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方法文章

利用行为学分析和高内涵成像对斑马鱼幼鱼中多巴胺能神经变性的活体表型鉴定

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DOI：

10.3791/71516

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2026年6月16日

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1Department of Clinical Pharmacy Practice, UC Irvine School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2Robert A. Mah Molecular Innovation Center, University of California Irvine

本文内容

摘要

本方案提供了一种使用标准化、高通量化合物筛选方法 体内 利用斑马鱼量化多巴胺能神经元的丢失及运动行为缺陷，从而实现对神经保护化合物的高效筛选。

摘要

神经退行性疾病药物发现研究受到传统哺乳动物模型高成本和低通量的限制。这一瓶颈在帕金森病研究中尤为突出，其中多巴胺能（DA）神经元变性的严格且可扩展的研究仍进展缓慢且耗费大量资源。为弥补这一空白，我们提出一种标准化的高通量表型分析流程，利用在DA神经元中表达硝基还原酶的转基因斑马鱼模型，可在受精后五天内研究DA神经元的丢失。斑马鱼在转化神经科学中具有显著优势，包括幼体发育迅速、光学透明性，从而能够实现 体内 全脑成像、帕金森病相关基因与通路的高度保守性，以及细胞培养模型无法实现的完整神经环路。本实验方案结合化学遗传学消融与高内涵成像技术，以快速生成用于筛选的数据集。多巴胺能神经元通过甲硝唑（MTZ）实现特异性消融，从而产生可调控且特异的神经退行性变。MTZ处理导致运动能力呈剂量依赖性下降，表现出类似运动迟缓的表型，为多巴胺能神经元丢失提供可靠的行為学相关指标。鉴于帕金森病本质上是一种运动障碍疾病，我们结合解剖学测量与功能性行为读数进行分析。运动活动直接在孔板中记录，并通过自动追踪系统进行量化，提取的参数包括总移动距离、游泳爆发频率及启动次数。斑马鱼是一种高效且可扩展的模型系统，可同时对数百个幼体进行检测，操作简便。我们优化了一种高通量、基于孔板的药物筛选流程，旨在减少本科生科研中的实验变异。这种标准化的孔板筛选格式用于评估候选化合物的神经保护或功能挽救效果，确保不同研究人员获得的数据具有统计可比性，有效识别潜在神经保护剂，提升实验可重复性。综上，该方法为神经退行性研究提供了一个稳健且可扩展的技术框架。

引言

神经退行性疾病领域的药物发现研究由于传统哺乳动物模型成本高、通量低而面临显著的效率瓶颈1,2，需要周密的实验设计以及大量人力投入。本方法的总体目标是提供一种标准化、高通量的研究方案，利用Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry)转基因斑马鱼模型，在该模型中硝基还原酶-mCherry特异性表达于多巴胺能（DA）神经元，以研究DA神经元丢失及运动功能障碍。采用该技术的理论依据在于神经退行性疾病研究迫切需要严谨、可扩展且经济可行的体内模型3,4,5。尽管体外细胞培养可用于快速药物筛选，但缺乏完整的神经环路和整体生物体环境，难以实现转化应用的相关性6。相比之下，啮齿类动物模型虽能提供优良的生理背景，但在神经保护化合物的初期高通量筛选中成本高昂且耗时较长7,8。

斑马鱼具有快速的幼体发育过程以及光学透明性，这使其能够 体内 全脑成像，以及与疾病相关通路（特别是神经退行性变相关通路）的高度遗传保守性9,10,11该方案特别整合了标准化的饲养流程、通过甲硝唑（MTZ）实现的化学遗传学消融，以及高通量成像与功能性行为追踪技术。直接测量运动活动可为多巴胺能神经元丢失提供可靠的行為学相关指标，因为多巴胺神经元的丢失与行为异常密切相关。12,13,14标准化的基于孔板的实验格式可最大限度地减少不同操作者之间的实验差异，而斑马鱼幼体系统的高通量特性支持大样本量，二者结合提供了足够的统计效能以检测神经保护作用。这使得该方案特别适用于需要可扩展且可重复筛选的应用场景，包括研究人员经验水平参差的情况。

