年龄特异性焦亡生物标志物分析及在急性呼吸窘迫综合征中的非药物干预

摘要

本方案概述了一种整合生物信息学与机器学习的工作流程，用于识别急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中按年龄分层的细胞焦亡生物标志物，并结合使用脂多糖（LPS）诱导的大鼠模型的体内实验方法，以验证频谱能量水和远红外辐射初步疗效。

摘要

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种具有高发病率和高死亡率的危及生命的炎症性肺部疾病，其中细胞焦亡已被确认为关键的致病机制。鉴于与年龄相关的免疫和分子差异可能影响细胞焦亡过程及治疗反应，本研究旨在识别与年龄相关的细胞焦亡相关生物标志物，并评估频谱能量水（SEW）联合远红外辐射（FIR）的治疗潜力。该研究方案的完整工作流程包括转录组数据集处理、年龄分层、机器学习分析和免疫浸润分析，以鉴定与年龄相关的枢纽基因。计算分析阶段之后，采用脂多糖（LPS）诱导的ARDS大鼠模型进行体内实验验证，通过组织学评估、酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质印迹法（Western blotting）严格评估SEW+FIR干预效果，并验证枢纽基因的表达水平。共鉴定出16个与细胞焦亡相关的基因，其中AXL和GSDME主要与老年患者的ARDS严重程度相关，而SPP1在年轻个体中更具相关性。观察到不同的免疫特征：老年患者表现为M2型巨噬细胞富集及免疫抑制状态，而年轻患者则呈现促炎性免疫激活。功能分析表明，这些基因参与代谢、炎症及免疫调控通路。在体内实验中，SEW+FIR治疗减轻了肺损伤，抑制了炎症细胞因子（IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α）的产生，并调节了AXL、GSDME和SPP1的表达水平。综上所述，这些发现强调了ARDS中细胞焦亡相关机制存在年龄依赖性差异，并确定AXL、GSDME和SPP1为有待进一步临床验证的初步生物标志物候选基因。在当前的小鼠实验模型中，SEW+FIR通过减轻全身性炎症反应并调节细胞焦亡相关信号通路表现出保护作用，为其作为非药物辅助治疗策略提供了初步的体内实验支持。

引言

急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种严重的呼吸系统疾病，其特征为急性发作的重度低氧血症和非心源性肺水肿，主要由弥漫性肺泡损伤引起¹。该病可由多种肺部及肺外因素诱发。肺部病因包括感染性肺炎、胃内容物吸入以及严重胸部创伤；而肺外诱因则源于非肺部损伤引发的全身性炎症反应，例如脓毒症、胰腺炎、非胸部创伤、严重烧伤、大量输血，以及肺移植或血栓切除术后发生的再灌注损伤^1,2。尽管支持治疗已取得进展，ARDS 仍是重症医学领域面临的主要临床挑战，在全球范围内具有较高的发病率和死亡率³。因此，深入理解 ALI/ARDS 的发病机制对于开发有效的治疗方法至关重要。

细胞焦亡是一种炎症性程序性细胞死亡形式，在肿瘤抑制和肿瘤治疗领域已有广泛研究⁴，目前已被认为在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的病理生理过程中发挥关键作用⁵。与凋亡不同，细胞焦亡由炎性小体激活介导，并导致胃泌素样蛋白D（gasdermin D, GSDMD）的剪切，进而形成细胞膜孔道、引起细胞裂解，并释放白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和白细胞介素-18（interleukin-18, IL-18）等促炎性细胞因子⁶。在ARDS中，肺泡巨噬细胞、上皮细胞和内皮细胞中过度的细胞焦亡激活可导致炎症反应加剧、肺泡-毛细血管屏障破坏、肺水肿以及低氧血症的进展⁷。越来越多的证据表明，靶向细胞焦亡通路中的关键调控因子可能成为减轻炎症反应、改善ARDS临床预后的新策略^8,9。然而，关于衰老——这一决定ARDS易感性和预后的关键因素——对细胞焦亡分子图谱的影响，目前仍存在重要的知识空白。现有研究常将ARDS视为一种单一性疾病，忽视了可能存在年龄特异性的分子驱动机制，而这些机制可能决定个体化治疗反应的差异。

