基于MCID策略与DNA标记的61个油茶（Camellia oleifera Abel）品种高效鉴定技术

摘要

本研究采用基于随机扩增多态性DNA（RAPD）条带模式构建的手工品种鉴定图谱（MCID），对61个油茶（Camellia oleifera Abel）品种进行高效且可重复的鉴定，以服务于种质资源利用及油茶品种的识别。

摘要

鉴定Camellia oleifera Abel［油茶（Ot）］种质材料和品种，对于评价种质资源以及评估保护油茶品种的机制至关重要。本研究通过延长RAPD引物长度并优化PCR退火温度，改进了RAPD技术，成功鉴定了来自不同地区的61个油茶品种。此外，采用MCID方法设计高效的RAPD标记用于品种鉴定。从80条随机的11-nt RAPD引物中，筛选出10条能产生清晰多态性条带（PBs）的引物，用于对61个品种进行PCR分析。进一步采用MCID策略，根据这10条引物所得DNA指纹图谱中的多态性条带，人工区分61个品种，构建了油茶品种鉴定图谱（Ot-CID）。该Ot-CID利用多态性条带对每个品种进行独立标识，并将合适的引物在图谱上准确定位。MCID策略为利用DNA标记进行植物鉴定提供了一种简便且实用的方法。此外，该方法也为品种鉴定提供了切实高效的手段。所建立的61个油茶品种的Ot-CID能够有效区分油茶变异类型，利用RAPD标记实现品种鉴别，从而为品种权保护及苗圃产业中的幼苗早期鉴定提供便利。

引言

山茶属 oleifera 油茶（Ot）是全球最重要的木本食用油树种之一¹中国被认为 Ot 起源与多样性中心 丰富的种质资源²古老的Ot传统、营养繁殖方式以及多样化的全球育种项目，已促成了众多栽培品种的出现³。该 全球广泛 Ot 培养物的培养已导致 具有同名异物（名称相同但品种不同）和同物异名（一个品种有多个名称）的品种 名称⁴因此，开发用于管理海量数据的技术至关重要 的Ot种质资源并准确区分各类 品种^3,5.

尽管基于DNA的分子标记已应用于品种表征、遗传学研究和Ot鉴定，能够阐明遗传多样性并区分植物个体，但尚未有研究 成功鉴定出大量Ot品种，或为品种区分提供可靠的依据^6,7,8,9。缺乏可靠的方法 是DNA标记在植物作物鉴定中应用的主要限制因素。这可能是因为用于DNA指纹分析的技术无法 产生明确指定引物和多态性标记的相关信息，以 区分需要 鉴定的品种  。用于分析DNA条带模式（称为聚类分析）的技术 不适合有效区分品种或物种。

尽管已利用SNP标记为200多个山茶花（Ot）品种开发了DNA分子身份证 ^2,3,10,11，但仍存在若干挑战：（1）Ot基因组结构复杂，大多数栽培山茶花为六倍体，而构建DNA分子身份证所用的参考基因组为三倍体，可能导致一定的不准确性³。（2）全基因组测序成本较高，尤其对设施有限的实验室而言，限制了其在大规模品种分析中的广泛应用。此外，PCR扩增产物需要测序或荧光检测，进一步增加了操作复杂性¹²。（3）对于缺乏特异性标记的新品种，需开发新的标记引物，同时还需要对已有类型的身份证编码进行重新编码，导致编码位点数量过多，降低品种区分的有效性。因此，亟需采用一种简便、可靠、可参照且实用的技术，为山茶花苗圃产业、农业商业、植物品种权保护以及遗传资源的保育与评估提供有效的品种鉴定手段⁵。

传统的品种鉴定策略依赖于形态学、生理学和农艺性状，但这些性状存在局限性，因其易受环境因素影响，且需要对完全发育的植株进行全面评估^13,14。相比之下，分子标记具有明显优势，因其不受环境变量影响，因而 可作为准确鉴定品种的高效工具^14,15。近年来，已建立多种基于DNA的指标，用于评估指纹图谱、遗传多样性、品种及纯度^{16,17,18,19,20,21,22}。RAPD标记因其操作简便、效率高，且无需预先掌握序列信息，在品种分析中具有优势^23,24。通过选用11个核苷酸（nt）的引物并结合特定的PCR退火温度，可进一步提升RAPD方法在植物指纹图谱分析中的应用效果，从而使RAPD成为植物品种鉴定和遗传多样性评估的优选方法^25,26。这些标记已广泛应用于多种植物物种的作物区分和遗传相关性研究，包括杏²⁷、观赏桃²⁸、石榴²⁹、地方品种²⁰和核桃³⁰（Çilesiz et al., 2025）。尽管应用广泛， 许多基于DNA标记的方法在常规植物品种鉴定中仍缺乏足够的实用性或流程化。