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方案

所有涉及脊椎动物实验对象的操作均遵循机构动物照护与使用委员会（IACUC 批准号 AUP-25-098）的指导方针进行。

1. 斑马鱼养殖

  1. 维持水生系统条件
    1. 将循环水生系统维持在28.5°C（可接受范围：26°C–30°C）、pH 7.1–7.8、电导率600–700 µS/cm的条件下。成年斑马鱼在饲养缸中的养殖密度约为5尾/升。
    2. 根据制造商说明书，使用比色法水族水质检测试剂盒每日监测氨、亚硝酸盐和硝酸盐水平。氨和亚硝酸盐应维持在0 ppm，硝酸盐维持在10–20 ppm之间。
    3. 当氨或亚硝酸盐超过0 ppm、硝酸盐超过20 ppm、出现可见浑浊或碎屑，或pH/电导率数值超出步骤1.1.1所述目标范围时，进行换水操作。持续换水直至氨和亚硝酸盐恢复至0 ppm，硝酸盐恢复至10–20 ppm，且pH/电导率数值恢复至目标范围。
    4. 维持14小时光照：10小时黑暗的光周期，以同步昼夜节律和繁殖周期。
  2. 在不同发育阶段饲喂斑马鱼
    1. 每日两次饲喂成年鱼0.5 mm缓沉颗粒饲料。通过摄食时间标准化投喂量，仅提供3–5分钟内可被完全摄食的量。实验各组应始终使用相同粒径和类型的饲料。
    2. 每日三次饲喂幼鱼Gemma Micro 75 ZF，或使用粒径约75 µm的等效幼鱼饲料；饲喂一月龄幼鱼Gemma Micro 150 ZF，或使用粒径约150 µm的等效斑马鱼饲料，每日三次。
    3. 仅当替代饲料专为斑马鱼幼体或幼鱼配制、具有相近粒径，并能提供适合相应发育阶段的高蛋白、营养全面的饲料时，方可使用等效饲料。
    4. 在工作日中午每日补充一次新鲜孵化的活体卤虫无节幼体，作为幼鱼和幼体饲料的补充。根据制造商说明书，在充气的盐水中孵化卤虫卵24–36小时。
    5. 收集活跃游动的无节幼体，用系统水冲洗后，仅投喂5–10分钟内可被完全摄食的量。
    6. 避免过度投喂，因残余饲料会升高氨浓度。
      注：每日通过轻柔虹吸法清除未摄食的饲料和可见碎屑。检查鱼缸中是否有死亡或不健康的鱼，并在观察到碎屑积聚时清洁缸体表面或滤网。实验各组之间应保持一致的养殖密度、投喂、清洁及水质监测操作。有关斑马鱼饲养管理、发育分期、卤虫培养及长期设施维护的更多细节，请参见Westerfield15 和 Avdesh 等人16。

