B）小提琴图显示在五轮湿实验EQA及参与的流式实验室中，白细胞CD45⁺细胞内%MNC CD34⁺细胞的分布情况。缩写：EQA = 外部质量评估；P6 = CD34+CD38− 组分；WBC = 白细胞；MNC = 单个核细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：LAIP/DfN和LSC MRD检测的干式EQA评估。（A）使用来自8色抗体组合的六个共享FCS文件进行的干式EQA2017练习，包括用于第1管LAIP和第2管LSC分析的AML诊断样本、AML MRD样本以及正常骨髓参考样本。该练习分发给23个参与实验室。（B）使用来自12色抗体组合的六个共享FCS文件进行的干式EQA2024练习，包括用于第1管LAIP和第2管LSC分析的AML诊断样本、AML MRD样本以及正常骨髓参考样本。该练习分发给24个参与实验室。（C）在湿式EQA2025中测量的WBC CD45⁺细胞中%MNC CD34⁺细胞和%nHSC P6 CD34⁺CD38⁻细胞的跨平台比较结果，共享给25个参与实验室。MNC CD34⁺细胞的预期值为1.6%，nHSC P6 CD34⁺CD38⁻细胞的预期值为0.02%。缩写：EQA = 外部质量评估；LAIP = 白血病相关免疫表型；DfN = 异常于正常；LSC = 白血病干细胞；MRD = 可测量残留病灶；FCS = 流式细胞术标准；AML = 急性髓系白血病；MNC = 单个核细胞；nHSC = 正常造血干细胞；WBC = 白细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图9：使用LAIP/DfN方法进行MRD检测的代表性示例。（A）采用LAIP/DfN方法进行MRD检测的示例。左侧显示诊断样本中白血病细胞的LAIP图谱，右侧显示将相同的LAIP图谱应用于随访样本的结果，其中MRD细胞群以黑色标出。（B）采用DfN方法进行MRD检测的示例。每对散点图将健康骨髓（hBM；正常，左图）与MRD随访骨髓样本（DfN，右图）进行比较。“空白区域”在正常骨髓中定义，随后在随访样本中评估该空白区域内是否存在白血病细胞，异常细胞群以黑色标出。缩写：MRD = 可测量残留病灶；LAIP = 白血病相关免疫表型；DfN = 异常于正常；hBM = 健康骨髓。请点击此处查看该图的放大版本。

图 10：诊断及随访时 CD34⁺CD38⁻ 富集型白血病干细胞（LSC）的代表性检测结果。（A）急性髓系白血病（AML）诊断样本中 LSC 富集细胞检测示例。左侧显示 LSC 富集细胞的免疫表型特征，橙色细胞群在 CD34⁺CD38⁻ 细胞亚群中表达 MIX（CLL1/TIM3/CD97）、CD123、CD45RA、CD117、HLA-DR 和 CD36。
（B）同一患者随访样本，显示具有相同免疫表型特征（橙色细胞群）的可测量残留病（MRD）LSC 富集细胞仍持续存在。缩写：LSC = 白血病干细胞；AML = 急性髓系白血病；MRD = 可测量残留病；MIX = CLL1/TIM3/CD97；HLA-DR = 人类白细胞抗原-DR。请点击此处查看该图的放大版本。

图11：LSC检测的分析灵敏度。 (A) LSC检测空白限（LOB）的评估。左侧显示了来自五个健康骨髓样本的五个FCS文件合并后CD34⁺CD38⁻事件的定量结果（共获取5,148,000个白细胞事件）。右侧显示回溯至CD45/SSC散点图上属于LSC布尔门控的事件数量（14个事件），对应空白限为<0.0005%（5 × 10^-6）。 (B) LSC定量线性评估。左侧显示将LSC富集细胞在健康骨髓样本中进行系列稀释的加标实验。右侧显示测得的微小残留病（MRD）值与理论值之间的相关性，对应定量限（LOQ）为2 × 10^-5（0.002%）。缩写：LSC = 白血病干细胞；LOB = 空白限；FCS = 流式细胞术标准文件格式；WBC = 白细胞；MRD = 可测量残留病；LOQ = 定量限。 请点击此处查看该图的放大版本。

图12：MRD LAIP检测的线性范围与定量范围。 (A) 通过对具有不同LAIP的原始细胞在健康骨髓中进行系列稀释，评估MRD LAIP定量的线性关系，显示测得的MRD值与理论值之间的相关性，不同LAIP对应的定量限（LOQ）有所不同，且LOQ <0.1%。 (B) 不同LAIP对应的定量范围。红线表示0.1%的临床阈值。所有测试的LAIP均达到了该临床阈值。缩写：MRD = 可测量残留病灶；LAIP = 白血病相关免疫表型；LOQ = 定量限。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光 铬	峰值	LYRIC12c	峰值	DxFlex13c	峰值	NAVIOS10c	峰值	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
PE	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
ECD	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5.5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
APC	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

