本方案提供了一种使用标准化、高通量化合物筛选方法 体内 利用斑马鱼量化多巴胺能神经元的丢失及运动行为缺陷，从而实现对神经保护化合物的高效筛选。
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摘要
摘要
神经退行性疾病药物发现研究受到传统哺乳动物模型高成本和低通量的限制。这一瓶颈在帕金森病研究中尤为突出，其中多巴胺能（DA）神经元变性的严格且可扩展的研究仍进展缓慢且耗费大量资源。为弥补这一空白，我们提出一种标准化的高通量表型分析流程，利用在DA神经元中表达硝基还原酶的转基因斑马鱼模型，可在受精后五天内研究DA神经元的丢失。斑马鱼在转化神经科学中具有显著优势，包括幼体发育迅速、光学透明性，从而能够实现 体内 全脑成像、帕金森病相关基因与通路的高度保守性，以及细胞培养模型无法实现的完整神经环路。本实验方案结合化学遗传学消融与高内涵成像技术，以快速生成用于筛选的数据集。多巴胺能神经元通过甲硝唑（MTZ）实现特异性消融，从而产生可调控且特异的神经退行性变。MTZ处理导致运动能力呈剂量依赖性下降，表现出类似运动迟缓的表型，为多巴胺能神经元丢失提供可靠的行為学相关指标。鉴于帕金森病本质上是一种运动障碍疾病，我们结合解剖学测量与功能性行为读数进行分析。运动活动直接在孔板中记录，并通过自动追踪系统进行量化，提取的参数包括总移动距离、游泳爆发频率及启动次数。斑马鱼是一种高效且可扩展的模型系统，可同时对数百个幼体进行检测，操作简便。我们优化了一种高通量、基于孔板的药物筛选流程，旨在减少本科生科研中的实验变异。这种标准化的孔板筛选格式用于评估候选化合物的神经保护或功能挽救效果，确保不同研究人员获得的数据具有统计可比性，有效识别潜在神经保护剂，提升实验可重复性。综上，该方法为神经退行性研究提供了一个稳健且可扩展的技术框架。
引言
神经退行性疾病领域的药物发现研究由于传统哺乳动物模型成本高、通量低而面临显著的效率瓶颈1,2，需要周密的实验设计以及大量人力投入。本方法的总体目标是提供一种标准化、高通量的研究方案，利用Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry)转基因斑马鱼模型，在该模型中硝基还原酶-mCherry特异性表达于多巴胺能（DA）神经元，以研究DA神经元丢失及运动功能障碍。采用该技术的理论依据在于神经退行性疾病研究迫切需要严谨、可扩展且经济可行的体内模型3,4,5。尽管体外细胞培养可用于快速药物筛选，但缺乏完整的神经环路和整体生物体环境，难以实现转化应用的相关性6。相比之下，啮齿类动物模型虽能提供优良的生理背景，但在神经保护化合物的初期高通量筛选中成本高昂且耗时较长7,8。
斑马鱼具有快速的幼体发育过程以及光学透明性，这使其能够 体内 全脑成像，以及与疾病相关通路（特别是神经退行性变相关通路）的高度遗传....
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方案
所有涉及脊椎动物实验对象的操作均遵循机构动物照护与使用委员会（IACUC 批准号 AUP-25-098）的指导方针进行。
1. 斑马鱼养殖
- 维持水生系统条件
- 将循环水生系统维持在28.5°C（可接受范围：26°C–30°C）、pH 7.1–7.8、电导率600–700 µS/cm的条件下。成年斑马鱼在饲养缸中的养殖密度约为5尾/升。
- 根据制造商说明书，使用比色法水族水质检测试剂盒每日监测氨、亚硝酸盐和硝酸盐水平。氨和亚硝酸盐应维持在0 ppm，硝酸盐维持在10–20 ppm之间。
- 当氨或亚硝酸盐超过0 ppm、硝酸盐超过20 ppm、出现可见浑浊或碎屑，或pH/电导率数值超出步骤1.1.1所述目标范围时，进行换水操作。持续换水直至氨和亚硝酸盐恢复至0 ppm，硝酸盐恢复至10–20 ppm，且pH/电导率数值恢复至目标范围。
- 维持14小时光照：10小时黑暗的光周期，以同步昼夜节律和繁殖周期。
- 在不同发育阶段饲喂斑马鱼
- 每日两次饲喂成年鱼0.5 mm缓沉颗粒饲料。通过摄食时间标准化投喂量，仅提供3–5分钟内可被完全摄食的量。实验各组应始终使用相同粒径和类型的饲料。
- 每日三次饲喂幼鱼Gemma Micro 75 ZF，或使用粒径约75 µm的....