2. 胚胎收集、试剂配制与转基因筛选

  1. 设置交配组合
    1. 在收集胚胎的前一天晚上，组装带有隔板的交配用鱼缸。
    2. 在每个交配缸中放入一条雄鱼和两条雌性斑马鱼，用隔板将雄鱼和雌鱼隔开，过夜。
    3. 次日清晨，在光照周期开始时移除隔板，允许产卵持续固定2小时。在产卵期结束后立即收集胚胎，以尽量减少胚胎发育阶段的差异。
  2. 收集并孵育胚胎
    1. 通过将鱼缸中的水倒入孔径为400 µm的滤网中收集胚胎。用系统用水或蓝色卵水（BEW）轻轻冲洗胚胎以去除碎片，然后使用一次性移液管将胚胎转移至100 mm的培养皿中。尽量减少操作，并避免胚胎长时间暴露于空气中。
    2. 将胚胎转移至含有30 mL BEW的100 mm培养皿中，每皿放置50–60枚胚胎。每皿胚胎数量不得超过60枚，以保证发育一致性和充足的氧气供应。
    3. 在28.5°C、14小时光照:10小时黑暗的光周期条件下孵育胚胎。
    4. 每天清除未受精卵和无法正常发育的胚胎。
      ​注：BEW的配制方法为：60 mg Instant Ocean海盐、50 µL 1%亚甲蓝溶液，溶于1 L去离子水中17。
  3. 配制并使用1-苯基-2-硫脲（PTU）溶液
    1. 用二甲基亚砜（DMSO）配制100 mM的PTU储备液。
    2. 将PTU储备液置于4°C避光保存。
    3. 在受精后24–36小时（hpf），向每皿含30 mL BEW的培养皿中加入60 µL PTU储备液，使终浓度达到200 µM。
    4. 通过轻轻旋转培养皿5–10次使PTU混合均匀。避免将液体直接吹打在胚胎上，以减少机械刺激。
      ​注意：PTU可能引起呼吸道和皮肤刺激。操作时应佩戴手套，并在通风良好的区域进行配制。
  4. 配制三卡因麻醉剂
    1. 将400 mg三卡因甲磺酸盐溶解于97.9 mL Milli-Q水中。
    2. 向溶液中加入2.1 mL 1 M Tris碱（pH 9）。
    3. 使用0.1 M氢氧化钠或盐酸将溶液pH调节至7.0。
    4. 将溶液分装至已标记的离心管中，于4°C保存。
    5. 将储备液按1:25稀释，获得160 µg/mL的工作浓度；或按1:100稀释，获得40 µg/mL的低剂量应用浓度18。
      ​注意：三卡因甲磺酸盐为化学麻醉剂。操作时应使用适当的个人防护装备。
  5. 进行杂交
    1. 将纯合的Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry)成鱼与AB野生型斑马鱼进行杂交：将一条纯合转基因成鱼与一条相反性别的AB野生型成鱼放入带有隔板的交配缸中过夜。在光照周期开始时移除隔板，并在固定2小时的产卵期后收集胚胎。
  6. 筛选转基因幼鱼
    1. 在受精后3天（dpf），使用终浓度为160 µg/mL的三卡因麻醉幼鱼。
    2. 在荧光体视显微镜下使用mCherry滤光片组（激发光波长约587 nm，发射光波长约610 nm）观察幼鱼。实验中所有幼鱼的筛选参数应保持一致，包括物镜放大倍数、曝光时间、增益和照明强度。
    3. 使用已知阳性的转基因幼鱼设定曝光时间和增益，使多巴胺能神经元的荧光信号清晰可见且无饱和现象，之后在实验中保持这些参数不变。
    4. 确认mCherry阳性信号定位于两眼之间、中线略偏腹侧的间脑腹侧多巴胺能神经元簇中（图1A）。
    5. 将间脑腹侧多巴胺能神经元簇中可清晰检测到mCherry荧光的幼鱼判定为阳性。在固定筛选参数下，若未观察到明显高于背景的mCherry信号，则判定为阴性，非转基因或已知阴性幼鱼作为背景对照。
      注：3 dpf是间脑腹侧多巴胺能神经元产生可用于定量分析的稳定荧光信号的最早发育阶段。

斑马鱼眼睛的荧光显微镜图像；移液器吸头；用于筛选的微孔板布局。
图1：转基因筛选、幼体包埋及微孔板设计。 （A）表达硝基还原酶（NTR）的转基因斑马鱼幼体的荧光图像（mCherry通道，4×物镜），显示位于双眼之间腹侧间脑中的多巴胺能（DA）神经元簇。（B）经修整的P200移液器吸头，切至约1.5 mm开口，用于琼脂糖包埋过程中幼体的转移。（C）高通量药物筛选的典型96孔板布局，包括溶剂对照、甲硝唑（MTZ）处理孔及待筛化合物条件。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 化学遗传消融与荧光成像

