利用间接磁珠法分离和鉴定表达podoplanin的间充质干细胞亚群

摘要

本方案描述了一种基于磁珠的分选方法，该方法使用藻红蛋白（PE）标记的流式细胞术抗体和抗PE微珠，以分离特定的间充质干细胞亚群。在测试条件下，该方法可获得高纯度的目标标志物阳性细胞，同时保持基于CCK-8的增殖/代谢活性，且无需昂贵的细胞分选仪或针对特定目标的定制磁珠。

摘要

间充质干细胞功能异质性的研究依赖于特定亚群（例如，podoplanin (PDPN) 阳性细胞）的高效分离。然而，对于大多数膜蛋白靶点，可直接用于分选的商用磁珠产品十分有限。为解决这一问题，本实验室建立并验证了一种基于"藻红蛋白（PE）标记的流式细胞术抗体/抗-PE 磁珠"间接偶联原理的标准化磁珠分选方案。以 PDPN 阳性细胞为模型目标群体，该方案可在不依赖昂贵流式细胞分选仪的情况下富集目标细胞组分。

研究人员可使用针对可及细胞表面蛋白的兼容性PE标记流式细胞术抗体，并将其与市售的抗PE微珠结合，通过针对特定目标的优化，建立所选目标的分选流程。该方法避免了为每个新目标定制或订购特异性磁珠所需的漫长周期和高成本，因此特别适用于稀有或研究较少的可及表面标志物。在本研究测试的PDPN模型系统中，该方案能够高效富集目标亚群，分选后PDPN阳性率高，并且与未分选的MSCs相比，基于CCK-8的增殖/代谢活性得以保持。

引言

在骨科领域，软骨损伤以及半月板无血管区（白色区域）的病变等损伤常常导致不可逆的关节破坏和功能丧失，最终发展为骨关节炎。这主要归因于这些组织再生能力较差，其原因在于缺乏直接的血液和淋巴供应，以及存在高度分化的细胞，这些细胞的增殖和迁移能力有限^1,2,3,4。为应对这一挑战，已探索了多种临床策略，包括使用外泌体^5,6、自体或同种异体软骨细胞移植^7,8，以及组织工程方法^9,10,11,12。近年来，间充质干细胞（MSCs）因其多向分化潜能和免疫调节特性，已成为再生修复中极具前景的细胞来源，为软骨再生带来了新的希望^13,14,15,16。

尽管间充质干细胞（MSCs）具有治疗潜力，但其表现出显著的异质性。即使在同一组织来源（如骨髓或脐带）中，不同的MSC亚群在增殖能力、多向分化潜能（尤其是软骨分化潜能）以及体内再生功能方面也可能存在较大差异^17,18,19。因此，精确识别和分离具有特定功能定义的MSC亚群——例如具有增强软骨分化能力的亚群——对于深入理解其生物学特性以及提高软骨修复的疗效至关重要。这构成了我们研究中的关键一步。

随着研究的不断进展，越来越多新发现的膜蛋白被鉴定为功能上不同的间充质干细胞（MSC）亚群的标志物。然而，将这些发现转化为有效的细胞分选策略在技术上仍具有挑战性。传统的荧光激活细胞分选（FACS）虽然功能强大，但需要专门的仪器设备和技术专长，限制了其在许多实验室中的可及性。另一方面，免疫磁珠细胞分选技术尽管应用更为广泛，却受限于商业化试剂的种类有限，现有试剂主要针对少数已被充分验证的膜蛋白靶点。因此，对于许多新近发现且可能具有重要生物学意义的标志物而言，目前尚无商业化的磁珠产品，难以实现对这些有价值的MSC亚群进行特异性富集。

为了克服这一局限性，本研究旨在建立并标准化一种灵活、经济高效且高效的阳性细胞筛选方案。该方法基于将 commercially available 的藻红蛋白（PE）标记抗体与抗-PE 免疫磁珠进行间接偶联。已有研究报道，与 PDPN⁻ 细胞相比，podoplanin 阳性（PDPN⁺）间充质干细胞（MSCs）具有更优的干性维持能力及分化潜能²⁰。此外，文献中已记录 PDPN⁺ MSCs 在软骨再生及骨关节炎（OA）进展中的作用^21,22。本研究以 podoplanin（PDPN）——一种近期被识别的功能性 MSC 亚群候选标志物——为模型靶点，从骨髓来源的 MSCs 中分选出 PDPN 阳性细胞。我们提供了一套详细的分步操作流程，涵盖单细胞悬液制备、抗体与磁珠标记以及磁性分选过程。此外，我们评估了分选后细胞的得率、PDPN 阳性率以及基于 CCK-8 的增殖能力/代谢活性。通过标准化该方案，我们旨在为研究人员提供一种通用且易于获取的方法，利用针对可及细胞表面标志物的兼容性抗体分离目标细胞亚群，从而推动干细胞基础研究及再生医学领域未来的转化应用。