表1：使用8峰彩虹微球时各流式细胞仪平台的目标值。 针对每种流式细胞仪平台（Canto、Lyric、Navios、DxFlex）列出了具体的目标值。所选择的保留峰接近于原始细胞（blast cells）所观察到的中位荧光强度（MFI）。这一点对于基于光电倍增管（PMT）的流式细胞仪尤为重要，因为在这些仪器中，信号强度并不随PMT电压的增加而呈线性增长。相比之下，在基于雪崩光电二极管（APD）的流式细胞仪中，信号强度随增益呈线性增加，因此所有检测器均可使用相同的峰；而在基于PMT的流式细胞仪中，每个通道则需要使用不同的峰。缩写：MFI = 中位荧光强度；PMT = 光电倍增管；APD = 雪崩光电二极管。请点击此处下载该表格。

CANTO 8C /NAVIOS 8c

FITC

PE

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

APC

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

管1 LAIP 8c

CD7 5µL /CD56 5 µL

CD13 5µL

CD33 10µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD19 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

试管 2 LSC 8c

CD90 5µL

MIX3(2 0.5 µL/Ac

CD123 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD45RA 5µL

CD117 5 µL

CD45 5µL

T3 补充剂 mentaire Gran 8c

CD15 5 µL

CD56 5 µL

HLADR 10µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD11b 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5µL

T3 补充剂 肠的 - Monos 8c

CD36 5 µL

CD64 5µL

CD14 10µL

HLADR 5 µL

CD34 5 µL

CD4 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5µL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

LYRIC 10-12c

FITC

PE

ECD

PerCPCy5.5

PECy7

APC

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

1号管LAIP 12c

CD7 5µL

CD13 5 µL

CD33 10µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

HLADR（5 µL）

CD19 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5µL

CD56 5 µL

CD10 2 µL

CD36 2µL

试管 2 LSC 12c

CD90 5 µL

MIX3(2. 5 µL/Ac

CD123 5µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

HLADR (5 µL)

CD45RA 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

CD200 5 µL

CD19 5 µL

CD36 2 µL

T3 补充剂 mentaire 12c-单体

CD15 5µL

CD64 5 µL

CD33 10 µL

CD38 5µL

CD34 5 µL

HLADR (5 µL)

CD4 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5µL

CD14 5 µL

CD11b 5 µL

CD36 2µL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

PE

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 Navios 10c

CD7 10µL

CD13 10µL

HLADR 5 µL

CD33 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD56 10 µL

CD19 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

T2 Navios 10c

CD90 5 µL

MIX3(2.5 µL/Ac

CD19 5 µL

CD123 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD36 5 µL

CD45RA 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5µL

T3 补充剂 mentaire 10c 单核细胞

CD15 5 µL

CD4 5 µL

HLADR 5 µL

CD33 5 µL

CD11b 5 µL

CD34 5 µL

CD36 5 µL

CD14 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5µL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13c

FITC

PE

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13c

CD7 10µL

CD13 10 µL

HLADR 5 µL

CD33 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD56 10 µL

CD19 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5µL

CD36 5 µL

CD10 2 µL

/

T2 DxFLEX 12-13c

CD90 5 µL

MIX3(2.5 µL/Ac

CD19 5 µL

CD123 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD36 5 µL

CD45RA 5µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

/

CD200 5 µL

HLADR snv786（3 µL）

T3 补充剂 mentaire 12c 单核细胞

CD15 5 µL

CD4 5 µL

HLADR 5 µL

CD33 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD36 5 µL

CD14 5 µL

CD117 5µL

CD45 5 µL

CD64 5 µL

CD11b 5 µL

/

表2：AML MRD LAIP/DfN和LSC分析的抗体组合配置。 该表格根据流式细胞仪平台总结了8色、10色、12色和13色抗体组合的配置方案。其中，Tube 1用于LAIP/DfN分析，Tube 2用于CD34⁺CD38⁻ LSC富集细胞分析，Tube 3用于单核/粒细胞分化标志物分析。各平台对应的抗体用量及荧光染料分配均在表中列出。MIX3对应CD97、TIM3和CLL1。缩写：AML = 急性髓系白血病；MRD = 可测量残留病；LAIP = 白血病相关免疫表型；DfN = 与正常不同；LSC = 白血病干细胞；MIX3 = CD97/TIM3/CLL1。请点击此处下载该表格。