因此，本研究采用了一种新型分析技术，用于各种 Ot 品种的可重复鉴定。基于 RAPD 条带模式得出的 MCID 能够区分 61 种 Ot 品种，可用于种质资源利用和品种鉴定。

本文所述的RAPD-MCID策略（图1）最适合在具备标准PCR和凝胶电泳设备但测序设施有限的实验室中，进行小到中等规模的种质资源鉴定。该方法也适用于在开展更详细的遗传分析之前，进行快速、低成本的初步筛选。该方法的主要操作局限包括依赖于显性标记，以及需要严格标准化PCR条件以确保实验室间的可重复性。对于大规模种质库或品种法定登记，建议结合使用共显性标记（如SSR或SNP）。

方案

1. 植物材料

1. 从安徽省舒城县国家油茶种质资源库中，采集各油茶品种健康、旺盛生长枝条上的幼嫩叶片。
2. 这些品种的名称及来源请参见表1。

2. 基因组DNA提取

1. 根据试剂盒制造商的说明书，使用植物DNA提取试剂盒提取总基因组DNA。
2. 用1× TE缓冲液洗脱DNA。洗脱后，确认提取的DNA溶液呈澄清无色。使用微量分光光度计测定DNA浓度。
3. 用1× TE缓冲液将DNA浓度调整至30 ng·µL^-1，并将调整后的DNA溶液于-20 °C保存。

3. RAPD 引物选择

1. 为RAPD分析设计80个随机引物，并使用若干基因型对它们进行分析。选择在所有测试基因型中均能产生清晰且明确条带模式的11-nt RAPD引物。
2. 使用所选引物进行基因分型，以提高扩增片段的可信度。从中选出10个条带分辨率高且可重复的引物用于进一步分析，如表2所列。

4. 随机扩增多态性DNA（RAPD）PCR

1. 通过略微修改先前描述的方法²³来制备扩增反应。根据表S1中列出的组分配制反应溶液。
2. 使用PCR仪进行PCR扩增，反应条件如下：94 °C 预变性5 min；94 °C 变性30 s、退火（退火温度见表2中优化温度）1 min、72 °C 延伸2 min，共42个循环；最后72 °C 延伸10 min。

5. PCR 产物的检测与分析

1. 在含有0.001 M EDTA和0.04 M Tris-乙酸盐（pH 8.0）的1× TAE缓冲液中制备1.3%（w/v）琼脂糖凝胶，于100 V条件下通过凝胶电泳分离扩增的DNA片段。用浓度为0.5 µg·µL^-1的溴化乙锭染色。
   警告：溴化乙锭为强效诱变剂。操作溴化乙锭溶液或染色后的凝胶时，应佩戴适当个人防护装备。
2. 以恒定100 V电压电泳45–60分钟，或直至溴酚蓝染料前沿迁移至凝胶长度约三分之二处。染色并脱色后，在紫外透射光下观察凝胶。
   注意：确认在紫外透射光下可清晰观察到明确的DNA条带。确保DNA分子量标记物显示出锐利且分辨良好的条带，范围从100 bp至2,000 bp。
3. 根据紫外光下条带的有无，记录各品种的多态性条带（PBs）。
4. 每项PCR扩增实验均需设置三个重复，以确保结果可重复性。仅对在三次独立重复实验中一致出现或缺失的条带进行记录，用于后续分析。确认重复样本间条带判读的一致性比率超过95%。

6. 数据分析

1. 根据条带在所有品种中相应分子大小位置的有无，对用于品种鉴别的条带进行评分：将清晰可见的条带记为“+ o”，将缺失的条带记为“− ”。仅包含在三次独立重复实验中均一致观察到的条带。
2. 根据单个引物产生的指纹图谱中具有独特条带的品种进行独立分类；将具有相同条带模式的品种归为同一亚组。依据这些参数对所有油茶品种进行逐步且完整的区分。

