利用间接磁珠法分离和鉴定表达podoplanin的间充质干细胞亚群

摘要

本方案描述了一种基于磁珠的分选方法，该方法使用藻红蛋白（PE）标记的流式细胞术抗体和抗PE微珠，以分离特定的间充质干细胞亚群。在测试条件下，该方法可获得高纯度的目标标志物阳性细胞，同时保持基于CCK-8的增殖/代谢活性，且无需昂贵的细胞分选仪或针对特定目标的定制磁珠。

摘要

间充质干细胞功能异质性的研究依赖于特定亚群（例如，podoplanin (PDPN) 阳性细胞）的高效分离。然而，对于大多数膜蛋白靶点，可直接用于分选的商用磁珠产品十分有限。为解决这一问题，本实验室建立并验证了一种基于"藻红蛋白（PE）标记的流式细胞术抗体/抗-PE 磁珠"间接偶联原理的标准化磁珠分选方案。以 PDPN 阳性细胞为模型目标群体，该方案可在不依赖昂贵流式细胞分选仪的情况下富集目标细胞组分。

研究人员可使用针对可及细胞表面蛋白的兼容性PE标记流式细胞术抗体，并将其与市售的抗PE微珠结合，通过针对特定目标的优化，建立所选目标的分选流程。该方法避免了为每个新目标定制或订购特异性磁珠所需的漫长周期和高成本，因此特别适用于稀有或研究较少的可及表面标志物。在本研究测试的PDPN模型系统中，该方案能够高效富集目标亚群，分选后PDPN阳性率高，并且与未分选的MSCs相比，基于CCK-8的增殖/代谢活性得以保持。

引言

在骨科领域，软骨损伤以及半月板无血管区（白色区域）的病变等损伤常常导致不可逆的关节破坏和功能丧失，最终发展为骨关节炎。这主要归因于这些组织再生能力较差，其原因在于缺乏直接的血液和淋巴供应，以及存在高度分化的细胞，这些细胞的增殖和迁移能力有限^1,2,3,4。为应对这一挑战，已探索了多种临床策略，包括使用外泌体^5,6、自体或同种异体软骨细胞移植^7,8，以及组织工程方法^9,10,11,12。近年来，间充质干细胞（MSCs）因其多向分化潜能和免疫调节特性，已成为再生修复中极具前景的细胞来源，为软骨再生带来了新的希望^13,

方案

人骨髓来源的MSCs通过商业途径获得（参见材料表）。供应商通过以下指标确认MSC的身份：CD73、CD90和CD105呈阳性表达；CD34、CD45和HLA-DR呈阴性表达；并具有三系分化潜能。细胞在体外培养扩增，并在第3至第5代之间使用。所有涉及人源细胞的操作均在II级生物安全柜中无菌条件下进行。由于细胞为商业购买获得，且本实验方案未直接招募或采集人类受试者样本，因此无需直接提交机构审查委员会（IRB）审批。

1. 单细胞悬液的制备

注意：单细胞悬液的质量直接影响分选效率。确保细胞充分分散、活力高且无团块。若存在可见团块，应通过反复轻柔吹打使其分散，直至肉眼不可见。

1. 选择融合度达到 80–90% 的间充质干细胞（传代次数为第 3–5 代），弃去培养基。
2. 用 2 × 10 mL 预热的 PBS 洗涤细胞，轻轻摇动培养容器后弃去 PBS。
3. 加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 培养箱中孵育 3–5 分钟，在显微镜下观察细胞直至细胞变圆并开始脱落。
4. 加入 4 mL 含 16.5% FBS 的培养基（见材料表）以中和胰蛋白酶活性，轻轻吹打使细胞完全脱落，将细胞悬液转移至 15 mL 离心管。
   注意：在显微....

结果

实验的整体原理和工作流程如图1所示。所有后续实验数据均基于第5代细胞。经过磁性分离后，获得的PDPN⁺细胞培养了24–48小时。更换培养基以去除未贴壁细胞和可能残留的磁珠后（图2A），我们评估了分选效率和细胞得率。起始细胞数量为 1 × 10⁷个MSCs，经过Fc受体阻断、抗体标记和磁性分离后，PDPN⁺组分的最终细胞数为3.5 ± 0.21 × 10⁶，PDPN^-组分的细胞数为6.4 ± 0.15 × 10⁶（图2B）。

磁性分选前，通过流式细胞术测定起始细胞群体中PDPN阳性细胞的频率为38.7%（补充文件1—补充图S1A）分选后，阳性组分中含有97.9%的PDPN-PE阳性细胞（

讨论

本研究建立了一种基于磁珠的方法，用于从骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）中分离PDPN+细胞。该方法能够在维持CCK-8检测条件下细胞增殖/代谢活性的同时，有效富集PDPN阳性亚群。

与传统的直接免疫磁珠分选方法相比，该策略最显著的优势在于其通用性。传统方法需要针对每一种新感兴趣的标记物开发或定制特异性的磁珠²³，这一过程既耗时又昂贵。相比之下，本方法利用实验室中常见的商品化PE标记抗体，使研究人员能够在完成靶标特异性优化后，建立针对特定表面靶标的分选流程。这种灵活性使得该方案不仅适用于PDPN，还可拓展至间充质干细胞的其他表面标志物（如CD146、CD90、CD105）²⁴，或用于其他细胞类型中亚群的分离。此外，与荧光激活细胞分选（FACS）相比，该方法对专用设备的需求极少，技术操作也更为简便，可在常规细胞培养实验室中轻松实施，对于缺乏先进仪器的研究环境尤其具有优势。

本方案最适合用于分离表达可及表面抗原的活细胞，且针对这些抗原已.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7-AAD 细胞活力检测试剂盒	KeyGEN	KGD1202-50
抗人 CD32 阻断剂（Fc gamma RII 阻断剂）	STEMCELL Technologies	18520
缓冲液	STEMCELL Technologies	20104	缓冲液
CCK-8	Meilunbio	MA0218-5
葡聚糖磁性颗粒	STEMCELL Technologies	50100	磁性颗粒
胎牛血清	Gibco	16050-122
磁铁	STEMCELL Technologies	18000	磁力分离架
MEM Alpha 培养基	Gibco	C12571500BT	MEM Alpha 培养基（82.5%）+ FBS（16.5%）+ 青霉素-链霉素（1.0%）
间充质干细胞（MSCs）	KeyGEN	KGG5575-1	人骨髓来源间充质干细胞
PE 标记抗人 PDPN 抗体	ABclonal	A26770	PDPN-PE
PE 选择性混合液	STEMCELL Technologies	18151	选择性混合液
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-072