髓系前体细胞上正常表达标志物的完全缺失

CD13++CD33-/CD34+ 或 CD117+

CD13-CD33++/CD34+ 或 CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

髓系前体细胞上跨谱系淋巴样标志物的表达

CD7+CD13+/CD34+ 或 CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ 或 CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ 或 CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ 或 CD117+

CD19+CD117+/ 或 CD13+ 或 CD33+

髓系前体细胞上的过表达

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

髓系前体细胞上表达降低

CD38loCD34+CD33+CD117+

表3：基于LAIP的DfN“空盒”定义。 该表格列出了用于识别异常髓系前体细胞群的预定义“不同于正常”（DfN）“空盒”模式。类别包括正常表达标志物的完全缺失、跨谱系淋巴系标志物表达、标志物过表达以及髓系前体细胞上标志物表达减少。缩写：LAIP = 白血病相关免疫表型；DfN = 不同于正常。请点击此处下载该表格。

Holdrinet 等17
Broolmans 等15
骨髓纯度 = (1 − (GRMO/GRSG) × (GBSG/GBMO)) × 100	>80%
Björlund 等19	GPA > 15%
	CD3 < 20%
Loken 等18	CD16high < 30%
Theunissen 等20；Dworzak 等21
流式或对照 DIL 细胞学：PNN < 40%，Ebl > 5%，Ly < 20%	CD16++ CD11b++ < 40%
	GPA > 5%
	CD3 < 20%
骨髓纯度百分比：MNC 34+/WBC45+	骨髓纯度 100-10%

表4：AML MRD流式报告中骨髓稀释对照方法。 本表总结了已发表的可用于AML MRD流式临床报告的骨髓稀释及代表性对照方法。至少应采用一种稀释对照方法，以支持MRD结果的解读。CD34/WBC45⁺骨髓纯度评估方法作为补充的质量评估手段纳入其中。缩写：AML = 急性髓系白血病；MRD = 可测量残留病；BM = 骨髓；WBC = 白细胞；CD34/WBC45⁺ = CD45⁺白细胞中的CD34⁺细胞。请点击此处下载该表格。

补充文件1：附加背景信息、平台标准化、参考骨髓样本及预后支持材料。 本补充文件包含与LSC鉴定、急性髓系白血病（AML）表型异质性、跨平台一致性验证、各平台特异性优化、参考骨髓标志物表达谱、纵向抗体组合演变以及诊断时LSC定量所用预后阈值相关的支持性图表。这些材料为多中心微小残留病（MRD）流式细胞术工作流程提供了额外背景信息，包括CD34⁺CD38⁻ LSC富集细胞检测的依据、平台标准化的技术基础，以及用于解读参考骨髓背景信号、抗体组合更新和临床阈值选择的支持性数据。请点击此处下载该文件。

讨论

方案中的关键步骤

样本质量对于准确的微小残留病（MRD）和白血病干细胞（LSC）定量至关重要。新鲜骨髓样本应于室温运输，并在采集后24–48小时内尽快处理，必要时最迟不超过72小时²³。每次检测时均应评估血液稀释情况，并将其纳入临床流式报告中。临床医生应明确治疗的时间点，例如诱导治疗后、巩固治疗后、靶向免疫治疗后、阿扎胞苷/维奈克拉等低强度治疗后，或异基因移植后。分化谱系特征与治疗方案及时间点密切相关，在解读MRD结果时应予以综合考虑。在纵向随访过程中，应通过使用彩虹校准微球定期检测目标值、定期参加外部质量评估（EQA），以及在整个研究期间对FCS文件进行同行评审，以保持仪器检测灵敏度和分析结果的稳定性与可靠性。

通过定期开展基于网络的流式细胞术小组教育培训，保持了微小残留病（MRD）流式定量的高度标准化和多中心间可靠性。每月至少举行一次网络培训课程，多年来已讨论和审查了100多个MRD LAIP/DfN、MRD LSC或诊断性LSC定量病例。这种持续教育至关重要，因为流式数据的解读需要高度专业的生物学家，尤其是在处理低水平MRD、生理性背景细胞群、骨髓再生情况以及治疗过程中的表型转换时。

