利用活细胞成像和流式细胞术定量分析嵌合抗原受体与治疗性抗体增强的自然杀伤细胞毒性

摘要

本方案提供了一种标准化的 体外 使用活细胞成像和流式细胞术对人体自然杀伤细胞的天然、嵌合抗原受体介导及抗体依赖性细胞毒性的稳定检测流程

摘要

自然杀伤细胞（NK细胞）是一类先天性淋巴细胞，在抵御多种胞内病原体和癌症的保护性免疫中发挥关键作用。其主要功能是杀伤被感染、恶性转化或被抗体包被的靶细胞，后者通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）实现。NK细胞还可通过基因工程改造，表达嵌合抗原受体（CARs），从而实现对特定抗原的靶向识别。定量检测NK细胞的细胞毒活性对于评估其基础功能以及单克隆抗体和CAR工程策略的临床前评价至关重要。然而，由于在细胞制备、靶细胞类型、效应细胞与靶细胞比例、共孵育时间及检测方法等方面的差异，体外 功能检测在不同实验室之间仍存在高度变异性，限制了实验的可重复性及跨研究间的比较。本文介绍了一种利用流式细胞术和实时活细胞成像技术对NK细胞细胞毒活性进行定量评估的标准化方案。采用96孔板体系，评估人原代NK细胞及表达CAR的NK-92细胞杀伤癌细胞和抗体包被靶细胞的能力，以检测天然细胞毒作用、CAR介导的杀伤作用以及ADCC效应。靶细胞存活率可通过活细胞成像进行连续监测，或在特定时间点通过流式细胞术测定，后者还可同时实现对NK细胞和靶细胞的表型分析。这些方案结合常规的组织培养、成像和流式细胞术方法，为先天免疫及基于NK细胞的免疫治疗研究提供了可重复 量化NK细胞效应功能的可靠框架。

引言

自然杀伤细胞（NK细胞）是一类先天性淋巴细胞，在针对病毒感染细胞和恶性细胞的免疫监视中发挥核心作用，具有快速而强大的细胞毒性¹。与B细胞和T细胞不同，NK细胞不表达抗原特异性受体，而是依赖一系列活化性和抑制性受体来识别主要组织相容性复合体I类分子（MHC I）表达的缺失或细胞应激状态。这使得NK细胞能够通过释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒，或在某些情况下通过激活死亡受体，介导直接细胞毒性作用^1,2,3,4。除了天然细胞毒性外，NK细胞还表达FcγRIII（CD16），该受体可识别免疫球蛋白G（IgG）的Fc段，并介导针对IgG包被靶细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）^5,6。

由于自然杀伤细胞（NK细胞）具有内在的细胞毒性机制和良好的安全性，其已成为细胞免疫治疗的有力候选者。NK细胞具有异体使用的潜力，可作为一种“即用型”疗法，引发移植物抗宿主病的风险极低，从而提高了临床应用的广泛性并降低了治疗成本⁷。近年来，通过基因工程策略进一步拓展了NK细胞的治疗潜力，包括引入嵌合抗原受体（CARs），以引导NK细胞识别特定的肿瘤抗原。CAR-NK细胞在体内 异种移植模型和临床试验中均表现出抗肿瘤疗效，且相较于CAR-T细胞具有更低的毒性^8,9,10。因此，开发工程化NK细胞平台以及基于抗体的治疗策略正受到越来越多的关注。在此背景下，对NK细胞杀伤能力进行准确且定量的测定，对于理解NK细胞生物学特性、评估CAR或其他工程化NK细胞疗法的疗效，以及评价依赖抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的单克隆抗体至关重要。

多种体外 实验方法已被实验室广泛用于评估自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞毒性。常用方法包括放射性铬-51释放实验、乳酸脱氢酶释放实验以及钙黄绿素-乙酰氧基甲基释放实验^11,12。尽管这些传统方法已被广泛用于细胞毒性检测，但它们依赖于细胞死亡的间接读数，仅提供终点测量而非动力学数据，且灵敏度和动态范围有限。此外，这些方法无法提供效应细胞表型或活化状态的信息。近年来，活细胞成像平台和流式细胞术的应用日益增多，因其能够直接量化靶细胞存活情况、实时监测杀伤过程，并同时对效应细胞和靶细胞进行表型分析^13,14。然而，即使在这些较新的方法中，不同实验室和已发表研究之间仍存在显著差异，包括靶细胞制备方式、效应细胞与靶细胞比例（E:T）、共孵育时间等方面的不一致，限制了实验的可重复性以及研究间的比较，尤其是在基于NK细胞的免疫疗法临床前评估中。

本文介绍了一种利用两个独立且互补的技术平台对自然杀伤细胞（NK细胞）杀伤活性进行定量评估的标准化操作流程：实时活细胞成像（IncuCyte SX5）和基于流式细胞术的终点检测。活细胞成像技术能够在效应细胞与靶细胞共培养过程中连续监测靶细胞的存活情况，从而在多种效靶比和实验条件下，以最少的实验干预实现对细胞毒性的动力学评估¹⁵。相比之下，流式细胞术可对靶细胞死亡提供高灵敏度的终点检测，同时利用多标记染色 panel 对NK细胞和靶细胞进行同步表型分析。

此外，本方案采用了标准化的实验参数，包括效靶细胞比（E:T比）、孵育条件、培养板规格和分析流程，以提高实验的可重复性，并促进不同实验室和研究之间细胞毒性检测结果的比较。该流程可定量评估多种自然杀伤（NK）细胞效应功能，包括天然细胞毒性、CAR介导的杀伤作用以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），并适用于原代人NK细胞及NK细胞系。本方案为NK细胞生物学研究以及基于NK细胞的免疫治疗在临床前阶段的开发提供了实用的研究框架。