7. 图解法在品种鉴定中的应用及效率

1. 从组内和组间随机选择两个油茶品种群，以验证展示61个油茶品种的Ot-CID图谱的适用性和功能性。通过人工参考Ot-CID图谱的不同分支进行选择，不使用任何软件。
   注：随机选取了2个油茶品种群，用于验证展示61个油茶品种的图谱的适用性和功能性。
2. 将选出的两个品种群分别标记为“A”和“B”。从Ot-CID中筛选出每个品种群对应的特异性引物。

8. 危险废物处理指南

1. 在指定区域配制和操作所有溴化乙锭溶液。根据机构危险废物处理指南，将所有被溴化乙锭污染的固体废物和液体废物分别收集并妥善处置。
2. 将所有被溴化乙锭污染的材料丢弃至指定的危险废物容器中。如对处理方法不确定，请联系机构的环境健康与安全部门以获取批准的处置程序。

结果

本文展示的代表性结果说明了 RAPD-MCID 策略的完整工作流程，从最初的引物筛选，到分层的品种区分，直至最终验证。逐步区分过程在 图 2、图 3、图 4、图 5、图 6 中进行了详细记录，这些图共同展示了仅用一组 10 个 RAPD 引物即可将 61 个油茶品种区分为独特身份的能力。图 2 和 图 3 展示了初始区分步骤及亚组解析结果。该技术的核心输出——Ot-CID 决策树（图 4）——作为一个可视化检索钥匙：从顶部的分支点开始，用户根据特定多态性条带的存在（+）或缺失（−），沿相应分支向下移动，直至到达末端的品种名称。为分析未知样本，用户需使用当前分支点所指示的引物进行 PCR，判断目标条带是否存在，并继续使用下一个指定引物，直至完成鉴定。整个工作流程无需使用系统发育软件、遗传距离计算或测序，仅依赖连续的 PCR 和凝胶电泳。若在重复 PCR 反应中出现微弱、弥散、不一致或不可重复的条带，导致无法可靠判断其存在或缺失，则表明结果不理想。图 5 提供了独立验证，证明 Ot-CID 能够正确预测随机选择的品种对之间的区分引物和条带。

RAPD 方法优化
为了建立一种高效、在标准化实验室条件下可重复且具有前瞻性的 RAPD 体系，本研究采用了较长的引物（11 个核苷酸）。根据条带模式的质量和可重复性——这是影响 PCR 稳定性的主要因素——对每条引物的退火温度进行了优化。从 80 条 11-nt 引物中随机筛选出 10 条具有明显且可重复多态性条带（PBs）的引物，用于鉴定 Ot 品种。这些引物产生的指纹图谱稳定且具有多态性，PCR 产物大小范围为 200 至 3,000 bp（图 2 和图 3），证实了所获得的指纹图谱及 RAPD PCR 系统的可靠性。

品种鉴定
品种鉴定标准依据单个引物产生的指纹图谱中特有的条带对品种进行单独分类，而具有相似条带模式的品种则被归入同一亚组。因此，所有 Ot 品种均根据该标准使用 10 个引物进行了分类（表 2）。

在全部10对引物中，Y35是首个被筛选并用于区分全部61个品种的引物（PCR图谱详见图2）。选择900 bp的多态性条带（PBs）用于区分61个品种，并根据条带的有无将这些品种分为两个类群（图2）。第一类群包含29个Ot品种，其特征为存在900 bp条带，且可进一步根据引物Y40扩增出的600 bp和1,900 bp条带的有无分为三个亚群（图3A）（部分样品）。第二亚群中的‘黄山1’、‘黄山8’和‘甘8’品种表现为缺乏1,900 bp和600 bp条带，并可通过引物Y41扩增出1,100 bp的PBs加以鉴定（图3B）。此外，‘黄山8’和‘甘8’品种还可通过引物Y47扩增出200 bp的PBs进行鉴定（图3C）。使用引物Y41、Y42、Y47和Y48可将‘大别山5’和‘黄山2’分别归入第一和第三亚群。在第一类群中，29个Ot品种可被Y35引物准确鉴定。此外，不同条带、所用引物与鉴定出的品种之间存在显著相关性。该信息对于未来鉴定这29个品种至关重要。此外，使用Y35引物还鉴定出另一组品种；该组品种可通过其他引物进一步区分（图4）。通过联合使用10对不同的引物，可有效区分全部61个Ot品种。由于特定条带、所用引物与鉴定品种之间存在关联，扩增流程图有助于在Ot产业中高效、可重复且简便地鉴定这61个品种。该策略利用DNA标记的高效性，相较于以往报道的技术，能够更可靠、高效地进行植物鉴定。

