活体小鼠脑血管内皮细胞NAD+代谢的双光子实时成像

摘要

本方案通过内皮靶向生物传感器表达、颅窗制备和双光子成像技术，实现对活体小鼠脑血管内皮细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸代谢的实时监测。

摘要

我们提出了一种可重复的工作流程，用于在活体小鼠脑微血管内皮细胞中，通过颅窗双光子显微镜结合内皮靶向的荧光NAD⁺探针，实时可视化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）生物传感器通道的响应。该方案包括：（1）利用AAV-X1.1载体在Cdh5 启动子 （血管内皮钙黏蛋白）驱动下，通过腺相关病毒（AAV）介导在脑血管内皮组织中特异性表达NAD⁺传感器；（2）制备稳定的3 mm × 3 mm皮质颅窗；（3）双波长双光子成像，同步采集920 nm激发的绿色传感器通道信号和1040 nm激发的血管内四甲基罗丹明（TMR）–葡聚糖参考通道信号。TMR–葡聚糖通道提供血管管腔参考，支持血管选择、运动评估和血管完整性评价。作为一个应用示例，我们描述了通过饮水、灌胃或静脉注射给予烟酰胺单核苷酸后，内皮传感器通道荧光的变化。本方案强调了关键操作步骤、推荐的病毒剂量与滴度考量、故障排除方法以及定量分析策略，使实验室能够开展健康与疾病状态下神经代谢研究中脑血管NAD⁺生物传感器通道动态的体内监测。

引言

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是氧化还原平衡、线粒体活性、DNA修复和应激反应信号传导的核心辅因子。在脑血管系统中，内皮细胞中NAD⁺的稳态越来越被认为是一种主动调节血脑屏障完整性、血管张力和神经血管耦合的因素，而不仅仅是一种被动的代谢指标¹。内皮细胞NAD⁺代谢的紊乱已被证实与衰老相关的血脑屏障（BBB）渗漏以及神经血管稳态受损有关，这凸显了开发能够直接在活体脑组织中解析内皮细胞代谢动态方法的必要性²。

目前用于定量NAD的大多数方法⁺ 依赖终点生化检测、固定组织染色或 离体 传感器读数。尽管这些方法具有一定的信息价值，但它们无法保持完整的微血管结构，难以轻易区分动物体内随时间发生的快速变化，并且在应用于异质性脑组织时，细胞类型特异性有限。相比之下，慢性颅窗双光子成像技术能够在活体小鼠中以高空间和时间分辨率重复观察皮层微血管，因此非常适合在特定生理或药理干预条件下监测代谢响应性内皮信号^3,4,5.

本方案的总体目标是为实时监测脑血管内皮细胞NAD提供一套完整的操作流程⁺ 动力学 体内 该方法结合了系统性递送一种以血管内皮为靶向的、基于增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的NAD⁺ 由腺相关病毒（AAV）-X1.1包装并驱动的传感器 Cdh5 启动子，一种用于光学观测的稳定 3 mm × 3 mm 颅窗^6,7,8以及使用血管内四甲基罗丹明（TMR）-葡聚糖作为参考通道的双波长双光子成像¹传感器机制已明确如下：Cambronne 等人构建的 LigA-cpVenus 胞质 NAD⁺ 生物传感器是一种基于逆响应型cpVenus的传感器。NAD⁺ 结合会降低标准488 nm激发检测下的cpVenus/eGFP样荧光信号，而405 nm激发通道则作为比例归一化的参考。因此，原始绿色荧光不应被解释为NAD水平的直接正向指标⁺ 浓度。在此双光子实现方案中，采用920 nm激发以获取绿色传感器通道信号，而TMR–葡聚糖血管参考通道则使用1040 nm激发；因此，当前的920/1040 nm采集方式并不等同于经过校准的488/405 nm比率测量。选择Cambronne等人的生物传感器是因为该传感器已得到广泛验证，可用于监测细胞内NAD⁺ 动力学，且与当前的双波长成像配置兼容。尽管较新的指示剂（如 FiNad）为监测 NAD 提供了替代方法⁺ 动力学，其实施需要对当前用于TMR-葡聚糖血管参照标记的红色荧光通道进行修改。Cambronne传感器报告NAD的相对变化⁺ 在有限的动态范围内具有可用性，并已在细胞及亚细胞应用中得到验证；然而，信号解读可能受到表达水平、pH值、光漂白以及光路变异的影响，且NAD的绝对值⁺ 定量分析需要校准或正交的生化验证。选择 AAV-X1.1 是因为已有报道表明，具有内皮趋向性的 AAV 变体能够高效转导中枢神经系统血管系统。^6,7在我们对包括 AAV9、AAV-BR1、AAV-ENT 和 AAV-X1.1 在内的多种 AAV 血清型进行的初步比较中，以 CAG 或 Cdh5 驱动的增强型绿色荧光蛋白表达作为报告基因，AAV-X1.1 在所测试的血清型中表现出最理想的血管相关表达模式。随后采用 Cdh5 启动子进一步将转基因表达限制于血管内皮细胞，这与先前报道中显示的内皮细胞特异性转基因表达结果一致 体内⁶.

