基于MCID策略与DNA标记的61个油茶（Camellia oleifera Abel）品种高效鉴定技术

摘要

本研究采用基于随机扩增多态性DNA（RAPD）条带模式构建的手工品种鉴定图谱（MCID），对61个油茶（Camellia oleifera Abel）品种进行高效且可重复的鉴定，以服务于种质资源利用及油茶品种的识别。

摘要

鉴定Camellia oleifera Abel［油茶（Ot）］种质材料和品种，对于评价种质资源以及评估保护油茶品种的机制至关重要。本研究通过延长RAPD引物长度并优化PCR退火温度，改进了RAPD技术，成功鉴定了来自不同地区的61个油茶品种。此外，采用MCID方法设计高效的RAPD标记用于品种鉴定。从80条随机的11-nt RAPD引物中，筛选出10条能产生清晰多态性条带（PBs）的引物，用于对61个品种进行PCR分析。进一步采用MCID策略，根据这10条引物所得DNA指纹图谱中的多态性条带，人工区分61个品种，构建了油茶品种鉴定图谱（Ot-CID）。该Ot-CID利用多态性条带对每个品种进行独立标识，并将合适的引物在图谱上准确定位。MCID策略为利用DNA标记进行植物鉴定提供了一种简便且实用的方法。此外，该方法也为品种鉴定提供了切实高效的手段。所建立的61个油茶品种的Ot-CID能够有效区分油茶变异类型，利用RAPD标记实现品种鉴别，从而为品种权保护及苗圃产业中的幼苗早期鉴定提供便利。

引言

山茶属 oleifera 油茶（Ot）是全球最重要的木本食用油树种之一¹中国被认为 Ot 起源与多样性中心 丰富的种质资源²古老的Ot传统、营养繁殖方式以及多样化的全球育种项目，已促成了众多栽培品种的出现³。该 全球广泛 Ot 培养物的培养已导致 具有同名异物（名称相同但品种不同）和同物异名（一个品种有多个名称）的品种 名称⁴因此，开发用于管理海量数据的技术至关重要 的Ot种质资源并准确区分各类 品种^3,5.

尽管基于DNA的分子标记已应用于品种表征、遗传学研究和Ot鉴定，能够阐明遗传多样性并区分植物个体，但尚未有研究 成功鉴定出大量Ot品种，或为品种区分提供可靠的依据^6,7,8,9。缺乏可靠的方法 是DNA标记在植物作物鉴定中应用的主要限制因素。这可能是因为用于DNA指纹分析的技术无法 产生明确指定引物和多态性标记的相关信息，以 区分需要 鉴定的品种  。用于分析DNA条带模式（称为聚类分析）的技术 不适合有效区分品种或物种。

尽管已利用SNP标记为200多个山茶花（Ot）品种开发了DNA分子身份证 ^2,3,10,11，但仍存在若干挑战：（1）Ot基因组结构复杂，大多数栽培山茶花为六倍体，而构建DNA分子身份证所用的参考基因组为三倍体，可能导致一定的不准确性³。（2）全基因组测序成本较高，尤其对设施有限的实验室而言，限制了其在大规模品种分析中的广泛应用。此外，PCR扩增产物需要测序或荧光检测，进一步增加了操作复杂性¹²。（3）对于缺乏特异性标记的新品种，需开发新的标记引物，同时还需要对已有类型的身份证编码进行重新编码，导致编码位点数量过多，降低品种区分的有效性。因此，亟需采用一种简便、可靠、可参照且实用的技术，为山茶花苗圃产业、农业商业、植物品种权保护以及遗传资源的保育与评估提供有效的品种鉴定手段⁵。