对富集白血病干细胞（LSC）的CD34⁺CD38⁻细胞群进行定量是另一个关键步骤。目前尚无通用标志物可用于捕获正常的造血干细胞或LSC。HOVON研究组在急性髓系白血病（AML）的诊断和随访中引入了LSC监测，采用包含一组相关“双相性”LSC标志物的8色抗体组合³。双相性标志物定义为在正常造血干细胞中无表达，但在富集LSC的细胞群中呈阳性表达，其表达模式可表现为弱、中等、强、异质性或双峰型。人们关注将多种特异性的双相性LSC标志物（如CLL1、TIM3和CD97）整合至同一检测通道，因为只要其中任一标志物呈阳性，即可检测到富集LSC的细胞。其他标志物则应分别使用独立通道检测，因其表达可能与正常造血干细胞重叠，具体取决于骨髓状态，例如再生或应激状态的骨髓²⁴。对富集LSC细胞的完整定义基于布尔逻辑运算符，包括在CD34⁺CD38⁻细胞亚群中异常表达的标志物。由于该定义仍属表型层面，因此应将该细胞群解读为CD34⁺CD38⁻富集LSC细胞，而非在每一份样本中均经功能验证的LSC。该LSC检测方案同样适用于采用相同流程的伴有原始细胞增多的骨髓增生异常综合征（MDS）和AML伴骨髓增生异常相关改变（AML MRC）患者。

方法的改进与故障排除

在平台和检测面板发展过程中，实验室网络内部必须保持标准化/协调化的方法，特别是在从8色到10色面板过渡到12色至13色面板时。随着仪器的演进，需要在整个临床研究过程中保持抗体核心组合的一致性以及对表型异常检测的相同灵敏度。在平台演进过程中，核心抗体（CD34/CD38/CD45/CD117）所使用的荧光染料在所有仪器之间保持稳定且通用。然而，由于不同仪器特有的光学滤光片配置，某些通道需要更换荧光染料，这就要求采用协调化策略。当从PMT检测器流式细胞仪切换至APD检测器流式细胞仪时，必须考虑APD检测器在长波长范围内的高灵敏度。因此，在某些情况下，必须调整特定抗体所标记的荧光染料，以维持相同的染色指数，并避免通道间信号过度扩散，从而采取优化策略。目前的临床流式细胞仪支持12至13色检测面板，通过增加可排除微小残留病（MRD）设门中污染细胞的标志物，提高了对LAIP 的检测特异性，并改善了结果判读。然而，这也增加了数据分析的复杂性²³。

从8色升级到12色检测面板在某些情况下提高了微小残留病（MRD）评估的敏感性和特异性（补充文件1）。在1号管中，加入了HLA-DR、CD36、CD10和CD56，并与CD7分离开来。在2号管中，加入了HLA-DR、CD36、CD200和CD19。在3号管中，加入了CD4、CD64、CD38、CD36和CD14。HLA-DR现在在每管中系统性地与CD38联合使用，有助于更清晰地界定白血病相关免疫表型（LAIP）及异常分化模式。CD36目前也在每管中系统性地加入，是识别有核红细胞、红细胞、血小板及碎片的关键标志物，并有助于优化最终的MRD设门。LSC管中的CD19也有助于识别造血前体细胞（hematogones）。将单核细胞和粒细胞分化标志物组合于同一管中，可更清晰地区分单核系和粒系的分化模式，并有助于识别异常表型以确定LAIP。从8色升级至10色面板时，主要改进来自LAIP的检出能力，尤其是1号管中将HLA-DR和CD56与CD7分离，以及2号管中加入HLA-DR和CD19。从10色升级至12色面板时，改进主要源于在每管中加入CD36后，对原始细胞和LSC门的进一步净化，辅以1号管中的CD10和2号管中的CD200。这一改进对于MRD水平低于定量限但高于检测限的患者尤其有用。总体而言，大多数在临床阈值≥0.1%时MRD阳性的患者使用8色面板即可检出；然而，增加管中标志物数量可提高MRD评估的特异性和判读准确性，尤其对于低水平MRD，这一点在ELN 2025指南中已有提及。

方法的局限性

采用多中心方法可能具有挑战性。在急性髓系白血病（AML）临床试验中实施微小残留病（MRD）流式细胞术之前，必须完成若干关键步骤，以验证该策略的可行性：仪器灵敏度和样本制备的标准化、对分析操作人员的培训以及系统化的教育²⁵。随着技术平台的发展，多中心、多平台策略也需相应调整，以保持结果的稳健性和可重复性。这包括标准化（对同一类型平台使用相同的抗体组合和设置）、协调化（在多个不同平台之间使用相同的抗体组合并协调设置参数）以及优化（针对每个平台采用适配的抗体组合和特定设置）。