与离体（ex vivo）NAD⁺ 检测相比，该方法可保留完整的血管网络，实现对同一只动物进行纵向测量，并允许同时评估内皮细胞代谢信号与血管管腔参考。该工作流程特别适用于衰老、炎症应激、血脑屏障（BBB）功能障碍以及对烟酰胺单核苷酸（NMN）给药等代谢干预措施的快速反应研究^{9,10,11,12,13}。当实验问题需要在活体小鼠中重复观察皮层微血管以及内皮传感器通道信号的相对变化时，该方法最为适用。若无额外的比率校准或生化验证，该方法不适合用于NAD⁺的绝对定量。实际限制因素包括皮层的光学通透性、成像深度限制、对内皮细胞腺相关病毒（AAV）转导效率的依赖、可能由颅窗植入引起的炎症，以及对双波长双光子显微镜的需求。长期植入颅窗可能引发局部炎症、血管反应性改变、胶质增生、透明度下降或组织重塑，这些均可能影响内皮生理功能及传感器通道信号的测量结果^1,3,4。为尽量减少这些混杂因素，本方案要求无菌手术操作、间歇性钻孔并频繁冷却、仔细止血、避免粘合剂接触硬脑膜、术后镇痛、每日监测，并排除存在持续性浑浊、炎性碎屑、感染、血管形态不稳定或基线信号不稳定的动物。

方案

所有实验程序均经健康与康复科学大学动物伦理委员会批准，项目名称为“基于代谢探针观察血脑屏障完整性的机制研究”（批准编号：KFDX：NO. 2023-1023）。所有手术均须在无菌条件下进行，并根据批准的动物实验方案提供围手术期镇痛和支持性护理。在代表性操作流程中，术前或术后立即皮下注射盐酸布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg），之后根据需要每8–12小时给药一次，持续24–48小时。将小鼠置于加温笼中恢复，并持续监测，直至其恢复正常体位、自主活动及呼吸稳定。

1. 实验概述

1. 在代表性实验中使用 10–12 周龄、体重为 23–25 g 的成年 C57BL/6J 小鼠。
2. 将小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中，保持 12 小时光照/12 小时黑暗的循环，环境温度为 22°C–24°C，相对湿度为 40%–60%，并可自由获取食物和水。
3. 在实验操作前至少进行 7 天的适应性饲养。
4. 根据实验设计选择适当性别的小鼠。每项实验均需报告动物性别、数量及分组情况。本研究所示代表性成像数据使用了 N = 3 只小鼠。
5. 首先进行全身性 AAV 给药，并在成像前给予 3–4 周的表达期。
6. 在成像前 3–5 天进行颅窗手术。
7. 在成像当天对小鼠进行麻醉，静脉注射 TMR–葡聚糖，并在示踪剂充分循环后开始成像。
8. 根据选定的干预方案给予 NMN。可在成像前 5 天通过饮水补充，或在预定时间点通过口服灌胃给药，或在基线数据采集后于成像过程中静脉注射 NMN。
   注意：在 AAV 给药后，于 3–4 周表达期间暂停实验流程，并在此期间对动物进行常规健康监测和标准饲养管理。在颅窗手术后，于 3–5 天恢复期间暂停实验流程。在进入成像步骤前，需确认小鼠体重稳定、理毛行为和活动正常、无感染或过度炎症反应，且颅窗清晰透明。