方案

使用人类供体样本进行研究已获得机构审查委员会的批准，并按照机构指南进行（批准号：2022P000699）。

1. 实时活细胞成像杀伤实验

1. 包被板
   1. 加入50 µ每孔加入聚-D-赖氨酸（0.1 mg/mL，溶于磷酸盐缓冲液 [PBS]）至6孔板 × 在平底96孔板中每孔加入10个网格。轻轻振荡培养板，确保每个孔的底部完全覆盖。
   2. 在室温（RT；18℃）下孵育平板2小时°C–26°C）盖上盖子。
   3. 洗涤孔 3 次× 200 µ每孔 PBS 体积（L） 弃去上清液。
      注意：包被好的培养板可用封口膜密封后于4℃保存°C，最多可保存1周，浓度为200 µ每孔加入 PBS L。确保培养板保持无菌，弃去 PBS，于使用前平衡至室温。
2. 准备靶细胞
   1. 制备10 mL的2× SYTOX Orange（200 nM），通过将SYTOX Orange储存液（250）稀释获得 µM 在 DMSO 中）加入 NK-92 培养基中（添加 8 µ将L储备液加至总体积10 mL，置于15 mL锥底离心管中。
      注意：NK-92 细胞的培养基由 Advanced RPMI-1640 培养基、10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、100 µg/mL 原霉素，以及 500 U/mL 人 IL-2。
      注意：SYTOX Orange 为荧光染料，接触皮肤或眼睛可能造成危害。操作时应佩戴适当的个人防护装备，并遵循所在机构的安全指南。
   2. 使用染料排斥法细胞计数方法（如台盼蓝染色法）或经过验证的等效方法（如自动细胞计数仪）对目标细胞进行计数。
      注意：本实验中使用的靶细胞为Ramos细胞，一种表达B细胞成熟抗原（BCMA）的细胞⁺一种B细胞淋巴瘤细胞系，我们对其进行了基因改造，使其表达近红外（NIR）荧光蛋白emiRFP670。
   3. 将所需量转移至15 mL锥底离心管中。
   4. 离心（5 分钟，300 ×g） × g，室温，加速度 = 最大；减速度［制动］ = 最大。
   5. 弃去上清液。
   6. 将靶细胞重悬至终浓度为 2.5 × 10⁵ 细胞/毫升（2.5 × 10⁴ 细胞/100 µ2 L 中× SYTOX Orange 培养基
      注意：重悬的目标细胞可在37℃下维持°C，5% CO₂₂ 在配制效应细胞稀释液时，可将试管中的样本静置最多30分钟。
      注意：一个完整的培养板共60孔 × 2.5 × 10⁴ 每孔细胞数 = 1.5 × 10⁶ 总靶细胞数。准备 2.0 × 10⁶ 根据细胞损耗调整细胞数量。根据检测规模和所需的接种密度调整细胞数目。
3. 制备效应细胞
   1. 使用染料排斥法细胞计数方法（如台盼蓝染色法）或经验证的等效方法检测NK-92细胞的浓度和活力。仅当细胞活力≥80%时方可进行后续操作，因活力较低可能影响实验性能。
      注意：使用经基因工程改造后稳定表达荧光蛋白ZsGreen的NK-92细胞作为效应细胞，这些细胞单独表达ZsGreen（对照）或同时表达靶向BCMA的CAR结构。
   2. 将所需数量的细胞计数后转移至若干个15 mL圆锥形离心管中。
      注意： 通过将每个效靶比（E:T）所需细胞数相加，乘以重复次数，再增加50%的余量以补偿细胞损耗，计算出所需效应细胞的总数。根据需要对数值进行取整以方便制备。例如，当E:T比值范围为2:1至0.25:1时，使用1.5 × 10⁵ 每份重复所需的NK细胞数。对于三份重复，准备4.5 × 10⁵ 每种条件下细胞数量根据所述的孔板布局确定 补充图1A.
   3. 离心细胞（5 分钟，300 ×g） × g，室温，加速度 = 最大；减速度［制动］ = 最大。
   4. 弃去上清液。
   5. 重悬细胞，使其最终浓度为 5.0 × 10⁵ 细胞/毫升（5.0 × 10⁴ 细胞/100 µL)
4. 制备效应细胞稀释液
   1. 在圆底96孔板中配制效应细胞稀释液，包括仅含靶细胞的对照组（参见 补充图 1A 以一个包含四种条件、每种条件设三个重复的代表性孔板布局为例）。每种条件均设置三个重复。
   2. 加入 240 µ每孔效应细胞数（5.0 × 10⁵ 细胞/mL）加入至对应孔中，使效靶比（E:T）为2:1。
   3. 加入120 µ每孔加入培养基 L。
   4. 从效靶比（E:T）2:1 孔开始，进行2倍系列稀释至 E:T = 0.25:1 孔。使用移液器吹打混匀至少5次，每次转移后更换吸头。
      注意：如果成像系统尚未安排成像运行，请在建立共培养之前完成预约。制备好的效应细胞稀释液可在37℃保存°C，5% CO₂₂ 在设置活细胞成像系统期间，将样品置于圆底96孔板中孵育，时间最长可达30分钟。
5. 建立共培养体系
   1. 获取经多聚-D-赖氨酸包被的平底96孔板。
   2. 加入100 µ每孔加入适量的目标细胞悬液至所有孔中。加样前，使用合适的移液器（例如 200）上下吹打至少 5 次，充分重悬目标细胞。 µL）并避免转移过程中产生气泡。
   3. 加入100 µ每孔加入效应细胞悬液 L。加样前，使用合适的移液器（例如 200）上下吹打至少 5 次，充分重悬效应细胞。 µL）并避免转移过程中产生气泡。
   4. 加入200 µ每孔加入 PBS 至周围未使用的孔中。
   5. 离心平板（2 分钟，100 ×g） × g，室温，加速度 = 低 [例如，2]；减速度 [刹车] = 低 [例如，2]。
      注意： 这种轻柔离心对于在IncuCyte SX5上进行准确成像至关重要，可使细胞快速且均匀地沉降至孔板底部。我们使用配备水平转子的台式Eppendorf离心机5810R，加速度和减速度设置均为2（共9级）。
   6. 将培养板放入活细胞成像系统中，每1小时采集一次图像，持续24小时（可根据需要延长至72小时）。确保成像在标准培养条件下进行（37°C/5% CO₂₂).
      注意：为确保成像时 t = 0 h 应准确反映靶细胞的基线计数，在共培养体系建立并离心后 10–15 分钟内开始图像采集。对于一个包含三个成像通道（即绿色、橙色和近红外）的全板，每孔采集 3 幅图像、20 倍镜下，每小时扫描时间约为 10 分钟× 放大倍数
   7. 首次扫描后验证图像质量，必要时调整设置。
6. 仪器设置
   1. 设置光谱分离以校正SYTOX Orange在绿色通道中的荧光溢出。通过比较绿色和橙色通道，并确认橙色⁺ 死细胞不会被错误地检测为绿色⁺。在代表性实验中（图1），橙色通道对绿色通道的贡献被设定为8.5%。这些数值具有数据集特异性，应针对每个实验进行优化。
   2. 配置非贴壁细胞的逐细胞分析，以确保准确分割和遮蔽每个视野中的所有细胞（参见 补充图1B 用于代表性设置）。建议在使用悬浮效应细胞和靶细胞系模型的活细胞成像系统中采用以下参数：
      1. 将预期物体直径设置为15 µ微米（细胞直径的近似值）。
      2. 将阈值灵敏度和纹理灵敏度均设为5。
      3. 将边缘敏感度设为10，以促进细胞簇的分离。
      4. 将接受的对象面积滤波范围设置为 50–2000 µm² 以排除碎屑和大型物体。
      5. 将偏心率最大值设为0.95，以排除非细胞物体。
   3. 配置分类阈值（参见 补充图1C 用于代表性设门）。使用仅含靶标的对照孔来确定基线近红外信号⁺橙色⁻ 活体靶细胞群体。随后在较晚的时间点使用共培养孔（例如， t = 4 h）以确认近红外（NIR）信号之间具有清晰分离且重叠最小⁺/⁻ 和橙色⁺/⁻ 群体。示例分类阈值和分析参数如下所示 补充图1C.
      1. 将橙色强度阈值设置为约15。
      2. 将NIR强度阈值设置为约0.1。
         注意：参数和阈值可能因仪器、软件、细胞系模型和荧光信号强度的不同而有所差异。
         注意：如果靶细胞稳定表达近红外荧光（例如 emiRFP670），本方案可适用于原代人自然杀伤细胞（NK 细胞）的细胞毒作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）检测。此外，通过省略多聚-D-赖氨酸包被步骤，并使用平底或圆底 96 孔板，本方案也可适用于基于流式细胞术的杀伤检测。