方案

人骨髓来源的MSCs通过商业途径获得（参见材料表）。供应商通过以下指标确认MSC的身份：CD73、CD90和CD105呈阳性表达；CD34、CD45和HLA-DR呈阴性表达；并具有三系分化潜能。细胞在体外培养扩增，并在第3至第5代之间使用。所有涉及人源细胞的操作均在II级生物安全柜中无菌条件下进行。由于细胞为商业购买获得，且本实验方案未直接招募或采集人类受试者样本，因此无需直接提交机构审查委员会（IRB）审批。

1. 单细胞悬液的制备

注意：单细胞悬液的质量直接影响分选效率。确保细胞充分分散、活力高且无团块。若存在可见团块，应通过反复轻柔吹打使其分散，直至肉眼不可见。

1. 选择融合度达到 80–90% 的间充质干细胞（传代次数为第 3–5 代），弃去培养基。
2. 用 2 × 10 mL 预热的 PBS 洗涤细胞，轻轻摇动培养容器后弃去 PBS。
3. 加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 培养箱中孵育 3–5 分钟，在显微镜下观察细胞直至细胞变圆并开始脱落。
4. 加入 4 mL 含 16.5% FBS 的培养基（见材料表）以中和胰蛋白酶活性，轻轻吹打使细胞完全脱落，将细胞悬液转移至 15 mL 离心管。
   注意：在显微镜下检查，确认所有细胞均已收集。
5. 以 300 ×g 离心 3 分钟，弃去上清液。
6. 用 1 mL 缓冲液（见材料表）重悬细胞沉淀，进行细胞计数。

2. 细胞计数与浓度调整

注意：如果总细胞数少于 1 × 10⁷，仍需按照 1 × 10⁷ 个细胞的标准体积加入抗体和磁性试剂，以确保标记效率。

1. 将细胞悬液再次在300 × g 条件下离心3分钟，并弃去上清液。
2. 用缓冲液重悬细胞，使细胞密度达到1 × 10⁸ 个细胞/mL。
   注意：例如，若要处理1 × 10⁷ 个细胞，可将细胞沉淀重悬于100 µL缓冲液中。
3. 将细胞悬液转移至一个5 mL聚苯乙烯圆底管中。

3. 抗体标记

1. 每 1 × 10⁷ 个细胞加入 10 µL Fc gamma RII 阻断剂（参见材料表）。轻轻混匀，并在室温下孵育 10 分钟。
2. 每 1 × 10⁷ 个细胞加入 5 µL PE 标记的抗人 PDPN 抗体（参见材料表），具体用量应遵循制造商推荐的浓度。轻轻混匀，在避光条件下于室温孵育 15–20 分钟。
   注意：由于不同产品的抗体浓度可能存在差异，抗体用量应根据所用流式细胞术抗体说明书中的数据进行调整。

4. 磁珠标记

注意：使用前将所有试剂保持在冰上，并在每次取用后立即放回冰上，以维持其活性和一致性。

1. 每 1 × 10⁷ 个细胞加入 10 µL 选择性混合液（参见材料表）。轻轻混匀，并在室温下孵育 15 分钟。
2. 每 1 × 10⁷ 个细胞加入 5 µL 磁珠（参见材料表）。轻轻混匀，并在室温下孵育 10 分钟。
   注意：使用前需剧烈涡旋磁珠管 30 秒，以确保均匀分散。

5. 磁分离

1. 将含有标记细胞样品的5 mL聚苯乙烯圆底管放入磁性分离架中（参见材料表）。
2. 向管中加入缓冲液，使总体积达到2.5–3 mL。在室温下孵育5分钟。
3. 进行分离：将磁铁和试管作为一个整体握住，将其倒置，将上清液倒入一个新的收集管中。此收集的组分含有PDPN阴性细胞；将此管置于冰上保存。
   注意：此步骤中切勿将试管从磁性分离架上取下，否则会破坏分离过程，导致操作失败。
4. 重复步骤5.1–5.3三次。每次均向磁铁中的原试管加入缓冲液，静置5分钟，然后将上清液倒入步骤5.4中使用的同一阴性组分收集管中。
5. 最后一次洗涤后，将含有磁性结合细胞的试管从支架上取下。此试管中含有PDPN阳性细胞组分。
6. 加入3 mL缓冲液重悬阳性细胞。将此悬液转移至一个新的、已标记的试管中（阳性组分管）。