2. 用于长期皮层成像的颅窗手术

1. 术前准备
   1. 在麻醉诱导前，对所有手术器械进行灭菌，并建立无菌操作区域。
   2. 设置恒温加热系统，将体温维持在 36.5°C–37.5°C，建议使用直肠探头反馈控制器。
   3. 准备呼吸监测设备，并在手术前确认其稳定运行。
   4. 在开始操作前，准备好无菌生理盐水、吸水棉片、止血材料、无菌 1.5 号玻璃盖玻片、金属头固定板和牙科水泥。
   5. 使用尺寸合适的无菌 1.5 号玻璃盖玻片，使其完全覆盖 3 mm × 3 mm 的颅窗，并与颅骨边缘齐平贴合。
   6. 准备装有 0.5–1.0 mm 钻头的高速微型钻机。
   7. 以大约最大速度的一半运行钻机，并确认在颅骨变薄过程中可立即应用无菌生理盐水冲洗。
   8. 钻孔期间使用棉签或滴管滴加室温无菌生理盐水，以冷却颅骨并清除骨屑。
2. 麻醉、头皮准备与颅骨暴露
   1. 通过腹腔注射新鲜配制的 Avertin 工作液（1.25%，12.5 mg/mL），剂量为 200–250 mg/kg，对小鼠进行麻醉。
      1. 根据机构标准操作程序，由 2,2,2-三溴乙醇和 2-甲基-2-丁醇配制 Avertin 工作液，避光保存，若出现沉淀或变色则弃用。
   2. 通过足底回缩反射消失和呼吸稳定来确认已达到稳定的手术麻醉深度。
   3. 麻醉诱导后立即在双眼涂抹眼膏。
   4. 若使用吸入麻醉，以 3%–4% 异氟烷进行麻醉诱导。
   5. 以 0.5–1.0 L/min 的流速在氧气中维持 1%–2% 异氟烷麻醉，并根据呼吸和反射情况调整浓度。
      警告：操作麻醉剂时应遵循机构安全规程，在给予吸入麻醉时使用适当的废气清除系统。
   6. 将小鼠固定在立体定位仪或定制头部固定装置上，以稳定暴露颅骨背侧。
   7. 如条件允许，使用反馈控制加热垫和直肠探头将体温维持在 36.5°C–37.5°C。
   8. 剃除头皮毛发，并清除手术区域的松散毛发。
   9. 使用聚维酮碘或碘伏溶液与 70% 乙醇交替消毒头皮，共进行三个循环。
   10. 避免消毒剂进入眼睛或颅骨开口处。
   11. 沿中线做头皮切口，并轻柔地牵拉皮肤。
   12. 充分暴露颅骨，以便进行颅窗制作和头固定板的安装。
   13. 使用精细镊子或手术刀片去除骨膜和残留结缔组织。
   14. 用无菌棉签轻轻擦干颅骨约 10–20 秒，直至表面呈哑光而非湿润状态。
   15. 避免过度脱水暴露的组织。
3. 标记 3 mm × 3 mm 的开颅区域
   1. 在手术显微镜下识别前囟（bregma）和后囟（lambda）。
   2. 利用这些解剖标志确定中线及目标皮层区域。
   3. 在一侧大脑半球的背侧体感皮层上方标记一个 3 mm × 3 mm 的正方形区域。
   4. 将前缘置于前囟后方约 0.5 mm 处，内侧边缘置于中线外侧约 1.0 mm 处。
   5. 应尽可能避开主要颅骨缝线和大型表浅血管。
4. 钻孔与骨瓣移除
   1. 沿标记的边界间歇性接触钻孔，避免持续施压。
   2. 钻孔过程中反复滴加无菌生理盐水，防止热损伤。
   3. 每次滴加约 20–50 µL 无菌生理盐水，或足量以保持颅骨表面湿润和冷却。
   4. 每 10–20 秒或当骨屑积聚或怀疑产热时，重复冲洗一次。
   5. 持续减薄颅骨，直至骨质均匀透明且略有弹性。
   6. 通过观察到脑膜血管清晰可见、脑膜搏动正常、无皮层受压或热损伤变色，确认减薄充分。
   7. 若出现明显产热、出血或脑膜搏动减弱，应立即停止钻孔。
   8. 冲洗区域并在继续操作前重新评估。
   9. 使用精细镊子或针尖从一角轻柔抬起骨瓣。
   10. 若仍有阻力，需重新对边缘进行减薄。
   11. 在移除骨瓣过程中保持硬脑膜完整。
   12. 使用无菌生理盐水冲洗清除骨屑。
   13. 通过轻柔的生理盐水冲洗和吸水棉片控制轻微出血。
   14. 若冲洗和棉片接触后 1–2 分钟内出血停止，则视为可接受。
   15. 若出血持续超过约 5 分钟，则应剔除该动物或终止操作。
   16. 若硬脑膜撕裂、出现皮层受压或血液遮挡成像区域，则应剔除该动物或终止操作。
       注：在完全止血后、放置盖玻片前，可暂时暂停操作。使用无菌生理盐水保持暴露的硬脑膜湿润，仅在确认无活动性出血后继续。
5. 窗口封闭与头固定板固定
   1. 确认暴露的硬脑膜清洁、湿润且无活动性出血。
   2. 将无菌盖玻片覆盖于开颅区域上。
   3. 将盖玻片置于围绕开颅区域的颅骨边缘上，避免压迫硬脑膜。
   4. 通过确认盖玻片表面齐平、无气泡残留、硬脑膜搏动正常以及光学通路清晰，验证其位置正确。
   5. 根据制造商说明配制牙科水泥或 Super-Bond C&B 型粘合剂。
      1. 以典型的 Super-Bond C&B 配制为例，在使用前立即于预冷至约 −20°C 的陶瓷皿中，将 1 份粉末与 1 滴催化剂和 4 滴单体混合。
   6. 仅在盖玻片周围颅骨外缘处涂抹粘合剂。
   7. 避免粘合剂接触硬脑膜，并防止其通过毛细作用渗入玻璃下方。
   8. 在室温下让粘合剂固化约 5–10 分钟。
      警告：牙科水泥和粘合剂成分可能含有挥发性或刺激性化学物质。应按照机构安全规程操作，并使用适当的通风设备。
   9. 将定制的钛合金头固定板置于颅窗周围。
   10. 使用带有约 10 mm 中央开口的头固定板，以适配成像用头部固定装置。
   11. 使颅窗居中位于头固定板的开口内。
   12. 仅在光学窗口以外、与颅骨接触的区域涂抹牙科水泥。
   13. 在移动动物前，让水泥完全固化约 5–10 分钟。
6. 术后恢复与窗口质量控制
   1. 根据批准的动物实验方案给予术后镇痛。
   2. 在典型操作流程中，皮下注射盐酸丁丙诺啡，剂量为 0.05–0.1 mg/kg，每 8–12 小时一次，持续 24–48 小时。
   3. 在加温的笼盒中恢复小鼠。
   4. 每日监测呼吸、姿势、活动、理毛行为和体重。
   5. 合格的颅窗应表现为：盖玻片透明、皮层血管清晰可见、硬脑膜完整、残留血液极少、盖玻片下无粘合剂、无感染迹象，且头固定板固定稳定。
   6. 剔除存在明显混浊、持续出血、炎性碎屑、感染、窗口移位、严重体重减轻（>15%）或理毛行为差、活动减少的动物。
   7. 术后恢复 3–5 天后进行成像。
   8. 成像前需确认动物活动正常、理毛行为正常、体重稳定、无疼痛或感染迹象，且颅窗透明、血管清晰可见。
      注：术后恢复期间可暂停操作流程。将小鼠维持在标准饲养条件下，每日监测体重和窗口透明度，仅在所有恢复标准均满足后恢复成像。