品种鉴定与MCID效率的验证
本研究建立了一种用于品种分类的图谱，类似于聚类分析，并验证了该图谱在Ot品种鉴定中的可靠性与高效性。数据表明，该策略可有效利用DNA标记进行植物品种的鉴定。然而，仍需验证Ot-CID在适用性、可靠性和效率方面的表现。因此，随机选取了8个品种组合进行分析，包括‘黄山2号’与‘湘林67’、‘长林26’与‘长林28’、‘黄山7号’与‘攸县木林20’、‘黄山6号’与‘长林40’。这8个品种从Ot-CID的不同分支中随机选取，以确保测试涵盖多样化的鉴别路径，而非仅选择亲缘关系较近或易于区分的品种对。这种来自不同分支的随机选取在一定程度上缓解了验证过程中可能存在的偏倚问题。这些品种在Ot-CID中的位置表明，Y57、Y48和Y47引物对于区分这四组品种至关重要。此外，使用相应引物对这四组品种进行PCR分析，结果与预期相符图5）。“黄山2号”和“湘林67号”组以及“长林26号”和“长林28号”组分别通过Y57引物扩增出550 bp和400 bp的条带进行鉴定（图 5A- B）。此外，使用Y48引物可通过特异的900 bp条带区分‘黄山7’和‘Youchamin 20’组图5C），而‘黄山6号’和‘长林40号’组则通过Y47引物扩增出一条400 bp的条带得以区分（图 5D）。为便于快速查阅， uniquely 识别这 61 个品种的特异性引物–条带组合已总结于 表3该表格可作为查询依据，使用户仅需使用指定引物进行PCR扩增，并检测特异性多态性条带的有无，即可确认品种身份，而无需追溯完整的Ot-CID图谱。研究发现，利用三个特异性引物即可鉴定出四个品种类群，从而验证了Ot-CID在鉴定全部61个品种中的高效性。

使用未参与 Ot-CID 构建的品种进行独立验证
为进一步评估 MCID 流程的稳健性，对四个未包含在原始 61 个品种群体中的油茶品种进行了区分分析。这四个材料（nu1、nu2、un3 和 un4）随机命名，来源于同一种质资源库，但在本研究此前的任何步骤中均未使用。如图6所示，引物 Y41 在 nu1 中产生了一条清晰的 400 bp 条带，而在 nu2 中缺失；同时，nu2 中出现一条 1100 bp 条带，nu1 中则无此条带，从而为这两个品种提供了双条带区分特征。引物 Y54 产生一条 800 bp 的单一条带，可将 un3（有条带）与 un4（无条带）区分开来。综合来看，验证结果表明，所有被测试的品种对及独立品种均能通过 Ot-CID 预测的引物–条带组合成功区分。

图1：整个工作流程的示意图。用于鉴定61个油茶（Camellia oleifera Abel）品种的RAPD-MCID工作流程示意图。实验准备包括样品采集、DNA提取和RAPD条件优化。通过RAPD-PCR扩增、凝胶电泳和多态性条带（PB）评分生成DNA指纹图谱。将多态性条带的有（+）和无（−）转换为二进制数据，用于逐步区分品种并构建油茶品种鉴定图谱（Ot-CID）。所获得的Ot-CID随后通过组内/组间比较及独立品种样品进行验证。请点击此处查看该图的放大版本。

图2．引物Y35扩增的61个Ot品种的DNA条带模式。M：DL2000 plus DNA Ladder。泳道1–61对应表1中列出的Ot品种的登录编号。900 bp的多态性条带（箭头所示）被用作主要的区分标记，将全部61个品种分为两大类群。请点击此处查看该图的放大版本。

图3。使用引物Y40、Y41和Y47对第一组17个Ot品种进行分离得到的DNA条带模式。M：DL2000 plus DNA Ladder。M：DL2000 plus DNA Ladder。（A）引物Y40扩增了第一组的16个品种；1900 bp和600 bp多态性条带的有无（由大箭头指示）进一步将这些品种分为三个亚组。（B）引物Y41区分了第二个亚组；1100 bp条带（箭头）用于鉴定。（C）引物Y47利用200 bp特异性条带（箭头）区分了‘Huangshan 8’和‘Gan 8’。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4。利用10种引物鉴定出的Ot品种鉴定图（Ot-CID）。图中每条水平线上方标注的数字表示用于区分该线以下品种的多态性条带（PB）大小，单位为碱基对（bp）。(+) 表示存在多态性条带，而 (-) 表示缺失。加粗字体表示已被区分出的品种名称。请点击此处查看此图的放大版本。