6. 靶细胞的收集、培养与鉴定

1. 分别对阳性与阴性组分管中的细胞进行计数，并记录每组分的细胞得率。
2. 将阳性组分的细胞悬液在 300 × g 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。
3. 用含 16.5% FBS 的 MEM Alpha 培养基重悬细胞沉淀，根据需要调整细胞密度，并将细胞接种至培养板或培养瓶中。
4. 将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育。

7. 纯度与功能验证的样品制备

1. 计数细胞，并将细胞以每皿 3 × 10⁶ 个细胞的密度接种至 100 mm 培养皿中，每皿加入 12 mL 培养基。接种后 24 小时观察细胞贴壁情况，更换新鲜培养基以去除残留的磁珠和未贴壁细胞。
2. 通过胰酶消化法收集细胞。轻柔吹打 10–15 次，以解离并去除磁珠及残留抗体。
3. 采用流式细胞术检测 PDPN-PE 阳性细胞的比例（详细步骤参见补充文件 1）。
4. 在对数生长期收集细胞，接种至 96 孔板中。在不同时间点（0 h、24 h、48 h、72 h）加入 CCK-8 试剂（见材料表），按照生产商说明书测定吸光度，并根据数据绘制增殖曲线。

结果

实验的整体原理和工作流程如图1所示。所有后续实验数据均基于第5代细胞。经过磁性分离后，获得的PDPN⁺细胞培养了24–48小时。更换培养基以去除未贴壁细胞和可能残留的磁珠后（图2A），我们评估了分选效率和细胞得率。起始细胞数量为 1 × 10⁷个MSCs，经过Fc受体阻断、抗体标记和磁性分离后，PDPN⁺组分的最终细胞数为3.5 ± 0.21 × 10⁶，PDPN^-组分的细胞数为6.4 ± 0.15 × 10⁶（图2B）。

磁性分选前，通过流式细胞术测定起始细胞群体中PDPN阳性细胞的频率为38.7%（补充文件1—补充图S1A）分选后，阳性组分中含有97.9%的PDPN-PE阳性细胞（

讨论

本研究建立了一种基于磁珠的方法，用于从骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）中分离PDPN+细胞。该方法能够在维持CCK-8检测条件下细胞增殖/代谢活性的同时，有效富集PDPN阳性亚群。

与传统的直接免疫磁珠分选方法相比，该策略最显著的优势在于其通用性。传统方法需要针对每一种新感兴趣的标记物开发或定制特异性的磁珠²³，这一过程既耗时又昂贵。相比之下，本方法利用实验室中常见的商品化PE标记抗体，使研究人员能够在完成靶标特异性优化后，建立针对特定表面靶标的分选流程。这种灵活性使得该方案不仅适用于PDPN，还可拓展至间充质干细胞的其他表面标志物（如CD146、CD90、CD105）²⁴，或用于其他细胞类型中亚群的分离。此外，与荧光激活细胞分选（FACS）相比，该方法对专用设备的需求极少，技术操作也更为简便，可在常规细胞培养实验室中轻松实施，对于缺乏先进仪器的研究环境尤其具有优势。

本方案最适合用于分离表达可及表面抗原的活细胞，且针对这些抗原已...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7-AAD 细胞活力检测试剂盒	KeyGEN	KGD1202-50
抗人 CD32 阻断剂（Fc gamma RII 阻断剂）	STEMCELL Technologies	18520
缓冲液	STEMCELL Technologies	20104	缓冲液
CCK-8	Meilunbio	MA0218-5
葡聚糖磁性颗粒	STEMCELL Technologies	50100	磁性颗粒
胎牛血清	Gibco	16050-122
磁铁	STEMCELL Technologies	18000	磁力分离架
MEM Alpha 培养基	Gibco	C12571500BT	MEM Alpha 培养基（82.5%）+ FBS（16.5%）+ 青霉素-链霉素（1.0%）
间充质干细胞（MSCs）	KeyGEN	KGG5575-1	人骨髓来源间充质干细胞
PE 标记抗人 PDPN 抗体	ABclonal	A26770	PDPN-PE
PE 选择性混合液	STEMCELL Technologies	18151	选择性混合液
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-072