3. 腺相关病毒介导的内皮细胞 NAD⁺ 传感器表达

1. 病毒构建与制备
   1. 使用由内皮细胞 Cdh5 启动子驱动的基于 eGFP/cpVenus 的遗传编码 NAD⁺ 生物传感器。
   2. 使用 Cambronne 等人开发的 LigA-cpVenus 胞质 NAD⁺ 生物传感器序列（例如 Addgene 质粒 #186787 或经序列验证的等效插入片段）。
   3. 将 Cdh5 启动子克隆至 NAD⁺ 生物传感器编码序列的上游，使用 CV232 载体骨架。
   4. 将表达盒包装至 AAV-X1.1 衣壳中，作为定制病毒制备品。
      1. 记录每批 AAV 制备品的病毒生产供应商、纯化方法、病毒基因组定量方法、生产批次号及分析证书。
   5. 记录每批病毒制备品的质粒图谱、序列验证结果、病毒生产信息、纯化信息、病毒基因组滴度及分析证书。
      1. 记录研究中所用每批病毒制备品的构建图谱、序列验证报告、病毒生产批次号、定量聚合酶链式反应（qPCR）滴度报告、纯化文件及分析证书。
   6. 所有构建细节请参见材料表。
   7. 使用高滴度 AAV 制备品，其批次特异性 qPCR 滴度通常高于 2 × 10¹³ vg/mL。
   8. 将单次使用分装样品储存于 −80°C。
   9. 避免反复冻融循环。
   10. 使用前记录生产批次、qPCR 滴度、储存时长及可接受的批次间差异。
2. 系统性 AAV 给药
   1. 将病毒分装样品置于冰上解冻。
   2. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释病毒，使每只小鼠的最终注射体积为 100–200 µL。
   3. 在所有动物中维持每只小鼠 2 × 10¹² vg 的最终剂量。
      1. 根据批次特异性的病毒基因组滴度计算注射体积。对于 qPCR 滴度为 1.39 × 10¹³ vg/mL 的代表性制备品，每只小鼠注射约 144 µL，以递送 2 × 10¹² vg 的剂量。
   4. 使用无菌 29 G 胰岛素注射器通过眶后静脉窦注射递送病毒。
   5. 缓慢注射病毒悬液，持续约 10–20 秒。
   6. 通过确认无渗漏、无明显出血及无眼部损伤来验证递送成功。
   7. 若采用其他给药途径，需单独进行验证并报告。
   8. 观察小鼠直至其恢复正常体位和自主活动。
   9. 确认呼吸稳定，且无出血或痛苦表现。
   10. 仅在动物完全恢复后将其放回原饲养笼。
   11. 成像前给予 21–28 天的传感器表达时间。
   12. 在每组比较实验中保持一致的表达间隔。
   13. 对于超出 21–28 天范围的表达间隔，需单独进行验证。
       注：在 AAV 表达期间可暂停本方案。在此期间维持常规饲养管理和健康监测，仅在预定表达时间结束且动物健康状况良好时，再进行颅窗手术。
3.  内皮细胞特异性表达的验证
   1. 在正式数据采集前对动物进行筛选。
   2. 当绿色传感器通道信号可检测且沿血管网络分布时，接受该动物。
   3. 确认信号富集于与 TMR–葡聚糖阳性管腔相邻的血管壁区域。
   4. 确认无显著的弥散性实质荧光信号。
   5. 在所有实验组中应用相同的纳入标准。
   6. 当需要进行事后验证时，用 PBS 灌注小鼠，随后使用 4% 多聚甲醛固定。
   7. 取出脑组织，并制备 30–40 µm 的冠状或矢状切片。
   8. 使用内皮细胞标志物（如番茄凝集素、CD31 或血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin））对切片进行染色。
      1. 记录每次验证实验所用抗体的来源、目录号、批次号、宿主物种、稀释比例、孵育条件及检测方法。
   9. 根据需要评估烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）和聚（ADP-核糖）聚合酶 1（PARP1）的表达情况。
   10. 使用针对组织制备优化的一抗稀释比例。
   11. 在各组间使用相同的成像参数采集荧光或共聚焦图像。
   12. 将共定位量化为传感器阳性信号与血管标志物阳性区域重叠或紧邻该区域的部分所占比例。
   13. 当大部分可检测信号位于血管结构之外时，排除该动物。
   14. 当缺乏血管壁信号富集时，排除该动物。
   15. 当非靶向实质荧光干扰可靠感兴趣区域选择时，排除该动物。
   16. 当传感器通道荧光在基线采集期间出现饱和或不稳定时，排除该动物。

