本方案概述了一种整合生物信息学与机器学习的工作流程，用于识别急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中按年龄分层的细胞焦亡生物标志物，并结合使用脂多糖（LPS）诱导的大鼠模型的体内实验方法，以验证频谱能量水和远红外辐射初步疗效。
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研究文章
* These authors contributed equally
本方案概述了一种整合生物信息学与机器学习的工作流程，用于识别急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中按年龄分层的细胞焦亡生物标志物，并结合使用脂多糖（LPS）诱导的大鼠模型的体内实验方法，以验证频谱能量水和远红外辐射初步疗效。
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种具有高发病率和高死亡率的危及生命的炎症性肺部疾病，其中细胞焦亡已被确认为关键的致病机制。鉴于与年龄相关的免疫和分子差异可能影响细胞焦亡过程及治疗反应，本研究旨在识别与年龄相关的细胞焦亡相关生物标志物，并评估频谱能量水（SEW）联合远红外辐射（FIR）的治疗潜力。该研究方案的完整工作流程包括转录组数据集处理、年龄分层、机器学习分析和免疫浸润分析，以鉴定与年龄相关的枢纽基因。计算分析阶段之后，采用脂多糖（LPS）诱导的ARDS大鼠模型进行体内实验验证，通过组织学评估、酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质印迹法（Western blotting）严格评估SEW+FIR干预效果，并验证枢纽基因的表达水平。共鉴定出16个与细胞焦亡相关的基因，其中AXL和GSDME主要与老年患者的ARDS严重程度相关，而SPP1在年轻个体中更具相关性。观察到不同的免疫特征：老年患者表现为M2型巨噬细胞富集及免疫抑制状态，而年轻患者则呈现促炎性免疫激活。功能分析表明，这些基因参与代谢、炎症及免疫调控通路。在体内实验中，SEW+FIR治疗减轻了肺损伤，抑制了炎症细胞因子（IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α）的产生，并调节了AXL、GSDME和SPP1的表达水平。综上所述，这些发现强调了ARDS中细胞焦亡相关机制存在年龄依赖性差异，并确定AXL、GSDME和SPP1为有待进一步临床验证的初步生物标志物候选基因。在当前的小鼠实验模型中，SEW+FIR通过减轻全身性炎症反应并调节细胞焦亡相关信号通路表现出保护作用，为其作为非药物辅助治疗策略提供了初步的体内实验支持。
急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种严重的呼吸系统疾病，其特征为急性发作的重度低氧血症和非心源性肺水肿，主要由弥漫性肺泡损伤引起1。该病可由多种肺部及肺外因素诱发。肺部病因包括感染性肺炎、胃内容物吸入以及严重胸部创伤；而肺外诱因则源于非肺部损伤引发的全身性炎症反应，例如脓毒症、胰腺炎、非胸部创伤、严重烧伤、大量输血，以及肺移植或血栓切除术后发生的再灌注损伤1,2。尽管支持治疗已取得进展，ARDS 仍是重症医学领域面临的主要临床挑战，在全球范围内具有较高的发病率和死亡率3。因此，深入理解 ALI/ARDS 的发病机制对于开发有效的治疗方法至关重要。
细胞焦亡是一种炎症性程序性细胞死亡形式，在肿瘤抑制和肿瘤治疗领域已有广泛研究4，目前已被认为在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的病理生理过程中发挥关键作用5。与凋亡不同，细胞焦亡由炎性小体激活介导，并导致胃泌素样蛋白D（gasdermin D, GSDMD）的剪切，进而形成细胞膜孔道、引起细胞裂解，并释放白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和白细胞介素-18（interleukin-....
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所有动物实验操作均严格遵循北京中医药大学东直门医院实验动物福利与伦理委员会批准的指南（批准号：19-54）进行，在研究开始前已获批准。
数据来源与数据处理
从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）中获取了两个基因表达数据集（GSE89953 和 GSE116560）20。其中，GSE89953 数据集包含来自不同年龄组急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者全肺泡巨噬细胞的转录组数据，用于差异表达分析和网络分析；GSE116560 数据集包含机械通气状态等临床信息，用于机器学习及预后模型构建。此外，从综合性人类基因注释数据库中提取了608个与细胞焦亡相关的基因，筛选标准为相关性评分大于1。基因表达数据采用R语言中的limma包进行标准化处理。临床试验编号：不适用。
差异表达基因的鉴定
根据GSE89953数据集中的患者按年龄分为两组：低龄组（<45岁）和高龄组（≥45岁）。该分界值的选择基于流行病学证据，提示急性呼吸窘迫综合征（ARDS）发病的中位年龄约为45岁21。为确保该阈值的稳健性，采用其他年龄分界值（50岁和55岁）进行了敏感性分析。这些分析在核心基因鉴定和模块聚类中显示出一致的模式，从....