图1利用实时活细胞成像定量分析嵌合抗原受体（CAR）NK-92细胞介导的细胞毒作用的动力学与效力 (A) IncuCyte 活细胞成像法监测自然杀伤细胞介导的细胞毒性的示意图。BCMA⁺ 表达 emiRFP670（近红外 [NIR] 通道）的 Ramos 靶细胞与表达 ZsGreen（绿色通道）的 NK-92 效应细胞共培养，并使用 SYTOX Orange（橙色通道）检测细胞死亡。 (B) 效应细胞与靶细胞比例（E:T）为1:1条件下共培养12小时的代表性荧光图像。活的靶细胞（emiRFP670⁺）以蓝色显示，NK-92 效应细胞（ZsGreen⁺绿色标记活细胞，橙色标记死细胞（SYTOX Orange）⁺）用红色标记。使用非贴壁细胞逐个分析模块在20倍镜下采集图像× 放大倍数。比例尺 = 100 µm (C) 在不同效靶比（E:T）下，定量分析对照组和表达CAR的NK-92细胞随时间变化对靶细胞生长和存活的影响。 (D) 以不同效靶比（E:T）和多个时间点（4、8、16 和 24 小时）测定靶细胞存活率。各时间点的靶细胞数量均归一化至仅含靶细胞的孔（E:T = 0:1）。 (E) 用于评估细胞毒性的定量指标示意图：KR₅₀，实现12小时50%杀伤效果所需的效应细胞与靶细胞比例；KT₅₀，效靶比为1:1时达到50%杀伤所需的时间；以及IKI₅₀整合杀伤指数定义为热图中低于50%存活率等值线以下的区域面积。 (F热图显示不同效应细胞条件下，靶细胞生长和存活随效靶比（E:T）和时间的变化。KR 的定量值₅₀，KT₅₀，以及 IKI₅₀ 每种条件下均有标明。原始活靶细胞计数来自门控的NIR⁺SYTOX Orange^– 使用 IncuCyte 2021C 软件通过单细胞分类分析对群体进行分析。 所有条件均设置三个重复（n = 3）。数据以均值表示 ± 标准差。使用非线性回归分析对 D 和 F 图中的细胞毒性趋势进行建模。 请点击此处以查看此图的放大版本。