图5．使用相应特异性引物验证两组随机选择的Ot品种配对。M：DL2000 plus DNA Ladder。（A）引物Y57通过550 bp的多态性条带区分‘湘林67’（10）和‘黄山2’（46）。（B）引物Y57通过400 bp的多态性条带区分‘长林26’（31）和‘长林28’（33）。（C）引物Y48通过900 bp的多态性条带区分‘黄山7’（15）和‘攸县香榧20’（43）。（D）引物Y47通过400 bp的多态性条带区分‘黄山6’（14）和‘长林40’（38）。请点击此处查看该图的放大版本。

图6．MCID策略在四个未参与Ot-CID构建的油茶品种上的验证。（A）引物Y41利用400 bp多态性条带（黄色箭头）和1100 bp多态性条带（白色箭头）区分了品种nu1和nu2。（B）使用引物Y54对品种un3和un4进行区分。800 bp条带（箭头）可将un3（条带存在）与un4（条带缺失）区分开来。请点击此处查看该图的放大版本。

编号	品种	产地	编号	品种	产地
1	Dabieshan 1	中国安徽	32	Changlin 27	中国浙江
2	Dabieshan 2	中国安徽	33	Changlin 28	中国湖南
3	Dabieshan 3	中国安徽	34	Changlin 29	中国湖南
4	Dabieshan 4	中国安徽	35	Changlin 30	中国湖南
5	Dabieshan 5	中国安徽	36	Changlin 32	中国湖南
6	Dabieshan 6	中国安徽	37	Changlin 39	未知
7	Dabieshan 7	中国安徽	38	Changlin 40	中国浙江
8	Dabieshan 8	中国安徽	39	Changlin 42	中国湖南
9	Huangshan 1	中国安徽	40	Changlin 43	中国湖南
10	Huangshan 2	中国安徽	41	Changlin 44	中国湖南
11	Huangshan 3	中国安徽	42	Changlin 53	中国浙江
12	Huangshan 4	中国安徽	43	Changlin 55	中国浙江
13	Huangshan 5	中国安徽	44	Xianglin 1	中国湖南
14	Huangshan 6	中国安徽	45	Xianglin 27	中国湖南
15	Huangshan 7	中国安徽	46	Xianglin 67	中国湖南
16	Huangshan 8	中国安徽	47	Xianglin 78	中国湖南
17	Huangshan 9	中国安徽	48	Xianglin 97	中国湖南
18	Huangshan 10	中国安徽	49	Xianglin 117	中国湖南
19	Changlin 1	中国江西	50	Xianglin 210	中国湖南
20	Changlin 2	中国江西	51	Youchamin 43	中国福建
21	Changlin 3	中国江西	52	Youchamin 20	中国福建
22	Changlin 4	中国江西	53	Youchamin 48	中国福建
23	Changlin 10	中国江西	54	Youchamin 60	中国福建
24	Changlin 11	中国江西	55	Gan 8	中国江西
25	Changlin 15	中国江西	56	Ganzhouyou 5	中国江西
26	Changlin 16	中国江西	57	Ganzhouyou 7	中国江西
27	Changlin 17	中国浙江	58	Zhelin 1	中国浙江
28	Changlin 18	中国浙江	59	Zhelin 2	中国浙江
29	Changlin 21	中国浙江	60	Zhelin 5	中国浙江
30	Changlin 22	中国浙江	61	Zhelin 6	中国浙江
31	Changlin 26	中国浙江

表1： 实验所用油茶品种的名称及来源。

引物	核苷酸序列 (5’–3’)	退火温度	GC%
Y-35	ATGACTTCTCG	45.2	45.5
Y-40	AGCGCTATCGT	45.5	54.6
Y-41	TGCCTCCTCAG	47.3	63.6
Y-42	CGCGCTATGCC	47.2	72.7
Y-47	ACGAGCGATAC	44.5	54.6
Y-48	ACCTGGCACAC	47.1	63.6
Y-52	CGATGGTGGTC	45.4	63.6
Y-53	GCGTGATGTCT	46.6	54.6
Y-54	CGCTGATGTTC	44.5	54.6
Y-57	TCGCTCAACTG	46.3	54.6