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GSE89953 不同年龄组差异表达基因的鉴定及相应的功能富集分析
使用 limma 软件包中的 normalizeBetweenArrays 函数对 GSE89953 数据集的原始表达数据进行标准化（图 1A），标准化前后的箱线图显示样本间一致性得到改善。基于标准化矩阵的差异表达分析共鉴定出 228 个差异表达基因（经 Benjamini-Hochberg 校正后调整后的 p < 0.05，|log₂FC| ≥ 0.5），其中包括在高龄组中显著上调的 16 个基因和显著下调的 43 个基因（图 1B、C）。将这些差异表达基因与数据库中的焦亡相关基因取交集，获得 16 个差异表达的焦亡相关基因（DEPGs）（图 1D）。值得注意的是，在高龄组与低龄组比较中，AXL 和 GSDME 的初始表达水平显著上调，而 SPP1 明显下调，呈现出明显的年龄依赖性表达特征。G.......
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炎症性损伤累积与免疫失调是急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的典型特征，可导致严重的肺组织损伤及高死亡率。由于该病发病机制复杂且缺乏有效治疗手段，明确精准的治疗靶点对改善预后至关重要。新兴证据表明，焦亡（pyroptosis）作为一种程序性细胞死亡形式，在ARDS进展中发挥核心作用。鉴于年龄是影响ARDS发病及严重程度的重要因素，本研究以45岁为界，按年龄对数据集进行分层，以识别不同年龄组中关键的焦亡相关靶点。本研究整合了转录组分析、免疫细胞浸润谱分析及实验验证，系统探讨了ARDS在不同年龄阶段的分子特征及潜在治疗靶点。通过聚焦焦亡相关基因表达，并结合机器学习方法，我们鉴定出三个在不同年龄组中均具有诊断价值和机制意义的核心基因——AXL、GSDME和SPP1。作为一项以方法学为核心的研究，必须强调本研究方案中的关键步骤——从加权基因共表达网络分析（WGCNA）中软阈值功率的严格筛选，到体内模型中脂多糖（LPS）剂量及远红外（FIR）照射参数的精确控制——对于确保实验可重复性至关重要。遵循这一优化流程，我们在LPS诱导的ARDS大鼠模型中证实，SEW+FIR治疗至少部分通过调控上述核心基因、抑制炎症级联反应而发挥保护作用。
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作者无任何利益冲突需要披露。
作者谨向所有研究参与者表示感谢。作者感谢AiMi学术服务（www.aimieditor.com）提供的英文语言编辑和审阅服务。本研究由北京中医药大学东直门医院横向研究项目（HX-DZM：No.2017005/HX-DZM：No.2017019）、北京中医药大学研究项目（2025-JYB-JBGS-034）以及中央财政资助的高水平中医医院临床研究项目（DZMG-MLZY-23004）资助和支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗AXL抗体 | Abcam | ab215205 | |
| 抗Caspase-3抗体 | Abcam | ab184787 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| 抗GSDME抗体 | Abcam | ab215191 | |
| 抗SPP1抗体 | Abcam | ab307994 | |
| 生物显微镜 | OLYMPUS, Japan | BH2 | |
| FIR仪器 | 广东金发集团 | JF-802 | |
| 羊抗兔IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| GraphPad Prism 10.1.2 | GraphPad Software | - | |
| 高速离心机 | Thermo, USA | Sorvall ST16R | |
| IL-18 ELISA试剂盒 | 江苏美标生物科技有限公司 | MB-1735B | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | 江苏美标生物科技有限公司 | MB-1588B | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | 江苏美标生物科技有限公司 | MB-50054A | |
| ImageJ | NIH | - | |
| 脂多糖（LPS） | Sigma, USA | L6511 | |
| 雄性SPF级Sprague Dawley大鼠（6-7周龄） | 北京华阜康生物科技股份有限公司，中国 | SCXK(北京)2019-008（许可证） | |
| 酶标仪（Varioskan Flash） | Thermo Scientific | Varioskan Flash | |
| 切片机 | LEICA | RM2235 | |
| R软件（limma、clusterProfiler、WGCNA、glmnet、randomForest） | 统计计算R基金会 | - | |
| SEW制备仪器 | 广东金发集团 | JF-139 | |
| SPSS 26.0 | IBM | - | |
| 台秤 | 上海辰奕精密仪器有限公司 | HC·TP11·10 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | 江苏美标生物科技有限公司 | MB-50051A | |
| 超低温冰箱 | Thermo, USA | Forma 900系列 |