2. 通过流式细胞术定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性

1. 制备原代人自然杀伤细胞
   注意：原代人自然杀伤细胞（NK细胞）的分离自健康成年供者的白细胞富集外周血，采用NK细胞富集法结合密度梯度离心法进行，具体步骤如前所述。³纯化的NK细胞在5 × 10⁶ 细胞/mL，加入冻存液（90% FBS 和 10% 二甲基亚砜 [DMSO]）中，分装至冻存管，每管 0.5 mL，于低于 −150 ℃ 保存°C，直至使用³.
   1. 解冻一管含有5的冻存管 × 10⁶ 通过在37℃下轻轻振荡冻存管来复苏原代人NK细胞°37°C 水浴中孵育约 1 分钟，直至仅剩少量冰晶。
      警告：应根据机构指南，采用适当的生物安全程序和个人防护装备来处理所有人体来源的样本。
      警告：二甲基亚砜（DMSO）可促进化学物质经皮肤吸收。请佩戴适当的防护装备，避免直接接触。
   2. 将解冻的细胞转移至含有10 mL预热（37℃）培养基的15 mL圆锥形离心管中°C) NK细胞培养基，轻轻晃动混匀。
      注意：NK细胞培养基由添加了10% FBS、10%人AB血清、2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、100 µg/mL 原霉素，以及 50 U/mL 人 IL-2。
   3. 离心细胞（5 分钟，300 ×g） × g，室温，加速度 = 最大；减速度［制动］ = 最大。
   4. 弃去上清液。
   5. 将沉淀重悬于5 mL预热（37℃）的°C）NK细胞培养基
   6. 离心细胞（5 分钟，300 ×g） × g，室温，加速度 = 最大；减速度［制动］ = 最大。
   7. 弃去上清液。
   8. 将沉淀重悬于1 mL预热的NK细胞培养基中。
   9. 将悬液转移至24孔组织培养板的一个孔中。
   10. 向周围孔中加入1 mL无菌PBS，以减少蒸发。
   11. 将24孔板在45℃下孵育° 角度（使用培养板架或支撑物维持该角度）于37°C，5% CO₂₂ 孵育16–24小时，以恢复自然杀伤细胞活性。
       注意：原代人自然杀伤细胞需要密切的细胞间接触以实现最佳存活和回收，可通过倾斜24孔板并使细胞在孔边缘聚集来实现。在不同实验中应保持一致的孵育时间。
       注意：恢复期结束后，直接进行靶细胞制备和共培养体系的建立。
2. 用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）染色靶细胞。
   1. 获取 5 × 10⁵ 靶细胞并转移至15 mL锥底离心管中。
      注意：CD38⁺ 采用患者来源的淋巴瘤细胞系作为靶细胞¹⁶.
   2. 用 10 mL PBS 洗涤细胞一次。
   3. 离心细胞（5 分钟，300 ×g） × g，室温，加速度 = 最大；减速度［制动］ = 最大。
   4. 制备 0.5 µ使用5 mM储存液，通过将1稀释于PBS中，制备M CFSE工作液 µ将5 mM CFSE储备液10 μL加入15 mL圆底离心管中的10 mL PBS中。
      注意：CFSE 是一种具有反应性的胺结合荧光染料，接触皮肤或眼睛可能造成危害。操作时应佩戴适当的个人防护装备，并根据当地生物安全指南处理未使用的试剂。
   5. 弃去上清液。
   6. 将沉淀物重悬于约 1 × 10⁶ 细胞/mL 在 CFSE 溶液中。
   7. 37℃孵育15分钟°C，将试管用铝箔包裹或置于不透明容器中以避光。
   8. 通过加入5–10倍体积的培养基终止反应。
   9. 37℃孵育5分钟°C.
   10. 离心细胞（5 分钟，300 ×g） × g，室温，加速度 = 最大；减速度［制动］ = 最大。
   11. 弃去上清液。
   12. 将细胞重悬于 2.5 × 10⁵ 细胞/mL，以便加入100 µL 含有 2.5 × 10⁴ 细胞
       注意：请直接进行铺板操作，以保持CFSE信号强度的一致性及靶细胞的活力。
3. 铺板靶细胞
   1. 获取一个圆底96孔板。
   2. 加入100 µ每孔靶细胞数（2.5 × 10⁵ 细胞/mL）用多通道移液器加入指定孔中（参见 补充图2每种条件设三个重复孔。
      注意：接种前需确保细胞悬液充分混匀。
4. 制备并添加抗体
   1. 制备 200 µ4升× 抗体溶液（100 µg/mL）的NK细胞培养基中，分别加入每种待测抗体及其配对的同型对照抗体。
      注意：此步骤具有模块化特性，可针对所选靶细胞系介导 ADCC 的任何抗体进行调整。抗体储备液的浓度和配方可能有所不同；应相应调整稀释比例。叠氮化物等防腐剂可能影响靶细胞存活率和 NK 细胞功能。尽管可测试一系列抗体浓度，建议终浓度为 25 µ此处使用 g/mL。
   2. 将抗体溶液转移至深孔板中。
   3. 加入50 µ每孔加入抗体溶液至靶细胞中，并用移液器吹打至少5次以充分混匀。
   4. 加入50 µ每孔加入NK细胞培养基，加入至无抗体对照孔中，并用移液器吹打至少5次以充分混匀。
   5. 37℃孵育25–30分钟°C，5% CO₂₂.
5. 制备并添加NK细胞
   1. 计数并获取 2 × 10⁵ 使用染料排除法细胞计数方法（如台盼蓝染色法）或经过验证的等效方法对NK细胞进行计数。细胞数量应足以进行三组含NK细胞的实验条件，每组设三个复孔，并需留有额外细胞以弥补移液过程中的损耗（参见 补充图2）。若细胞活力≥75%，则继续实验；若细胞活力较低，可能影响检测性能。
   2. 重悬细胞至 2.5 × 10⁵ 细胞/mL，在800 µL 人原代NK细胞培养基（终浓度 = 1.25） × 10⁴ 细胞/50 µL）。
   3. 加入50 µ每孔加入NK细胞，用移液器反复吹打混匀至少5次。
      注意：接种前需确保细胞悬液均匀。
   4. 加入50 µ每孔加入适量培养基至对照孔，并用移液器吹打至少5次以充分混匀。
6. 建立最终共培养体系
   1. 仔细检查圆底96孔板，确认所有孔中均含有200 µ液面呈均匀弯月面且无气泡。
   2. 离心平板（2 分钟，100 ×g） × g，加速度 = 低 [例如，2]；减速度（制动）= 低 [例如，2]。
      注意： 这种低速离心对于快速沉淀细胞并增加细胞间接触至关重要。我们使用可兼容摆桶转子的台式 Eppendorf 离心机 5810R，加速度和减速度设置为 2（共 9 档）。
   3. 37℃孵育16–18小时（过夜）°C，5% CO₂₂.
      注意：该孵育时间针对细胞毒性检测进行了优化，而非脱颗粒检测；脱颗粒的最佳评估方式是在较早时间点（2–6 小时）检测 CD107a 表达。因此，脱颗粒反应的峰值可能被低估。
      注意：孵育时间不要超过18小时，因为延长共培养可能导致对照孔中靶细胞死亡过多，从而降低实验条件之间的动态范围。
7. 进行流式细胞术
   1. 离心（5 分钟，300） × g，加速度 = 最大值；减速度（制动）= 最大值。
   2. 弃去上清液。
   3. 用 200 洗涤所有孔 µ每孔加入 FACS 缓冲液（PBS 中含 2% FBS 和 2 mM EDTA）
   4. 在FACS缓冲液中配制表面抗体混合液，加入CD56-BV421（1:50稀释）、CD16-BV785（1:50稀释）和CD107a-PE-Cy7（1:25稀释）。
      注意：根据实验板设计（孔数）计算总主混合液体积 × 50 µ每孔体积加20%过量）。不同抗体克隆株的染色强度和表位可及性可能存在差异。代表性数据中所用克隆株列于材料表中，其他克隆株可能需要进行滴定。可根据需要添加用于自然杀伤细胞亚群表型分析的抗体（如KIRs、NKG2A/C/D和CD57）以及活化标志物抗体（如CD69和HLA-DR）。
   5. 将细胞重悬于50 µ每孔加入抗体混合液，用移液器吹打至少5次以充分混匀。
   6. 4℃孵育15分钟°用铝箔包裹平板或将其置于不透明容器中，以避光。
   7. 加入150 µ每孔加入 FACS 缓冲液。
   8. 离心（5 分钟，300） × g，加速度 = 最大值；减速度（制动） = 最大值。
   9. 弃去上清液。
   10. 将细胞重悬于 100 µ每孔 5 L µM 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）于FACS缓冲液中，立即进行流式细胞术检测。无需在上机前孵育。
   11. 通过流式细胞术获取数据，并记录CFSE、BV421、BV785、PE-Cy7、DAPI及任何其他荧光染料的荧光通道。
       注意：采集参数（如检测器电压、补偿和设门）可能需要优化。使用未染色和单染对照进行补偿和设门设置，根据情况选择补偿微球或代表性细胞。对于表达呈连续性或较弱的标志物（如 CD107a），应考虑使用减一荧光对照。在不同实验中应保持一致的采集参数和设门策略，包括活/死细胞设门以及靶细胞和效应细胞群体的鉴定。
       注意：两者均 步骤 1 和 步骤 2 可适用于贴壁靶细胞。在共培养前一天，将靶细胞（使用其相应的培养基）以适当密度接种于平底96孔板中，使其在检测当天达到约70%的融合度。确认细胞贴壁后，弃去靶细胞培养基，并更换为100 µ新鲜NK细胞培养基，然后加入效应细胞以启动共培养。由于细胞大小和形态的差异，应针对每种贴壁细胞系优化IncuCyte单细胞分析参数。
       注意：对于基于流式细胞术的贴壁细胞检测，在共培养后，离心培养板（300 × g，5 分钟）并弃去上清液。加入 100 µ每孔加入 TrypLE，在 37 ℃ 培养°C，5% CO₂₂ 约5–15分钟（根据细胞系而定）以解离细胞。加入100 µ每孔加入 FACS 缓冲液，用移液器以环形运动反复吹打混匀，将所有细胞转移至圆底 96 孔板。在进行染色前，需在显微镜下检查各孔，确认细胞已完全脱落。步骤 2，子步骤 7）。根据需要优化 TrypLE 孵育时间，以获得单细胞悬液。