近年来，新型生物物理干预手段和先进功能材料（如SEW和远红外辐射（FIR）发射器）作为调节免疫反应和抑制炎症的非药物策略，已逐渐受到关注^10,11。据报道，这些疗法可增强白细胞增殖和吞噬活性，减轻组织水肿，并缓解内毒素引起的微循环障碍——包括白细胞黏附、红细胞聚集、血小板活化和内皮损伤^12,13,14。在脂多糖（LPS）诱导的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）大鼠模型中，联合使用SEW和FIR治疗显著降低了血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞焦亡级联反应的关键下游效应分子IL-1β和IL-18的水平。这些证据强烈提示，SEW+FIR的保护作用可能通过抑制炎症小体驱动的细胞死亡实现。此外，SEW无论是单独应用还是作为溶剂介质，均可降低血清中白细胞介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达水平，同时提高白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-10（IL-10）的表达水平，并改善肺组织的组织病理学损伤^15,16,17,18。

基于这些观察结果，我们提出假设：SEW与远红外线（SEW+FIR）联合治疗急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的疗效，依赖于其调控年龄特异性焦亡通路的能力，从而以靶向方式恢复肺部免疫稳态。目前，ARDS治疗主要依赖机械通气和有限的药物干预（如糖皮质激素），但这些方法常伴随呼吸机相关性肺损伤或系统性免疫抑制的风险¹⁹。与这些传统疗法相比，SEW+FIR提供了一种非侵入性、非药物性的替代方案，可能在不引起继发性器官毒性的情况下安全地抑制早期炎症级联反应。在实际应用中，该方案最适合作为轻至中度ARDS的早期辅助干预手段。其主要局限性在于，其在重度、晚期纤维化型ARDS中的疗效尚未得到证实，且无法替代重症监护环境中的基本生命支持措施。为验证我们的假设，我们建立了一种整合性研究流程，将按年龄分层的转录组学分析与机器学习相结合，并通过体内实验进行验证。该方法不仅鉴定出AXL、GSDME和SPP1作为新的年龄特异性治疗靶点，还首次为SEW+FIR作为ARDS精准非药物干预手段的临床潜力提供了机制性证据。

方案

所有动物实验操作均严格遵循北京中医药大学东直门医院实验动物福利与伦理委员会批准的指南（批准号：19-54）进行，在研究开始前已获批准。

数据来源与数据处理
从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）中获取了两个基因表达数据集（GSE89953 和 GSE116560）²⁰。其中，GSE89953 数据集包含来自不同年龄组急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者全肺泡巨噬细胞的转录组数据，用于差异表达分析和网络分析；GSE116560 数据集包含机械通气状态等临床信息，用于机器学习及预后模型构建。此外，从综合性人类基因注释数据库中提取了608个与细胞焦亡相关的基因，筛选标准为相关性评分大于1。基因表达数据采用R语言中的limma包进行标准化处理。临床试验编号：不适用。

差异表达基因的鉴定
根据GSE89953数据集中的患者按年龄分为两组：低龄组（<45岁）和高龄组（≥45岁）。该分界值的选择基于流行病学证据，提示急性呼吸窘迫综合征（ARDS）发病的中位年龄约为45岁²¹。为确保该阈值的稳健性，采用其他年龄分界值（50岁和55岁）进行了敏感性分析。这些分析在核心基因鉴定和模块聚类中显示出一致的模式，从而在统计学上验证了45岁分界值适用于后续的下游分析。数据集使用R语言中的limma包进行标准化处理。通过线性模型结合经验贝叶斯方法识别不同年龄组间的差异表达基因（DEGs）。筛选标准为调整后P值<0.05且|log₂倍数变化|≥0.5的基因被视为具有统计学意义的差异表达基因。使用R语言中的ggplot2包绘制火山图和热图以可视化差异表达基因。

焦亡相关基因的鉴定与富集分析
使用关键词“pyroptosis”从基因注释数据库中检索出与焦亡相关的基因。差异表达基因（DEGs）与焦亡相关基因的交集被定义为差异表达的焦亡相关基因（DEPGs）。利用R语言中的clusterProfiler包对DEPGs进行基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。²²生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）类别进行了注释，Z-score ≥ 1 且经调整 P 数值 < 0.05 被视为具有显著性。