表2：用于61个油茶品种指纹图谱分析的十个RAPD引物。

编号	品种名称	特异性引物	多态性条带 (bp)	条带状态
1	Dabieshan 1	Y42	270/550	-/-
2	Dabieshan 2	Y54	900	+
3	Dabieshan 3	Y48	400/1400	+/-
4	Dabieshan 4	Y48	400/1400	+/+
5	Dabieshan 5	Y47	250	+
6	Dabieshan 6	Y47	750	+
7	Dabieshan 7	Y57	400/550/750	+/+/+
8	Dabieshan 8	Y41, Y42	1100, 270/550	-, -/-
9	Huangshan 1	Y41	1100	-
10	Huangshan 2	Y57	550	-
11	Huangshan 3	Y54	1500/1800	+/-
12	Huangshan 4	Y41, Y42	1100, 270/550	+, -/-
13	Huangshan 5	Y42, Y47	250/550, 250	+/+, -
14	Huangshan 6	Y47	400	+
15	Huangshan 7	Y48	900	-
16	Huangshan 8	Y47	200	-
17	Huangshan 9	Y48	400/1800	-/+
18	Huangshan 10	Y48	300	+
19	Changlin 1	Y53	300/1000	-/-
20	Changlin 2	Y42	270/550	-/-
21	Changlin 3	Y42	270/550	+/+
22	Changlin 4	Y52	1400/2600	+/+
23	Changlin 10	Y42, Y47	250/550, 250	+/+, -
24	Changlin 11	Y57	400/550/750	+/-/-
25	Changlin 15	Y48	400/1200	+/-
26	Changlin 16	Y52	1400/2600	-/-
27	Changlin 17	Y53	300/1000	-/+
28	Changlin 18	Y54	1000	+
29	Changlin 21	Y48	300	-
30	Changlin 22	Y47	250	+
31	Changlin 26	Y57	400	+
32	Changlin 27	Y48	400/1400	-/-
33	Changlin 28	Y57	400	-
34	Changlin 29	Y54	1500/1800	-/+
35	Changlin 30	Y57	400/550/750	+/+/-
36	Changlin 32	Y52	1300	-
37	Changlin 39	Y48	400/1800	-/-
38	Changlin 40	Y47	400	-
39	Changlin 42	Y48	700	+
40	Changlin 43	Y54	900	-
41	Changlin 44	Y42	270/550	+/-
42	Changlin 53	Y48	700	+
43	Changlin 55	Y48	900	+
44	Xianglin 1	Y54	1000	+
45	Xianglin 27	Y54	750	-
46	Xianglin 67	Y57	550	+
47	Xianglin 78	Y54	750	+
48	Xianglin 97	Y52	400/600	-/-
49	Xianglin 117	Y42, Y47	250/550, 250	+/-, -
50	Xianglin 210	Y52	400/600	+/-
51	Youchamin 43	Y57	400/550/750	-/-/+
52	Youchamin 20	Y53	300/1000	+/-
53	Youchamin 48	Y54	1000	-
54	Youchamin 60	Y54	1500/1800	-/-
55	Gan 8	Y47	200	+
56	Ganzhouyou 5	Y47	750	-
57	Ganzhouyou 7	Y42, Y47	250/550, 250	+/-, +
58	Zhelin 1	Y54	500	+
59	Zhelin 2	Y48	700	-
60	Zhelin 5	Y42	250/550	+/+
61	Zhelin 6	Y54	1000	-

表3：基于Ot-CID获得的油茶品种特异性引物-条带组合，用于61个油茶品种的鉴定。“+、−”分别表示条带的有和无。多个引物和条带之间以“/”分隔。

讨论

DNA标记是用于鉴定植物品种和物种的有力工具²⁴这些标记已在数千项遗传分析、品种鉴定研究中被开发和应用， 等等；然而，这些方法在基因分型中既不简便，也未被广泛使用^24,31这是由于缺乏高效且简便的利用DNA标记进行品种鉴定、系统发育树构建或指纹图谱分析的方法。尽管采用DNA标记开发分子身份证或DNA条形码可对多个品种的信息进行编码^3,17,32其复杂的编码、有限的检索效率、操作困难以及高昂的成本，使其不适用于广泛而便捷的品种鉴定¹²本研究建立了一种新颖、高效、实用且成本低廉的方法，利用DNA标记通过允许每个引物产生 distinct PBs 来系统区分各品种 样本 并以简洁且信息丰富的方式提供鉴定结果（图3）。该方法操作简便、易于参考，且具有其他优势。但此方法并不能完全反映作物植物之间的遗传关联；从理论上讲，最先被鉴定的品种 将表现出最显著的 与其他品种存在较大的遗传分化，而此后发现的品种可能表现出更近的遗传关系。该方法可显著促进植物品种的鉴定、品种权保护以及苗圃产业中的早期检测。