结果

为了实时定量自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞毒性，将经基因工程改造表达抗BCMA嵌合抗原受体（CAR）的NK-92效应细胞与BCMA⁺的Ramos靶细胞共同培养于黑色透明平底96孔板中，并通过活细胞成像进行监测（图1A 和 补充图1A）。效应细胞以0:1（仅靶细胞）、0.25:1、0.5:1、1:1和2:1的效靶比（E:T）加入，每种条件均设三个重复。共评估了三种不同的CAR NK-92构建体：CAR1不含共刺激结构域，CAR2含有4-1BB（CD137）共刺激结构域，CAR3含有DAP10共刺激结构域，同时设置仅表达ZsGreen的对照NK-92细胞。所有效应细胞均通过慢病毒转导生成，如前所述⁴，使用ZsGreen-P2A-CAR转基因表达盒。Ramos靶细胞同样被携带emiRFP670编码序列的慢病毒载体转导。利用活细胞成像仪每小时监测一次靶细胞的生长和存活情况，持续24小时，分别检测ZsGreen⁺ NK-92细胞的绿色荧光、SYTOX Orange⁺死亡细胞的橙色荧光以及emiRFP670⁺靶细胞的近红外（NIR）荧光（图1A 和 补充图1B 及 1C）。

在共培养期间，以特定时间间隔采集显微图像，以观察效应细胞、活靶细胞和死亡细胞（图1B）。对靶细胞生长和存活的定量分析显示，在效靶比（E:T）为1:1的条件下，尤其是早期时间点，CAR2和CAR3 NK-92细胞的杀伤动力学快于CAR1 NK-92细胞。随着E:T比的升高，靶细胞杀伤作用增强，该现象也见于对照组NK-92细胞，表明其具有天然细胞毒性（图1C）。这些测量结果凸显了活细胞成像技术在捕捉细胞毒活性动态变化方面的优势。此外，在特定时间点，靶细胞存活率还被分析为E:T比的函数，以比较CAR NK-92细胞的杀伤效力。CAR2和CAR3 NK-92细胞在较低E:T比的后期时间点（例如，24小时时E:T = 0.25:1）以及中等E:T比的早期时间点（例如，4小时时E:T = 1:1）表现出更强的效力（图1D）。在各项分析中，CAR2与CAR3 NK-92效应细胞之间的杀伤效果未观察到显著差异。