传统的品种鉴定策略依赖于形态学、生理学和农艺性状，但这些性状存在局限性，因其易受环境因素影响，且需要对完全发育的植株进行全面评估^13,14。相比之下，分子标记具有明显优势，因其不受环境变量影响，因而 可作为准确鉴定品种的高效工具^14,15。近年来，已建立多种基于DNA的指标，用于评估指纹图谱、遗传多样性、品种及纯度^{16,17,18,19,20,21,22}。RAPD标记因其操作简便、效率高，且无需预先掌握序列信息，在品种分析中具有优势^23,24。通过选用11个核苷酸（nt）的引物并结合特定的PCR退火温度，可进一步提升RAPD方法在植物指纹图谱分析中的应用效果，从而使RAPD成为植物品种鉴定和遗传多样性评估的优选方法^25,26。这些标记已广泛应用于多种植物物种的作物区分和遗传相关性研究，包括杏²⁷、观赏桃²⁸、石榴²⁹、地方品种²⁰和核桃³⁰（Çilesiz et al., 2025）。尽管应用广泛， 许多基于DNA标记的方法在常规植物品种鉴定中仍缺乏足够的实用性或流程化。

因此，本研究采用了一种新型分析技术，用于各种 Ot 品种的可重复鉴定。基于 RAPD 条带模式得出的 MCID 能够区分 61 种 Ot 品种，可用于种质资源利用和品种鉴定。

本文所述的RAPD-MCID策略（图1）最适合在具备标准PCR和凝胶电泳设备但测序设施有限的实验室中，进行小到中等规模的种质资源鉴定。该方法也适用于在开展更详细的遗传分析之前，进行快速、低成本的初步筛选。该方法的主要操作局限包括依赖于显性标记，以及需要严格标准化PCR条件以确保实验室间的可重复性。对于大规模种质库或品种法定登记，建议结合使用共显性标记（如SSR或SNP）。

方案

1. 植物材料

1. 从安徽省舒城县国家油茶种质资源库中，采集各油茶品种健康、旺盛生长枝条上的幼嫩叶片。
2. 这些品种的名称及来源请参见表1。

2. 基因组DNA提取

1. 根据试剂盒制造商的说明书，使用植物DNA提取试剂盒提取总基因组DNA。
2. 用1× TE缓冲液洗脱DNA。洗脱后，确认提取的DNA溶液呈澄清无色。使用微量分光光度计测定DNA浓度。
3. 用1× TE缓冲液将DNA浓度调整至30 ng·µL^-1，并将调整后的DNA溶液于-20 °C保存。

3. RAPD 引物选择

1. 为RAPD分析设计80个随机引物，并使用若干基因型对它们进行分析。选择在所有测试基因型中均能产生清晰且明确条带模式的11-nt RAPD引物。
2. 使用所选引物进行基因分型，以提高扩增片段的可信度。从中选出10个条带分辨率高且可重复的引物用于进一步分析，如表2所列。

4. 随机扩增多态性DNA（RAPD）PCR

1. 通过略微修改先前描述的方法²³来制备扩增反应。根据表S1中列出的组分配制反应溶液。
2. 使用PCR仪进行PCR扩增，反应条件如下：94 °C 预变性5 min；94 °C 变性30 s、退火（退火温度见表2中优化温度）1 min、72 °C 延伸2 min，共42个循环；最后72 °C 延伸10 min。

5. PCR 产物的检测与分析

1. 在含有0.001 M EDTA和0.04 M Tris-乙酸盐（pH 8.0）的1× TAE缓冲液中制备1.3%（w/v）琼脂糖凝胶，于100 V条件下通过凝胶电泳分离扩增的DNA片段。用浓度为0.5 µg·µL^-1的溴化乙锭染色。
   警告：溴化乙锭为强效诱变剂。操作溴化乙锭溶液或染色后的凝胶时，应佩戴适当个人防护装备。
2. 以恒定100 V电压电泳45–60分钟，或直至溴酚蓝染料前沿迁移至凝胶长度约三分之二处。染色并脱色后，在紫外透射光下观察凝胶。
   注意：确认在紫外透射光下可清晰观察到明确的DNA条带。确保DNA分子量标记物显示出锐利且分辨良好的条带，范围从100 bp至2,000 bp。
3. 根据紫外光下条带的有无，记录各品种的多态性条带（PBs）。
4. 每项PCR扩增实验均需设置三个重复，以确保结果可重复性。仅对在三次独立重复实验中一致出现或缺失的条带进行记录，用于后续分析。确认重复样本间条带判读的一致性比率超过95%。