近期研究已应用SLAF-seq技术对25种主要物种的系统发育和群体基因组学进行了探究 油茶（Camellia oleifera） 品种并鉴定出用于DNA指纹分析的关键SNP标记³。然而， 油茶（Camellia oleifera） 基因组复杂^10,11,33,34，且品种鉴定存在技术难题和较高的标记开发成本，限制了其大规模应用。RAPD 可在无需目标生物先前基因组信息的情况下，对整个基因组 DNA 中的标记进行随机取样^31,35该方法操作简便，仅需少量DNA，且无需昂贵设备、放射性同位素、克隆、测序或杂交步骤^24,31这些因素表明，该技术相较于其他分子技术具有显著优势。在现有的多种DNA标记中，RAPD是最简单且成本最低的技术之一，大多数应用可在具备基本实验条件的实验室中开展。^31,36本研究采用10条RAPD引物对61份种质品种进行区分 通过 MCID策略。尽管单个RAPD引物无法同时区分所有种质品种，但该技术能有效利用DNA标记的优势 植物鉴定，表明相较于主要依赖先前技术的方法具有显著的效率提升 在聚类分析方面，严格控制DNA模板的质量以及精确调节引物退火温度，可有效克服与RAPD引物相关的稳定性和重复性局限。若实验中仍出现非特异性扩增，可通过提高退火温度1–2°C或降低引物浓度予以解决。此外，提高模板DNA的质量或调整Mg²⁺浓度有助于防止条带模糊或缺失。

本研究为油桐（Ot）品种的快速分化提供了新的证据。如图2所示，信息丰富的Ot-CID可用于指示区分特定Ot品种的引物。一个RAPD引物即可区分任意两个品种；若需鉴定更多品种，可从Ot-CID中确定相应的引物。要将新品种纳入现有的Ot-CID系统，用户首先使用10个引物进行PCR，并记录扩增条带模式。从系统发育树的顶端分支点开始，根据条带有无的模式引导该品种通过现有的决策树。若新品种最终进入一个已包含已知命名品种的末端分支，且无法通过现有的10个引物加以区分，则可测试额外的RAPD引物或其他分子标记，直至发现具有特异性区分能力的独特条带。该新的引物–条带组合可在适当位置扩展图谱，而无需对已有分支重新编码。在DNA条形码或分子鉴定系统中引入新标记通常需要对所有现有品种重新编码，使整个过程变得极为复杂且耗时费力。近年来，油茶（Camellia oleifera）全基因组测序的进展为开发基于序列的分子标记（如SNP和SSR）提供了宝贵资源，这些标记具有更优的可重复性和共显性遗传特性^11,33,34。然而，对于测序设施有限的实验室，或在需要快速、低成本的初步筛选方法时，本文所优化的RAPD-MCID方法仍是一种切实可行的替代方案。

10个选定的引物各自独立进行了三次重复PCR实验。在10个引物中，重复实验之间的条带评分一致性平均达到96.2%（范围为93%–100%）。用于鉴别的多态性条带（图1、图2和图4）在所有重复实验中均稳定可重复。Ot-CID效率与准确性的验证结果符合预期（图4、表3），证实了RAPD标记在植物鉴定中的实用性与可靠性。对未参与构建Ot-CID的油茶品种进行了测试（图6），结果验证了MCID策略的可靠性及其对新品种的适用性。当引入新品种时，可通过筛选现有引物来寻找具有区分能力的标记。本次验证使用了四组随机选择的品种对。 未来的工作应包括使用编码样本进行盲法验证，并量化鉴定成功率，以进一步评估该工作流程的稳健性。尽管结果已证实Ot-CID具有良好的区分能力，但未来研究若能采用盲法测试结合编码样本以及更大规模的验证样本集，将能进一步证实该方法的稳健性。本研究成功区分了61个品种，是迄今为止报道的利用RAPD标记实施MCID策略最大规模的应用。这一规模对于油茶苗圃产业中的种质资源实际管理具有重要意义。该方法操作简便， 增强了DNA标记在植物品种 实际鉴定中的适用性。此外，这一新颖的 方法可用于为多种物种和生物构建 CID，这些CID的功能类似于化学元素周期表，从而为特定品种的区分提供必要的信息。