整合效应细胞与靶细胞比例（E:T）、共孵育时间及靶细胞存活率的热图，可全面可视化展示不同效应细胞群中天然及CAR介导的细胞毒性，并实现定量评估。为量化杀伤效力与动力学特征，定义了三个参数：KR₅₀，即在12小时实现50%杀伤时的杀伤细胞与靶细胞比例；KT₅₀，即在E:T比为1:1时实现50%杀伤所需的共孵育时间；以及IKI₅₀，即综合杀伤指数，代表热图中低于50%存活率区域的面积，由50%存活率的等值线界定（图1E）。这些指标可用于比较CAR-NK-92细胞的杀伤效力（KR₅₀）、杀伤动力学（KT₅₀）以及综合细胞毒作用表现（IKI₅₀）（图1F）。该分析展示了本检测方法如何在单次实验中对多种工程化NK细胞平台进行多参数的定量比较。

通过将荧光标记的靶细胞与原代人自然杀伤（NK）细胞共培养，并在存在或不存在治疗性抗体的情况下孵育16–18小时后，利用流式细胞术结合细胞计数定量残留的活靶细胞群体，从而检测抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）（图2A）。可使用配备高通量进样器的流式细胞仪，例如Cytek Aurora、BD Symphony或BD Fortessa。在代表性实验设置中（补充图2），将CD38⁺患者来源的淋巴瘤靶细胞接种于圆底96孔板中，并向相应孔中加入达雷妥尤单抗（或同型对照抗体）。随后以0.5:1的效靶比（E:T）加入NK细胞，该比例针对此类靶细胞优化，旨在最小化自然杀伤效应的同时允许检测ADCC活性。孵育结束后，通过前向散射和侧向散射进行流式细胞术分析以区分细胞群，利用DAPI排除非活细胞事件，并将CFSE⁺靶细胞与CD56⁺CD16⁺ NK细胞分离以进行并行分析（图2B）。该设计可实现细胞毒性测定与表型特征分析的同时进行。

图2．基于流式细胞术的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）检测可同时量化靶细胞存活率和自然杀伤细胞（NK细胞）的活化状态。（A）ADCC检测的示意图。将CFSE标记的CD38⁺淋巴瘤靶细胞以每孔2.5 × 10⁴个细胞的密度接种，并在五种条件下培养：仅靶细胞；靶细胞加达雷妥单抗（25 µg/mL）；靶细胞加NK细胞（效靶比E:T = 0.5:1）；靶细胞加NK细胞和达雷妥单抗；以及靶细胞加NK细胞和同型对照抗体（25 µg/mL）。 （B）代表性流式细胞术设门策略。首先根据前向散射光和侧向散射光设门，随后通过DAPI排除非活细胞。靶细胞定义为CFSE⁺事件，NK细胞定义为CD56⁺且CD16⁺的事件。NK细胞脱颗粒通过CD107a表达水平进行评估。 （C）靶细胞存活率的定量结果，以仅含靶细胞的对照组（设为100%）的相对百分比表示。 （D）NK细胞脱颗粒的定量结果，显示为NK细胞群中CD107a⁺细胞所占的百分比。 柱状图表示均值±标准差，叠加的点代表各个重复孔（n = 3）。统计分析采用单因素方差分析，结合Tukey事后多重比较检验。统计学显著性标注如下：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。请点击此处查看该图的放大版本。

主要终点是靶细胞存活率，通过活细胞CFSE⁺门控内计算，并以仅含靶细胞组（设为100%存活率）进行归一化处理。该归一化可校正靶细胞的自发性丢失，从而实现不同实验条件间的直接比较。在代表性数据中（图2C），单独加入达雷妥尤单抗并未降低靶细胞存活率，表明该抗体在无效应细胞存在时对靶细胞活力无直接作用。仅与NK细胞共培养时，靶细胞存活率降至约70%，提示存在基础水平的自然细胞毒性。加入达雷妥尤单抗后，存活率进一步降至约37%，符合抗体介导杀伤作用增强的结果；而同型对照组的存活率约为62%，与仅NK细胞组相近。成功的实验在抗体处理组与对照组之间表现出明显差异，且重复样本间具有高度可重复性。

NK细胞的二次表型分析可进一步验证靶细胞杀伤与效应细胞活化之间的关联。NK细胞脱颗粒（以CD107a⁺ NK细胞百分比表示）在无抗体的NK细胞-靶细胞共培养条件下最低，在达雷妥尤单抗处理组中最高（约31%），同型对照组则呈现中等水平的脱颗粒（约19%），支持抗体介导的活化作用（图2D）。这些结果表明，该检测方法能够区分靶细胞杀伤与效应细胞活化。尽管脱颗粒与细胞存活趋势总体一致，但二者并不完全重叠，提示它们代表的是相关但不同的生物学过程。

次优实验通常表现为不同条件之间的区分度降低、各孔之间的细胞计数变异较大、对照孔中靶细胞死亡率较高、CFSE染色较弱或背景脱颗粒水平升高。这些结果可能源于靶细胞活力不佳、NK细胞回收不一致、混匀不充分，或染色与采集过程中的变异。由于该检测方法能够独立识别靶细胞和效应细胞组分，因此可进一步扩展，用于靶细胞的额外表型分析（例如抗原密度或配体表达）以及更全面的NK细胞特征鉴定。加入“仅NK细胞”组可进一步量化基础脱颗粒水平及NK细胞活力。这种多参数设计是一个关键优势，可将功能性的细胞毒性结果与机制性免疫表型联合解读。