4. 双光子成像与定量分析

1. 成像日准备与血管内参照标记
   1. 通过腹腔注射新鲜配制的Avertin工作液（1.25%，12.5 mg/mL），剂量为200–250 mg/kg，对小鼠进行麻醉；或采用机构动物实验方案批准的麻醉方案。
   2. 通过足底回缩反射消失及呼吸稳定，确认已达到稳定的外科麻醉水平。
   3. 麻醉诱导后立即涂抹眼用软膏。
   4. 若使用吸入麻醉，以3%–4%异氟烷进行麻醉诱导。
   5. 以0.5–1.0 L/min的氧气流速，维持1%–2%异氟烷麻醉，并根据呼吸和反射情况调整剂量。
   6. 在无菌PBS 中配制70 kDa TMR–葡聚糖溶液，浓度为10–25 mg/mL。
   7. 避光保存TMR–葡聚糖溶液；如机构操作要求，需进行过滤处理。
   8. 以20 mg/kg剂量静脉注射TMR–葡聚糖。
   9. 根据储备液浓度调整注射体积。对于25 g小鼠，总染料用量约为0.5 mg。
   10. 每次使用前新鲜配制示踪剂，或按照制造商建议避光分装保存。
   11. 在开始图像采集前，让TMR–葡聚糖循环5–10分钟。
2. 显微镜配置
   1. 使用双波长双光子显微镜，配置920 nm激发波长用于基于eGFP的传感器通道。
   2. 使用1040 nm激发路径用于TMR–葡聚糖血管参照通道。
   3. 代表性成像在Nikon A1 MP/A1R MP+多光子显微镜上完成，由NIS-Elements AR/AR Analysis软件（版本5.42.06）控制。
   4. 记录每套成像系统的激光源、脉冲参数、光束组合配置、探测器类型和软件版本。
   5. 配置检测通道，以分离传感器通道信号与TMR–葡聚糖信号。
   6. 使用非扫描型光电倍增管（PMT）或砷化镓磷（GaAsP）探测器。
   7. 收集约500–550 nm范围内的绿色传感器通道发射光。
   8. 收集约570–650 nm范围内的TMR–葡聚糖发射光。
      1. 在代表性数据集中，使用525/50 nm发射滤光片收集绿色传感器通道发射光，使用575/25 nm或610/75 nm发射滤光片收集TMR–葡聚糖发射光。
   9. 尽量减少通道间的光谱串扰。
   10. 在每组比较实验中保持探测器增益和偏移设置恒定。
   11. 在条件允许时，使用单通道对照验证通道分离效果。
   12. 使用Nikon CFI75 Apochromat 25XC W 1300水浸物镜或等效物镜（25×，数值孔径1.10，工作距离2.0 mm）。
   13. 利用固定的血管标志（如分叉点和管腔边缘）确认通道共定位。
   14. 每次调整光路后均需重复验证共定位。
   15. 在成像前测量样品平面上的激光功率。
   16. 在每组比较实验中保持920 nm激光功率恒定。
   17. 在每组比较实验中保持1040 nm激光功率恒定。
   18. 典型工作范围约为920 nm下10–20 mW，1040 nm下8–18 mW。
   19. 根据成像深度和颅窗质量调整激光功率。
   20. 排除在120秒基线期内信号损失超过20%的视野。
   21. 排除出现明显光毒性变化的视野。
3. 采集设置
   1. 选择具有清晰光学窗口、微血管聚焦清晰且运动最小的视野。
   2. 接受满足以下条件的颅窗：透明盖玻片、可见皮层血管、硬脑膜完整、残余血液最少、盖玻片下无粘合剂、无感染、头固定板稳定固定。
   3. 排除存在明显混浊、持续出血、炎症碎片、感染、颅窗移位、严重体重减轻（>15%）或梳理行为/活动能力差的小鼠。
   4. 以512 × 512像素采集延时图像。
   5. 当需要更高空间细节时，以1024 × 1024像素采集代表性静态图像。
   6. 在每组比较实验中保持像素大小、放大倍数、扫描速度和视野范围恒定。
   7. 使用1–3 µm步长采集z轴堆栈图像。
   8. 在软脑膜表面下约200–250 µm深度成像皮层微血管。
   9. 当颅窗质量允许时，可将成像深度扩展至约400 µm。
   10. 对于配对比较，保持成像深度一致。
   11. 在急性干预前，以1秒间隔采集120秒基线数据。
   12. 继续采集预设的干预后时间段数据。
   13. 在注射后约10–30分钟内记录静脉注射NMN的响应。
   14. 在预设的实验终点采集饮水和灌胃数据集。
   15. 在所有比较组中保持相同的采集设置。
4. NMN干预（应用示例）
   1. 将NMN溶解于无菌饮用水中。