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结果
MTZ 处理导致剂量依赖性的多巴胺能神经元丢失和运动功能障碍
为了确定MTZ介导的多巴胺能（DA）神经元消融的最佳参数，在24小时处理后，评估了3、4.5和9 mM MTZ浓度下DA神经元存活的替代指标——荧光强度以及运动距离。每个处理组包含n = 10条独立的Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry)幼鱼，并设有匹配的溶剂对照组（含1% DMSO的BEW溶液，加入200 µM PTU，n = 10）。所有幼鱼均来自经验证的纯合亲本产生的单次产卵后代。与溶剂处理对照组相比，MTZ处理导致DA神经元荧光强度呈剂量依赖性降低，代表性荧光图像（图2）和荧光定量结果（图4B）均显示了这一趋势。行为学分析表明，MTZ处理后幼鱼总运动距离也呈剂量依赖性减少（图4A）。线性回归分析进一步显示，各处理组中荧光保留水平与运动输出之间具有良好的一致性（
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讨论
本方案提供了一种可扩展的体内流程，利用转基因斑马鱼中的NTR–MTZ化学遗传系统，定量多巴胺能神经元的丢失并筛选神经保护化合物。该标准化的基于孔板的操作流程专为本科生研究团队设计，适用于操作人员流动性高且研究人员经验在不同学期间差异较大的情况。流程的每一步均以可重复性和易于培训为优先考虑，确保多名使用者在操作中保持高度一致性且变异最小。本方案通过将治疗前后的成对多巴胺能神经元成像与基于孔板的行为学分析相结合，构建了标准化的工作流程，从而在同一可扩展筛选平台上实现神经元结构损失测量与功能运动结果的比较，推动了现有斑马鱼神经退行性变研究方法的发展。采用此流程，一个96孔板可在4 dpf时包埋并完成基线成像，经24小时处理后，于5 dpf时再次成像。通常，每块板的包埋耗时约1小时，每次成像会话的荧光成像时间约为每板1小时（具体取决于显微镜设置），图像采集完成后，每板的半自动荧光分析约需3小时。
行为检测每孔使用五条幼虫，以提高通量，同时为每次记录保留相对较大的游泳区域。在此模式下，总移动距离可作为比较不同处理条件的可靠群体水平运动终点指标。由于同一孔中存在多条幼虫，可能会出现短暂的路径交.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
感谢加州大学旧金山分校的苏果博士提供转基因斑马鱼，感谢加州大学欧文分校的Daeseok Eom博士、Michael Parsons博士和Eddie Hallo提供野生型胚胎以及在斑马鱼饲养和鱼类设施维护方面的指导。同时感谢加州大学欧文分校Robert A. Mah分子创新中心和Falling Leaves创新大楼的工作人员为水生设施提供的基础设施支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 成年斑马鱼饲料，0.5 mm 颗粒 | Zeigler | AH271 | 用于常规饲养期间喂养成年斑马鱼 |
| 低熔点琼脂糖（LMA） | Sigma-Aldrich | A9414-10G | 用于将幼鱼包埋于孔板中，以便成像时稳定定位 |
| 铝箔 | ULINE | S-20197 | 用于在制备和孵育过程中保护对光敏感的试剂（如 MTZ） |
| CellProfiler | Broad Institute | RRID: SCR_007358 | 用于可选的自动化荧光图像分析 |
| 锥形管，15 mL | Corning | 352097 | 用于试剂制备和样品处理 |
| 锥形管，50 mL | Corning | 352070 | 用于试剂制备和溶液储存 |
| 交配缸（1.0 L） | Aquaneering | ZHCT100 | 用于控制斑马鱼繁殖和胚胎收集 |
| Danio rerio（AB 野生型） | — | — | 非转基因对照品系，用于验证硝基还原酶依赖性效应的特异性 |
| Danio rerio（Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry)） | — | — | 转基因斑马鱼品系，在多巴胺能神经元中表达硝基还原酶-mCherry，用于靶向化学遗传消融 |
| 二甲基亚砜（DMSO），无水（≥99.9%） | Sigma-Aldrich | 472301-500ML | 用作 PTU、MTZ 和筛选化合物的溶剂 |
| EthoVision XT | Noldus | RRID: SCR_000441 | 行为追踪软件，用于量化幼鱼运动 |
| Fiji（ImageJ） | NIH | RRID: SCR_003070 | 图像分析软件，用于荧光定量分析 |