补充图1。 活细胞成像细胞毒性实验的代表性孔板布局与分析流程。（A）CAR-NK细胞杀伤实验的代表性96孔板布局。四种效应细胞条件按象限排列，每种条件在效应细胞与靶细胞比例（E:T）为0:1（仅靶细胞对照）、0.25:1、0.5:1、1:1和2:1下进行测试，每个条件设三个复孔（共60个检测孔）。（B）IncuCyte 2021C软件中非贴壁细胞单细胞分析的代表性配置，展示用于识别单个效应细胞与靶细胞并排除碎片和聚集体的光谱解混、分割及掩膜参数。（C）利用近红外荧光（NIR）与SYTOX Orange荧光的单细胞分类设门策略示意图，用于界定活靶细胞群体。通过仅含靶细胞的孔及共培养孔在某一时间点（t = 4 h）的数据，验证活细胞与死细胞群体之间的分离效果。 请点击此处下载该文件。

补充图2。 基于流式细胞术的ADCC检测代表性孔板布局。该96孔板布局示意图展示了在B–D行、2–6列范围内以三个复孔设置的五种实验条件（总检测孔数 = 15）：（1）仅靶细胞对照，（2）靶细胞加达雷妥单抗（daratumumab），（3）靶细胞加NK细胞，（4）靶细胞加NK细胞和达雷妥单抗，以及（5）靶细胞加NK细胞和同型对照抗体。每孔接种靶细胞数量为2.5 × 10⁴ 个，每孔加入NK细胞数量为1.25 × 10⁴ 个，以达到0.5:1的效靶比（E:T）。抗体终浓度为25 µg/mL。周围孔中加入PBS以减少蒸发。仅靶细胞组用于归一化靶细胞存活率，同型对照用于排除抗体制剂本身对结果的影响（与抗原特异性无关）。根据靶细胞系的敏感性不同，可能需要优化效靶比。 请点击此处下载该文件。

讨论

这些实验方案提供了两种互补的方法，用于在标准化的96孔板体系中定量自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞毒性。步骤1采用实时活细胞成像技术，持续监测靶细胞的丢失情况，适用于评估天然杀伤及CAR介导的杀伤在多个效靶比（E:T）条件下的动力学特征。步骤2则利用流式细胞术，在设定的共孵育时间后定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），同时分离靶细胞与效应细胞，以便进行表型分析¹⁷。这些方法作为可互补的检测平台，可用于模拟不同的生物学过程，且彼此之间易于互换。原代人NK细胞可用于基于活细胞成像的ADCC检测，也可经工程化改造后用于流式细胞术中的CAR介导杀伤检测。此外，尽管野生型NK-92细胞缺乏CD16表达¹⁸，但通过引入CD16（例如通过慢病毒转导）可使NK-92细胞高效介导ADCC。因此，这两种检测方法均可根据具体的科研与转化需求进行定制化调整。

在两种检测中，有几个步骤对可重复性尤为重要。效应细胞的数量和表型的微小变化都可能显著改变靶细胞的存活情况。准确的细胞计数以及铺板过程中的充分重悬，对于减少细胞计数偏差和混合不均至关重要。同样，细胞制备在不同实验之间必须保持一致，包括细胞活力、恢复时间以及先前的细胞因子暴露情况，以确保效应细胞功能的一致性。培养板的几何形状也是影响检测性能的关键因素。在活细胞成像流程中，平底包被板有利于稳定的图像采集和一致的视野分析；而在流式细胞术流程中，圆底板有助于细胞间的接触，并便于在实验终点回收非贴壁的共培养细胞。此外，在检测前必须确认荧光标记的质量，因为成像过程中靶细胞区分不佳或流式细胞术中CFSE信号分离不充分，都会影响定量结果和数据分析的准确性。

这两种工作流程具有不同的技术考量。在活细胞成像实验中，数据质量不佳的常见原因包括细胞铺板不均、细胞密度过高或聚集，以及图像分析阈值设置不理想，这些问题均易于纠正。这些因素可能导致细胞计数失真，并造成随时间推移的追踪结果不一致。在基于流式细胞术的实验中，结果不理想的情况更多是由于靶细胞背景死亡率过高、靶细胞与效应细胞群体分离效果差、抗体染色效果不佳，或重复孔之间的移液操作不一致所致。由于这些实验旨在进行比较分析，因此必须包含适当的内部对照以支持结果解读，包括用于归一化的仅靶细胞对照，以及与抗体或CAR特异性条件相匹配的阴性对照。

在使用这些方法时，必须考虑一些共有的以及特定检测所固有的局限性。活细胞成像检测可提供时间分辨率，但其结果依赖于准确的荧光标记和图像分析参数，而这些因素可能受到共培养过程中细胞聚集成簇、光谱重叠或细胞形态变化的影响。¹⁵在某些情况下，特别是当检测涉及原代效应细胞时，实现充分的荧光标记而不改变杀伤动力学可能较为困难或不可行。基于流式细胞术的检测可在特定终点提供较高的表型分辨率，但除非采集多个匹配的时间点数据，否则无法独立区分早期与晚期杀伤，而多时间点检测可能成本较高且耗时。¹⁷此外，终点检测结果可能不仅反映靶细胞死亡，还可能体现靶细胞增殖、效应细胞损耗或样本处理过程中恢复情况的差异。因此，CD107a等机制性读数应被视为效应细胞活化的补充指标，而非靶细胞清除的直接替代参数。¹⁹更广泛地说，这两种平台均未能完全重现塑造自然杀伤细胞功能的空间结构、基质相互作用、细胞因子梯度以及迁移限制。 体内