   2. 调整NMN浓度，使每日剂量约为100 mg/kg。
   3. 将饮水瓶避光保存。
   4. 每24–48小时更换一次含NMN的饮用水。
   5. 通过称量饮水瓶重量监测饮水量。
   6. 根据饮水量和体重计算估计的NMN摄入量。
   7. 成像前连续补充5天。
   8. 将NMN配制成1 mg/mL用于口服灌胃。
   9. 使用20G、38 mm圆头灌胃针，每只小鼠给予200 µL。
   10. 灌胃后30–60分钟进行成像。
   11. 将NMN配制成1 mg/mL用于静脉给药。
   12. 通过眶后静脉窦或尾静脉，每只小鼠注射100 µL。
   13. 在10–20秒内缓慢完成注射。
   14. 注射后立即或5分钟内开始成像。
   15. 补充5天后采集饮水数据集。
   16. 在固定的灌胃后时间点采集口服灌胃数据集。
   17. 静脉注射前立即采集基线数据。
   18. 在静脉注射后约10–30分钟内记录急性响应。
5. 图像处理与信号提取
   1. 当存在运动伪影时进行运动校正。
   2. 使用Fiji/ImageJ（版本1.8.0或更高）配合StackReg、TurboReg或等效的刚体配准算法。
   3. 利用TMR–葡聚糖通道中的血管标志指导配准。
   4. 仅当校正后残余位移小于约1–2像素时，才接受该数据集。
   5. 确认在整个采集过程中血管感兴趣区域（ROI）边界保持稳定。
   6. 使用TMR–葡聚糖通道分割血管管腔。
   7. 在管腔紧邻处定义内皮细胞ROI。
   8. 选择管腔标记稳定、运动最小且传感器通道信号可见的微血管。
   9. 分析直径约为5–80 µm的血管。
   10. 将内皮细胞ROI定义为与血管壁相关、宽度约2–5 µm的区域。
   11. 在条件允许时，每视野分析3–5条血管。
   12. 在条件允许时，每只小鼠分析1–3个视野。
   13. 在无示踪剂和传感器信号的组织区域定义背景ROI。
   14. 将背景ROI置于距分析血管和图像伪影至少20 µm以外的位置。
   15. 在归一化前，从各通道中减去平均背景强度。
   16. 对所有样本采用相同的背景扣除策略。
   17. 提取F_sensor(t)的时间序列平均强度值。
   18. 提取F_ref(t)的时间序列平均强度值。
   19. 使用NIS-Elements AR/AR Analysis或Fiji/ImageJ进行测量。
   20. 将原始图像文件导出为ND2格式。
   21. 尽可能将分析副本导出为16位TIFF堆栈。
   22. 将ROI时间序列数据导出为CSV文件。
   23. 在归一化前计算背景扣除后的荧光值。
   24. 使用ΔF/F₀ = (F(t) − F₀)/F₀计算ΔF/F₀。
   25. 将F₀定义为120秒基线期内的平均信号。
   26. 计算F_sensor(t)/F_ref(t)作为血管参照归一化值。
   27. 在采集时长允许的情况下，报告峰值变化、达峰时间、曲线下面积及恢复动力学参数。
   28. 不得将920 nm传感器通道信号解释为校准后的NAD⁺浓度。
   29. 当需要定量测量NAD⁺时，应进行额外的比率校准或生化验证。
6. 统计分析与报告
   1. 将小鼠定义为生物学实验单位。
   2. 在进行组间分析前，先对每只小鼠内的血管水平测量值取平均，或采用嵌套统计模型。
   3. 对于符合正态分布的组内比较，使用配对双尾t检验。
   4. 当不满足正态性假设时，使用Wilcoxon配对符号秩检验。
   5. 对于涉及两个以上相关条件的分析，使用重复测量方差分析或混合效应模型。
   6. 应用适当的多重比较校正方法。
   7. 使用GraphPad Prism或等效软件进行统计分析。
   8. 将统计学显著性定义为p < 0.05。
   9. 在每个图注中明确说明所使用的具体统计检验方法。
   10. 在可行的情况下，在ROI选择和定量前对图像文件进行编码。
   11. 保持分析人员盲法，直至完成ROI测量和质量控制决策。
   12. 在代表性数据集中，使用N = 3只小鼠作为生物学实验单位。
       注：在主动延时成像过程中不得暂停图像采集。原始数据导出后，可暂停图像处理和定量分析。将ND2文件、TIFF分析文件、ROI文件、元数据和CSV测量表格存储于有备份的归档系统中。记录每次成像会话的激光功率、探测器设置、成像深度、动物编号、处理分组及排除决策。