加权基因共表达网络分析（WGCNA）
为鉴定与细胞焦亡相关的基因模块，使用WGCNA R软件包进行加权基因共表达网络分析。采用26的软阈值幂（β）构建有符号网络，以确保无标度拓扑结构²³。通过动态树剪切算法识别模块，设定最小模块大小为30，深度分割参数为2，合并阈值（剪切高度）为0.25。计算各模块特征基因（module eigengenes）与细胞焦亡性状之间的相关性。对选定的模块使用从MsigDB下载的标志性基因集进行基因集变异分析（GSVA）^24,25。

机器学习
以45岁为界，将GSE116560数据集划分为高龄组和低龄组，并使用机器学习算法对两组数据进行分析。采用R语言中的glmnet包（版本4.1-2）进行最小绝对收缩与选择算子（LASSO）回归分析，通过10折交叉验证（1-SE准则）确定最优惩罚参数（λ）。对于随机森林（RF）算法，构建500棵树（ntree = 500），每次分裂时选取的特征数量（mtry）设为预测变量总数的平方根，以确保模型稳定性。两种方法所得基因的交集被定义为年龄特异性特征基因。

诊断模型的构建与评价
基于鉴定出的特征基因构建诊断预测模型。采用逻辑回归方法建立模型，并绘制列线图以直观展示其预测能力。通过受试者工作特征（ROC）曲线评估模型性能，计算曲线下面积（AUC）以评价其诊断准确性。通过自助法重采样进行内部验证。进一步利用校准图和决策曲线分析（DCA）评估模型的稳定性及临床实用性。

免疫浸润分析
基于LM22特征矩阵，采用CIBERSORT算法估算高年龄组与低年龄组中的免疫细胞组成。比较两组间22种免疫细胞类型的相对比例。利用单样本数据，分析枢纽基因在不同免疫细胞亚群中的差异表达，并通过热图和直方图进行可视化展示。

基因集富集分析（GSEA）
分别对高年龄组和低年龄组的枢纽基因进行基因集富集分析（GSEA）。该分析使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）基因集进行。基因根据高表达组与低表达组之间的信噪比（或倍数变化）进行排序。随后通过1,000次置换检验计算富集得分和标准化富集得分（NES），以鉴定显著富集的通路。假发现率（FDR）小于0.25且名义P值小于0.05的通路被视为显著富集。该分析进一步用于推断各枢纽基因可能调控的生物学通路。

实验动物
本研究使用了18只雄性SPF级Sprague Dawley大鼠（6至7周龄，体重180 g ± 10 g）。详细的供应商信息见材料表。

试剂与仪器
采用电磁场处理水制备装置和远红外发射仪器进行实验干预，分别提供谱能水（SEW）和远红外辐射（FIR）。使用脂多糖（LPS）建立急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型。采用特异性ELISA试剂盒对细胞因子水平（IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α）进行定量检测。使用特异性一抗及相应的HRP标记二抗检测蛋白表达水平（AXL、SPP1、Caspase-3、GSDME、GAPDH）。样品处理与分析使用常规实验室设备完成，包括生物显微镜、切片机、高速离心机、超低温冰箱和酶标仪。所有试剂、抗体及仪器的完整信息及其相应生产厂家详见材料表。

动物分组与造模
将18只Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、模型组和SEW+FIR组，每组6只。每日对各组大鼠进行称重并记录。SEW+FIR组在温度受控的环境中（22 °C ± 2 °C）每日接受远红外线（FIR）治疗一次，波长为4 µm–14 µm，照射距离背部表面20 cm，每次持续20分钟；同时通过口服灌胃给予SEW，剂量为1 mL/100 g/d⁷。对照组和模型组则以等量（1 mL/100 g/d）的蒸馏水经口灌胃。SEW和蒸馏水均在60 °C温水浴加热后每日给药一次，连续7天。第七天进食后6小时，模型组和SEW+FIR组通过尾静脉注射脂多糖（LPS）溶液，剂量为2 mg/kg体重；对照组则给予0.9%生理盐水，剂量为2 mg/kg体重。该造模方法被认为是通过尾静脉单次注射LPS诱导全身炎症反应的成熟且稳定的方法。造模组肺组织病理学表现符合急性呼吸窘迫综合征（ARDS）特征²⁵。质控点：成功诱导ARDS的标志包括注射后16小时内出现明显嗜睡、呼吸急促以及体重下降约10%²⁶。