在解读自然杀伤细胞（NK细胞）杀伤实验时，还需考虑多种生物学因素。供体间的个体差异是使用原代人NK细胞进行实验时固有的问题，这种差异源于供体的年龄、性别、感染病史以及受体多态性，导致NK细胞的细胞毒潜力和亚群组成存在不同²⁰。使用NK-92细胞可显著降低变异性，但这些细胞仍可能因来源和传代次数不同而产生变化¹⁸。本方案通过采用标准化参数并在同一块板内进行比较，以减轻技术或实验差异，从而更准确地评估这些生物学因素。在可行的情况下，我们建议使用特定传代范围的NK-92细胞，并设定固定的活力阈值。对于原代NK细胞，每个实验条件应使用来自多个供体的NK细胞，并在统计分析中考虑供体间的变异性（例如采用配对分析或混合效应模型），因为不同条件之间的相对差异通常在不同供体间保持一致。此外，可在用于流式细胞术的抗体组合中加入其他NK细胞标志物（如KIRs、NKG2A/C/D和CD57），以比较不同供体间NK细胞亚群的频率，并评估特定亚群的NK细胞活化情况（即CD107a和CD69的表达），从而进一步促进结果的解读。最后，在所有NK细胞杀伤实验中，还需考虑某些额外情况。NK细胞本身可能表达被靶向的抗原，这种表达可能是内源性的，也可能是通过胞啃作用（trogocytosis）从靶细胞获得抗原所致，从而导致NK细胞的自相残杀（fratricide），干扰实验结果。例如，达雷妥尤单抗（daratumumab）可靶向NK细胞表面表达的CD38并诱导自相残杀²¹，从而限制对预期靶细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）效应强度。幸运的是，活细胞成像和流式细胞术可用于定量NK细胞，以评估自相残杀的发生情况。

尽管存在这些局限性，活细胞成像与流式细胞术的联合使用为在多种基础和临床前应用中进行可重复的自然杀伤细胞（NK细胞）功能检测提供了一个实用的框架。当需要关注时间动态行为时，成像流程具有优势，例如区分快速与延迟的细胞毒反应，或比较不同CAR设计之间的杀伤动力学²²。当需要在同一份样本中将功能读数与效应细胞和靶细胞的表型信息结合分析时，基于流式细胞术的流程则更具优势。这两种方法共同实现了对自然杀伤、CAR介导的细胞毒性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的定量评估，并可依托广泛可用的实验平台完成。通过建立标准化且可扩展的检测体系，该系统有助于对基于NK细胞的各种治疗模式进行严格的基准测试和机制研究，从而加速新一代免疫疗法的开发及其向临床应用的转化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高级RPMI-1640培养基	赛默飞世尔科技	12633020	NK-92 和原代人自然杀伤细胞培养用基础培养基（完整配方见实验方案）
抗人CD107a抗体，PE-Cy7标记（克隆号H4A3）	BioLegend	328618	流式细胞术脱颗粒标志物
抗人 CD16 抗体，BV785 标记（克隆 3G8）	BioLegend	302046	流式细胞术
抗人CD56抗体，BV421标记（克隆HCD56）	BioLegend	318328	流式细胞术
台式离心机，配备可兼容15 mL离心管和96孔板的摆桶式转子（Eppendorf Centrifuge 5810R）	Eppendorf	5811000015	用于细胞沉淀和培养板离心（100–300 × g)
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）	赛默飞世尔科技	C34554	用于靶细胞标记的细胞增殖染料
Cytek Aurora 光谱流式细胞仪（或同等设备）	Cytek 生物科学	N7-00003	用于流式细胞术的数据采集与分析
DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）	BioLegend	422801	活/死细胞鉴别用核染色
深孔96孔板	USA Scientific	1896-2110	用于抗体的制备
二甲基亚砜（DMSO）	Fisher Scientific	BP231-100	冷冻保存试剂
胎牛血清（FBS）	Avantor	76419-584	基础培养基添加物；用于FACS缓冲液（2% FBS）
通用型水浴锅，10 L（37 °C)	PolyScience	WBE10	用于细胞解冻
GlutaMAX（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺补充剂）	赛默飞世尔科技	35050061	稳定的谷氨酰胺来源
人AB型血清	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	原代人NK细胞培养基添加剂
IncuCyte SX5 活细胞成像系统	赛多利斯	4816	实时活细胞成像与单细胞分析
LUNA-FL 双荧光细胞计数仪（或同等产品）	Logos Biosystems	L20001	自动细胞计数
Parafilm M（4 英寸 × 250英尺卷装	杰内西	16-101	板密封与储存
磷酸盐缓冲液（PBS），无菌（pH 7.2）–7.4)	康宁	21-020-CV	用于洗涤和流式细胞术缓冲液的配制
聚-D-赖氨酸（0.1 mg/mL）	赛默飞世尔科技	A3890401	包被板试剂
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	抗生素
重组人白细胞介素-2（IL-2）	R&D Systems	202-IL-500	细胞因子
RosetteSep 人NK细胞富集试剂盒	STEMCELL Technologies	15065	人NK细胞富集试剂盒
SYTOX Orange 死细胞染料	赛默飞世尔科技	S34861	活细胞成像用活力染料
0.4% 台盼蓝	Gibco	15250-061	细胞计数用活力染料
TrypLE Express 酶（1X），无酚红	赛默飞世尔科技	12604039	用于贴壁细胞的解离
UltraPure EDTA（0.5 M，pH 8.0）	赛默飞世尔科技	15575020	用于FACS缓冲液的配制
15 mL 圆锥底离心管	康宁	352097	无菌的
24孔组织培养板（组织培养–处理过的	康宁	3524	用于自然杀伤细胞的回收
96孔透明圆底板（组织培养）–处理过的	康宁	3799	用于共培养和流式细胞术检测
96孔平底透明黑色聚苯乙烯板（组织培养）–处理过的	康宁	3603	与活细胞成像系统兼容