6. 数据分析

1. 根据条带在所有品种中相应分子大小位置的有无，对用于品种鉴别的条带进行评分：将清晰可见的条带记为“+ o”，将缺失的条带记为“− ”。仅包含在三次独立重复实验中均一致观察到的条带。
2. 根据单个引物产生的指纹图谱中具有独特条带的品种进行独立分类；将具有相同条带模式的品种归为同一亚组。依据这些参数对所有油茶品种进行逐步且完整的区分。

7. 图解法在品种鉴定中的应用及效率

1. 从组内和组间随机选择两个油茶品种群，以验证展示61个油茶品种的Ot-CID图谱的适用性和功能性。通过人工参考Ot-CID图谱的不同分支进行选择，不使用任何软件。
   注：随机选取了2个油茶品种群，用于验证展示61个油茶品种的图谱的适用性和功能性。
2. 将选出的两个品种群分别标记为“A”和“B”。从Ot-CID中筛选出每个品种群对应的特异性引物。

8. 危险废物处理指南

1. 在指定区域配制和操作所有溴化乙锭溶液。根据机构危险废物处理指南，将所有被溴化乙锭污染的固体废物和液体废物分别收集并妥善处置。
2. 将所有被溴化乙锭污染的材料丢弃至指定的危险废物容器中。如对处理方法不确定，请联系机构的环境健康与安全部门以获取批准的处置程序。

结果

本文展示的代表性结果说明了 RAPD-MCID 策略的完整工作流程，从最初的引物筛选，到分层的品种区分，直至最终验证。逐步区分过程在 图 2、图 3、图 4、图 5、图 6 中进行了详细记录，这些图共同展示了仅用一组 10 个 RAPD 引物即可将 61 个油茶品种区分为独特身份的能力。图 2 和 图 3 展示了初始区分步骤及亚组解析结果。该技术的核心输出——Ot-CID 决策树（图 4）——作为一个可视化检索钥匙：从顶部的...

讨论

DNA标记是用于鉴定植物品种和物种的有力工具²⁴这些标记已在数千项遗传分析、品种鉴定研究中被开发和应用， 等等；然而，这些方法在基因分型中既不简便，也未被广泛使用^24,31这是由于缺乏高效且简便的利用DNA标记进行品种鉴定、系统发育树构建或指纹图谱分析的方法。尽管采用DNA标记开发分子身份证或DNA条形码可对多个品种的信息进行编码^3,17,32其复杂的编码、有限的检索效率、操作困难以及高昂的成本，使其不适用于广泛而便捷的品种鉴定¹²本研究建立了一种新颖、高效、实用且成本低廉的方法，利用DNA标记通过允许每个引物产生 distinct PBs 来系统区分各品种 样本 并以简洁且信息丰富的方式提供鉴定结果（<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心机	Eppendorf,Germany	5427R	用于油茶叶片基因组DNA提取
Hi-DNAsecure 植物基因组DNA提取试剂盒	Tiangen, China	DP350	用于油茶叶片基因组DNA提取
PCR基因扩增仪	Monad, China	MP60901	用于PCR扩增
SolarRed 琼脂糖LE	Solarbio, China	A8202	用于PCR片段电泳
TAE缓冲液	Tsingke, China	TSG001	用于PCR片段电泳
TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶	Takara, Japan	RR001A	用于PCR扩增
Thermo Scientific NanoDrop 2000C 分光光度计	ABI,USA		用于测定RNA浓度