大鼠相关指标的采集
16小时后，所有三组大鼠均按30 mg/kg体重剂量经腹腔注射3%戊巴比妥钠以诱导麻醉。关键步骤：在进行任何操作干预前，必须通过足底回缩反射消失严格确认麻醉深度。此外，严格遵守生物安全规程；所有被脂多糖（LPS）污染的材料、生物液体及动物尸体均须丢弃至指定的生物危害废物容器中，并进行妥善焚烧处理。通过腹主动脉采集5 mL血液至无菌试管中，于4 °C条件下以1,000 × g 离心20分钟分离血清。血清随后储存于−80 °C，用于后续分析。在开胸并结扎右侧肺门后，通过气管插管以预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗左肺三次，获取支气管肺泡灌洗液（BALF）。BALF于4 °C条件下以1,000 × g 离心10分钟，上清液储存于−80 °C。取右侧肺上叶组织，用冷生理盐水清洗以去除血液。按组织重量加入9倍体积的生理盐水，在冰浴中使用眼科剪将组织剪碎。使用匀浆器制备10%肺组织匀浆，随后于4 °C条件下以700 × g 离心15分钟。收集上清液并储存于−80 °C，用于后续生化分析。此外，每只大鼠的部分右侧肺组织用4%多聚甲醛固定，用于组织学检查。

观察指标及检测方法
右肺下叶经4%多聚甲醛固定后，进行常规包埋、切片、脱蜡、苏木精-伊红（HE）染色、分色、脱水及封片处理，于光学显微镜下观察各组肺组织的病理学改变。

在光学显微镜下观察到肺泡结构和肺泡隔的病理异常、炎性细胞浸润程度、充血及肺毛细血管水肿情况。北京中医药大学病理学系协助完成相关观察。组织学肺损伤评分按以下标准计算以评估肺损伤程度：无损伤 = 0，视野中25%以下区域出现损伤 = 1，25%–50%区域出现损伤 = 2，50%–75%区域出现损伤 = 3，超过75%区域出现损伤 = 4。由对分组信息设盲的研究人员随机选取10个视野进行评估。

根据制造商说明书，对先前收集的支气管肺泡灌洗液上清、肺组织匀浆和血清样本进行ELISA检测。简言之，将样本加入预先包被的孔板中，在37 °C孵育90分钟。用洗涤缓冲液洗涤五次后，加入生物素标记的检测抗体（1:100稀释），在37 °C孵育60分钟。再次洗涤后，加入HRP偶联物，在37 °C避光孵育30分钟。随后使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，以计算样本浓度。

采用 Western blot 分析法检测保存在 −80°C 的肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）样品中 AXL、SPP1、caspase-1、GSDMD、caspase-3、GSDME 和 GAPDH 的表达水平。根据蛋白提取试剂盒说明书提取并裂解蛋白。每孔上样等量的蛋白提取物（40 µg），通过 SDS-PAGE 分离多肽，随后将蛋白转移至 PVDF 膜。膜在室温下用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 封闭 1 小时，然后在 4 °C 下与特异性一抗（1:1000 稀释）孵育过夜。用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟，再在室温下与相应 HRP 标记的二抗（1:5000 稀释）在封闭液中孵育 1 小时。以 GAPDH 作为内参蛋白。使用增强化学发光（ECL）试剂盒显影，曝光时间为 1–5 分钟，并通过图像处理软件分析结果。目标蛋白的相对表达水平以目标蛋白与 GAPDH 的比值计算。

统计学分析
定量指标以均值 ± 标准差表示，采用统计学软件进行统计分析。根据数据是否呈正态分布，分别采用Kruskal–Wallis检验或单因素方差分析（one-way ANOVA）比较多个组间的差异。所有统计检验均采用双侧假设检验。对于涉及多重比较的分析，如差异基因表达和免疫细胞浸润谱分析，采用Benjamini-Hochberg法对P值进行假发现率（FDR）校正。校正后的P值小于或等于0.05被认为具有统计学显著性。使用绘图软件生成图表。