结果

成功的制备可获得透明且机械稳定的颅窗，适用于纵向成像。图1A总结了从麻醉和暴露颅骨，到开颅、盖玻片放置、头固定板安装以及术后恢复的操作流程。图1B展示了主要手术步骤的代表性序列照片。适用于成像的颅窗应具备清晰的光学通路、可见的皮层血管结构、完整的硬脑膜、极少的残留血液、盖玻片下无粘合剂，且盖玻片与颅骨边缘齐平。相反，不成功的制备表现为明显浑浊、滞留气泡、持续出血、炎症碎屑、感染、骨再生、颅窗移位或光学通路不良，在进行定量成像前应予以排除。对于颅窗持续不稳定、皮层血管可视化受损或其他影响图像质量特征的动物，不应纳入后续分析。

讨论

本方案提供了一种端到端的工作流程，用于监测脑血管内皮细胞中的NAD⁺ 代谢 在体成功的关键因素包括：（i）窗口的清晰度和稳定性，包括在钻孔过程中尽量减少热损伤并控制出血；（ii）通过合理选择腺相关病毒（AAV）衣壳、启动子、剂量和表达时间，实现内皮细胞特异性和足够的传感器表达；（iii）成像与分析参数的一致性，尤其是在进行纵向比较时。血管内TMR–葡聚糖通道提供了稳定的血管腔参考信号，有助于血管选择、漂移校正及归一化策略的实施。每次实验系列均应验证内皮细胞特异性，因为AAV衣壳的嗜性、启动子活性、剂量、注射途径及组织状态均可能影响转导效率和细胞靶向性。若条件允许，可使用AAV-X1.1-Cdh5-EGFP对照载体作为报告工具，在应用NAD之前评估内皮靶向性、血管限制性及脱靶表达情况。⁺ 生物传感器构建体。实质细胞或血管周围细胞中的脱靶表达可能会干扰感兴趣区域（ROI）的选择以及传感器通道荧光信号的解读；因此，必须通过血管标志物共定位验证，并采用预定义的排除标准。