以往的MCID研究主要集中在二倍体果树作物上^27,28,29。油茶（Camellia oleifera）主要是六倍体¹¹，其基因组结构复杂，给基于显性标记的品种鉴定带来了显著挑战。本研究首次证明了MCID策略在多倍体木本油料作物中的可行性与有效性，验证了该策略在不同倍性水平上的适用性。相较于传统的聚类分析，MCID策略在品种鉴定中具有多项实际优势。虽然系统发育树能够展示整体的遗传相似性，但无法指明区分特定品种所需的具体引物和条带。相比之下，Ot-CID作为一种决策树，能够在每一步鉴别过程中明确指定具体的引物、多态性条带大小以及存在/缺失的判别标准。这使得用户可以通过逐步进行的PCR流程来鉴定未知样本，而无需进行遗传距离计算或使用专业软件。此外，MCID具有良好的可扩展性——新增品种只需与现有分支进行比对，并在必要时补充新的引物即可；而更新系统发育树通常需要重新计算整个距离矩阵。这些特点使MCID方法特别适用于苗圃和种子检测实验室等应用场景，这些场合更重视快速、简便的品种鉴定，而非系统发育推断。尽管本研究展示了RAPD-MCID方法的诸多实用优势，但仍需承认其存在的一些固有局限性。首先，RAPD是一种显性标记系统，无法区分纯合位点与杂合位点，与SSR和SNP等共显性标记相比，可能导致部分遗传信息的丢失³⁶。这一局限性在油茶（Camellia oleifera）这类多倍体物种中尤为突出，因为在这些物种中，等位基因剂量信息对遗传研究具有重要价值。其次，MCID图谱仅用于品种区分，而不适用于系统发育推断；其分支结构反映的是基于多态性条带的鉴别效率，并不代表品种之间真实的进化关系或遗传亲缘关系。因此，Ot-CID不应被解释为系统发育树。第三，该方法依赖于凝胶电泳和人工判读，其通量低于基于荧光或测序的高通量基因分型平台。对于涉及数千份种质资源的大规模表征工作，将MCID与自动化片段分析或SNP芯片技术相结合可能更为合适。 然而，对于实验室条件中等的区域性育种项目和苗圃中的中小规模应用，RAPD-MCID方法提供了一种切实可行的解决方案。此外，当前实验方案是在单一型号的PCR仪上开发并验证的。未来计划开展多实验室测试，使用不同设备和操作人员，以全面评估该方法的稳健性。不同PCR仪平台和独立操作者之间的跨平台验证超出了本研究的范围。

结论：
总之，本研究区分了61种Ot菌株 通过 使用10对引物产生的多态性DNA指纹条带，从而构建了这61个品种的油茶栽培品种鉴定图谱（Ot-CID）。该Ot-CID展示了不同品种、其区分特征、所用多态性条带（PBs）及相应引物。MCID方法克服了分析工具不足的局限性，使基于DNA标记的植物鉴定更加高效、简便且具有实用性。该方法是一种简单有效的油茶栽培品种鉴定手段。这61个栽培品种的Ot-CID在区分山茶油品种方面表现出显著的可操作性和实用性。 通过 RAPD标记为 nursery 行业中的品种权保护和幼苗早期鉴定提供了重要支持。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心机	Eppendorf,Germany	5427R	用于油茶叶片基因组DNA提取
Hi-DNAsecure 植物基因组DNA提取试剂盒	Tiangen, China	DP350	用于油茶叶片基因组DNA提取
PCR基因扩增仪	Monad, China	MP60901	用于PCR扩增
SolarRed 琼脂糖LE	Solarbio, China	A8202	用于PCR片段电泳
TAE缓冲液	Tsingke, China	TSG001	用于PCR片段电泳
TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶	Takara, Japan	RR001A	用于PCR扩增
Thermo Scientific NanoDrop 2000C 分光光度计	ABI,USA		用于测定RNA浓度