结果

GSE89953 不同年龄组差异表达基因的鉴定及相应的功能富集分析
使用 limma 软件包中的 normalizeBetweenArrays 函数对 GSE89953 数据集的原始表达数据进行标准化（图 1A），标准化前后的箱线图显示样本间一致性得到改善。基于标准化矩阵的差异表达分析共鉴定出 228 个差异表达基因（经 Benjamini-Hochberg 校正后调整后的 p < 0.05，|log₂FC| ≥ 0.5），其中包括在高龄组中显著上调的 16 个基因和显著下调的 43 个基因（图 1B、C）。将这些差异表达基因与数据库中的焦亡相关基因取交集，获得 16 个差异表达的焦亡相关基因（DEPGs）（图 1D）。值得注意的是，在高龄组与低龄组比较中，AXL 和 GSDME 的初始表达水平显著上调，而 SPP1 明显下调，呈现出明显的年龄依赖性表达特征。G...

讨论

炎症性损伤累积与免疫失调是急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的典型特征，可导致严重的肺组织损伤及高死亡率。由于该病发病机制复杂且缺乏有效治疗手段，明确精准的治疗靶点对改善预后至关重要。新兴证据表明，焦亡（pyroptosis）作为一种程序性细胞死亡形式，在ARDS进展中发挥核心作用。鉴于年龄是影响ARDS发病及严重程度的重要因素，本研究以45岁为界，按年龄对数据集进行分层，以识别不同年龄组中关键的焦亡相关靶点。本研究整合了转录组分析、免疫细胞浸润谱分析及实验验证，系统探讨了ARDS在不同年龄阶段的分子特征及潜在治疗靶点。通过聚焦焦亡相关基因表达，并结合机器学习方法，我们鉴定出三个在不同年龄组中均具有诊断价值和机制意义的核心基因——AXL、GSDME和SPP1。作为一项以方法学为核心的研究，必须强调本研究方案中的关键步骤——从加权基因共表达网络分析（WGCNA）中软阈值功率的严格筛选，到体内模型中脂多糖（LPS）剂量及远红外（FIR）照射参数的精确控制——对于确保实验可重复性至关重要。遵循这一优化流程，我们在LPS诱导的ARDS大鼠模型中证实，SEW+FIR治疗至少部分通过调控上述核心基因、抑制炎症级联反应而发挥保护作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗AXL抗体	Abcam	ab215205
抗Caspase-3抗体	Abcam	ab184787
抗GAPDH抗体	Abcam	ab8245
抗GSDME抗体	Abcam	ab215191
抗SPP1抗体	Abcam	ab307994
生物显微镜	OLYMPUS, Japan	BH2
FIR仪器	广东金发集团	JF-802
羊抗兔IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6721
GraphPad Prism 10.1.2	GraphPad Software	-
高速离心机	Thermo, USA	Sorvall ST16R
IL-18 ELISA试剂盒	江苏美标生物科技有限公司	MB-1735B
IL-1β ELISA试剂盒	江苏美标生物科技有限公司	MB-1588B
IL-6 ELISA试剂盒	江苏美标生物科技有限公司	MB-50054A
ImageJ	NIH	-
脂多糖（LPS）	Sigma, USA	L6511
雄性SPF级Sprague Dawley大鼠（6-7周龄）	北京华阜康生物科技股份有限公司，中国	SCXK(北京)2019-008（许可证）
酶标仪（Varioskan Flash）	Thermo Scientific	Varioskan Flash
切片机	LEICA	RM2235
R软件（limma、clusterProfiler、WGCNA、glmnet、randomForest）	统计计算R基金会	-
SEW制备仪器	广东金发集团	JF-139
SPSS 26.0	IBM	-
台秤	上海辰奕精密仪器有限公司	HC·TP11·10
TNF-α ELISA试剂盒	江苏美标生物科技有限公司	MB-50051A
超低温冰箱	Thermo, USA	Forma 900系列