成功的最关键因素是颅窗的清晰度和长期稳定性。钻孔过程中，应...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,2,2-三溴乙醇（Avertin）	Sigma-Aldrich	T48402	警告：有毒/有害化学品。用于配制颅窗手术的 Avertin 麻醉溶液。典型工作浓度：1.25%（12.5 mg/mL），腹腔注射，剂量为 200–250 mg/kg
2-甲基-2-丁醇	Sigma-Aldrich	152463	警告：有毒/有害化学品。用于配制高浓度Avertin储备液的溶剂。避光保存，若出现沉淀或变色应丢弃。
吸收性棉签	Winner Medical	无菌医用棉签	用于止血、颅骨干燥、冲洗及手术区域维护。
AAV-X1.1-Cdh5-细胞质NAD+ 生物传感器-SV40 pA	上海吉凯基因化学有限公司；质粒来源 Addgene	GeneChem 载体 GCPV5052075；Addgene #186787；Addgene #196836	靶向内皮细胞的NAD+ AAV-X1.1 包装的生物传感器。表达盒：Cdh5 启动子–细胞质中的NAD+ 生物传感器–SV40 多聚腺苷酸。代表性注射剂量：2 × 10¹² vg/小鼠。将分装样品储存在 −80 °C，避免反复冻融–冻融循环次数。记录批次特异性的qPCR滴度、批号、质粒图谱、序列验证结果和分析证书。
镇痛剂（盐酸丁丙诺啡）	MCE	HY-B0071	围手术期与术后镇痛。代表性剂量：0.05–0.1 mg/kg，每8小时皮下注射一次–12 小时，持续 24 小时–48 小时。
麻醉输送系统	RWD生命科学	R500 配 R580 蒸发器	用于成像过程中异氟烷的输送。典型氧气流速：0.5–1.0 L/min
麻醉剂（异氟烷）	RWD生命科学	R510-22 系列	用于成像麻醉。典型设置：3–4% 诱导和 1–2% 维持液
盖玻片	定制	无目录编号	无菌1.5号玻璃盖玻片，尺寸需完全覆盖3 × 3 mm 颅窗，与颅骨边缘齐平。
牙科粘固剂/粘接剂	Sun Medical	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	用于颅窗密封和钛合金头板固定。典型配比：1 勺粉末、1 滴催化剂和 4 滴单体。硬化时间约 5 分钟–室温下10分钟
牙科钻头	RWD生命科学	78001 微型钻机	用于颅骨磨薄和开颅的高速钻。使用时速度约为最大速度的一半，并需频繁用生理盐水冷却。
消毒剂溶液	Winner Medical	聚维酮碘/碘伏和70%乙醇	用于手术前头皮准备。交替使用消毒剂，重复三个循环。
精细镊子	JZ 品牌	JD1050/JD1070	用于骨膜剥离、组织操作和骨瓣抬起。
灌胃针	RWD生命科学	20G，38 mm，球形针尖	用于口服NMN给药。
头板	定制	无目录编号	与成像支架兼容的钛合金头板，中央约有10 mm的开口。
加热垫/恒温控制器	RWD生命科学	69020 配 69023 垫片	用于将体温维持在约36.5–37.5 °手术和成像期间的 C
图像采集软件	尼康	NIS-Elements AR/AR Analysis v5.42.06	用于显微镜控制和图像采集。代表性设置包括 512 × 512 或 1024 × 1024 像素，1–3 µm z步进，1秒时间间隔。
图像分析软件	美国国立卫生研究院	Fiji/ImageJ v1.8.0 或更高版本	用于运动校正、感兴趣区域选择、背景扣除、强度提取和 CSV 导出。
静脉注射用品	BD	329461	无菌1 mL胰岛素注射器（带29G针头），用于AAV、TMR–右旋糖酐和NMN注射。
NMN（烟酰胺单核苷酸）	Selleck Chemicals	S5259	NAD+ 用于饮用水、口服灌胃和静脉注射实验的前体物质。
眼用软膏	本地认证药房	不适用	用于防止麻醉期间角膜干燥。
磷酸盐缓冲液（PBS）	Servicebio	G4202-100ML 或 G4202-500ML	无菌 1× 用于病毒稀释、示踪剂制备、组织冲洗和试剂配制的 PBS。
呼吸监测系统	RWD生命科学	集成监测模块	用于在手术和成像过程中监测呼吸和麻醉深度。
生理盐水（0.9% NaCl，无菌）	Servicebio	G4702-500ML	用于颅骨冷却、灌注、组织保湿及溶液配制。
立体定位仪/头部固定器	定制	无目录编号	用于颅窗手术和成像过程中的稳定定位。
手术显微镜	Olympus	SZ61	用于颅窗手术中的颅骨磨薄、开颅及盖玻片放置。
TMR–葡聚糖（70 kDa）	赛默飞世尔科技 / 英潍捷基	D1818	用于血管参照标记的血管内荧光示踪剂。典型浓度：10–25 mg/mL。按 20 mg/kg 剂量注射，并给予 5–成像前循环10分钟。
番茄凝集素（DyLight 488）	Vector Laboratories	DL-1174	用于事后血管/内皮验证。
双光子显微镜	尼康	A1R MP+ 多光子显微镜	使用920 nm激发传感器通道和1040 nm激发TMR的双波长成像系统–葡聚糖参考通道。记录每次实验的激光功率、检测器设置、滤光片和采集元数据。
水浸物镜	尼康	CFI75 复消色差 25倍水镜 1300	25× 数值孔径1.10，工作距离2.0 mm，用于活体双光子成像的物镜