| 细尖镊子或 0.25 mm 探针 | World Precision Instruments | WPI0118 | 用于琼脂糖包埋过程中调整幼鱼方向 |
| 荧光显微镜 | Zeiss | 11845460 | 通过 mCherry 荧光成像多巴胺能神经元 |
| Gemma Micro 150 ZF（幼鱼饲料，100–200 μm） | Skretting | 10818945 | 用于喂养幼年斑马鱼 |
| Gemma Micro 75 ZF（幼体饲料，50–100 μm） | Skretting | 10818935 | 用于喂养斑马鱼幼体 |
| GraphPad Prism | GraphPad | RRID: SCR_002798 | 统计分析软件，用于数据分析和绘图 |
| 加热块（可达到 42°C 和 70°C） | Thermo Fisher | 88870001 | 用于熔化并维持琼脂糖在受控温度下 |
| 高分辨率相机（支持俯视安装） | Basler | 88-327 | 用于记录幼鱼运动活动 |
| 盐酸（HCl），0.1 M | Fisher Scientific | SA48-500 | 用于三卡因溶液制备过程中的 pH 调节 |
| 培养箱（28.5°C，14 小时光照:10 小时黑暗光周期） | Millipore | Z763314 | 维持斑马鱼发育所需的受控环境条件 |
| Instant Ocean 海盐 | Instant Ocean | SS15-10 | 用于制备蓝色养卵水（BEW） |
| 漫射光片（或等效材料） | Edmund Optics | 27-103 | 用于提供均匀照明，并在行为记录期间最小化反光 |
| 光源板 | Lightcraft | LC2004LED | 在运动追踪期间提供底部照明 |
| 甲硝唑（MTZ） | Sigma-Aldrich | M3761-100G | 用于多巴胺能神经元的化学遗传消融 |
| 亚甲蓝，1% 水溶液 | Sigma-Aldrich | M9140 | 添加至 BEW 中以防止胚胎微生物生长 |
| 微量离心管，1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | 用于试剂分装和储存 |
| 移液器，P200 | Gilson | FP10005S | 用于处理幼鱼和配制溶液 |
| 培养皿，100 mm | Corning | CLS430167 | 用于胚胎收集和孵育 |
| 移液器吸头，200 μL | RAININ | 30389188 | 与移液器配合使用，用于液体操作和幼鱼转移 |
| 氯化钠（NaCl），≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888-500G | 用于缓冲液和水溶液的配制 |
| 氢氧化钠（NaOH），0.1 M | Fisher Scientific | SS256-500 | 用于三卡因溶液制备过程中的 pH 调节 |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ-745 | 用于包埋过程中幼鱼的操作和定向 |
| 温控加热垫（25°C–28°C） | Vivosun | V-SHMDT | 在行为记录期间维持稳定温度 |
| 三卡因甲磺酸盐（MS-222） | Sigma-Aldrich | E10521-10G | 用作斑马鱼幼体的麻醉剂 |
| Tris 碱 | Fisher Scientific | BP152-1 | 用于配制缓冲型三卡因溶液 |
| 水纯化系统 | Millipore | ZIQ7003T0 | 用于生成去离子水以配制溶液 |
| 斑马鱼饲养缸 | Aquaneering | ZS560 | 用于维持成年斑马鱼种群 |
| 1-苯基-2-硫脲（PTU） | Sigma-Aldrich | P7629-10G | 用于抑制黑色素生成，保持光学透明性 |
| 6 孔板，平底 | Corning | 07-200-83 | 用于运动行为检测 |
| 96 孔板，平底 | Greiner Bio-One | 655096 | 用于高通量成像和筛选检测 |
参考文献
- Haynes, E. M., Ulland, T. K., Eliceiri, K. W. A model of discovery: the role of imaging established and emerging non-mammalian models in neuroscience. Front Mol Neurosci. 15, 867010 (2022).
- Yang, W., Chen, X., Li, S., Li, X. J.
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