血液稀释是MRD流式定量中最具有挑战性和关键的问题之一。本方案中描述的CD34/白细胞代表性公式应作为骨髓样本的补充质量控制措施使用，不应用于标准化MRD结果。其解释可能受到骨髓再生、治疗效应、残留病灶以及较不强烈治疗方案的影响。同样，CD56、CD123和CD45RA等标志物也不应被单独解释为DfN或LSC标志物。这些标志物应在完整的设门策略、去除非特异性信号门、参考骨髓背景及临床背景下综合解读。

该方法相较于现有或替代方法的重要性

根据ELN 2025指南，无论采用何种检测技术或评估时机，微小残留病（MRD）均为急性髓系白血病（AML）患者的重要预后标志物。不同MRD流式细胞术技术与标志物的联合使用具有高度互补性。多模式MRD检测（包括LAIP/DfN和LSC分析）在标准化网络内进行并实现结果报告统一的前提下具有重要应用价值。MRD评估有助于更精确地定义治疗反应与复发状态。多中心、多模式的MRD流式检测结合分子学MRD检测，将在未来临床试验中发挥战略性作用，以应对日益复杂的治疗格局，其中包括新型靶向治疗、一线与二线治疗、异基因移植以及低强度治疗方案。

该方法在特定研究领域中的重要性及潜在应用

HOVON 和 ALFA 研究组报告指出，在急性髓系白血病（AML）诊断时对富集 CD34⁺CD38⁻ 白血病干细胞（LSC）的细胞群进行定量具有临床意义（补充文件 1）。根据定量方法确定具有临床意义的 LSC 阈值似乎至关重要。如先前采用本文所述方法所报道，LSC 阈值 ≥1% 与不良预后相关（补充文件 1）²⁶。在 AML 的管理中，整合微小残留病（MRD）、LSC 监测以及克隆性造血的差异化分析，可能有助于更精确地解读治疗反应。主要挑战在于区分需要追加治疗的 MRD 与可能无需干预的稳定型前白血病克隆²⁷。近期发布的 2025 年 EHA/ELN 指南推荐采用一种整合报告系统，用于计算 AML 随访过程中原始细胞百分比²⁸。该系统将 MRD 检测结果与形态学评估相结合，以实现对原始细胞的统一评估，并有助于在临床试验中进行一致的报告，从而明确 AML 患者的疗效分层。

HOVON 研究和 ALFA/FILO BIG1 研究均表明，将 LAIP/DfN 与 LSC 方法相结合的评分系统可将患者分为四组：LAIP⁻/LSC⁻、LAIP⁺/LSC⁻、LAIP⁻/LSC⁺ 和 LAIP⁺/LSC⁺，其3年总生存率各不相同^3,26,29。总体而言，这些结果说明了联合检测 MRD 的 LAIP/DfN 和 LSC 状态所具有的预后临床意义。在异基因造血干细胞移植背景下，即使原始细胞总数低于5%，CD34⁺CD38⁻ 富集的 LSC 细胞的存在也被报道为移植后失败的预测因子³⁰。这些临床数据支持联合应用 MRD 流式细胞术策略的合理性，但本方案的重点在于跨中心技术流程和报告方式的标准化。

从发展前景来看，光谱流式技术可扩展多维流式细胞术中同时检测的标志物组合，从而提高所监测的白血病相关免疫表型（LAIPs）的特异性，并降低造血再生带来的生物学背景噪声。正如本文所提出的，对不同平台、组合和中心之间光谱流式技术的可重复性进行评估，将对临床应用带来挑战。新的无监督分析算法，包括FlowSOM、t-SNE和UMAP，可能有助于区分正常造血与白血病细胞群，从CD34⁺CD38⁻的白血病干细胞（LSC）富集组分到原始细胞主体部分。更深入地捕获LSC组分，可能有助于改善在患者来源异种移植模型中植入情况的监测^31,32。欧洲白血病网（ELN）已成立工作组，以验证并统一这些新方法^33,34。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体（CANTO 8C-LYRIC12C）	荧光素	公司	目录编号
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5.5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
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CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
抗体（NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C）	荧光素	公司	目录编号
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
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CD97	PE	BD Pharmingen	555774
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CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
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CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II （8色，蓝/红/紫激光）		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 三激光 12色仪器		BD Bioscience	662383
BC NAVIOS Navios 10色，三激光，B5-R3-V2配置		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13色，13个检测器，三激光，  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza 软件 v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite 软件 v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva 软件 v 8.0.3（Win 7 32位操作系统）		BD  Bioscience	659523
BD CST 微球		BD  Bioscience	656505
多色COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero彩虹校准微粒（8个峰），3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab 补偿微球		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml 10倍浓缩液		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG（May-Grünwald-Giemsa）		Sigma Aldrich	1014242500