  1. 准备琼脂糖包埋介质
    1. 在4 dpf包埋当天，用Milli-Q水配制1.2%低熔点琼脂糖（LMA）。
    2. 将琼脂糖溶液放入微波炉中，以5–10秒的短时间间隔加热，每次加热后轻轻摇匀，直至琼脂糖完全溶解且溶液澄清。避免沸腾溢出或长时间加热，以免因蒸发改变最终琼脂糖浓度。
    3. 将琼脂糖分装至1.5 mL微量离心管中。
    4. 使用前在70°C下融化分装的琼脂糖，并在42°C加热块中平衡。
    5. 向每份琼脂糖分装液中加入20 µL三卡因储备液（4 mg/mL），使工作浓度达到约40 µg/mL。
    6. 使用P200移液器轻轻吹打5–10次，将三卡因混入熔融琼脂糖中。避免涡旋或引入气泡，因为气泡可能干扰幼鱼定位和成像。
  2. 麻醉并包埋幼鱼
    1. 向含有4 dpf幼鱼的培养皿中加入三卡因储备液，使终浓度达到160 µg/mL。
    2. 将幼鱼在三卡因中孵育约5分钟，或直至其自发游泳停止且对探针轻触无反应。仅在达到此麻醉终点后进行包埋操作。
    3. 使用干净剪刀或无菌刀片修剪P200移液器吸头的远端，形成约1.5 mm的开口。使用体视显微镜下的尺子或校准标尺在使用前验证开口尺寸。丢弃边缘粗糙或开口过窄（幼鱼通过时会接触）的吸头（图1B）。
    4. 使用改造后的吸头吸取单个幼鱼，并尽量减少携带液体量。
    5. 将移液器吸头浸入琼脂糖分装液中。
    6. 将含有一个幼鱼的40 µL琼脂糖注入平底96孔板的一个孔中。实验内所有孔使用相同的琼脂糖体积。若使用不同类型的孔板，应在实验开始前优化琼脂糖体积，并在所有孔中保持所选体积。
      ​注意：使用平底孔板以确保成像一致性。根据孔板几何形状优化琼脂糖体积。
  3. 定向并包埋幼鱼
    1. 将孔板置于体视显微镜（解剖显微镜）下。
    2. 使用尖头镊子或0.25 mm探针调整幼鱼方向，使腹侧间脑朝向物镜。
    3. 对于倒置显微镜，将幼鱼背侧朝下放置；对于正置显微镜，则背侧朝上放置。
    4. 在琼脂糖凝固前1–2分钟内完成定向操作。
    5. 根据预定义的96孔板图，每孔包埋一条幼鱼。A行保留用于溶剂对照，H行用于仅MTZ对照，B–G行分配给候选化合物处理条件或剂量反应组。在可能的情况下，随机化B–G行内的化合物排布以减少位置偏差。基线成像和处理后成像使用相同的孔板图。
    6. 琼脂糖凝固后，向每孔加入不含三卡因的BEW，使每孔终体积恰好为200 µL。板内所有孔使用相同的终体积，以保持一致的扩散和处理暴露条件。
  4. 配制MTZ处理溶液
    1. 在补充有1% DMSO和200 µM PTU的BEW中配制MTZ工作液。将MTZ粉末加入溶液中，涡旋至无可见颗粒残留。室温下避光在摇床或管旋转器上混合15–30分钟。使用前确认溶液澄清且无可见沉淀。
    2. 为优化剂量反应，配制3、4.5和9 mM浓度的溶液。
    3. 配制含1% DMSO的溶剂对照液，其中包含BEW和200 µM PTU。
    4. 优化后，仅配制已验证的MTZ浓度用于常规筛选。
      警告：MTZ对光敏感。每次实验均需新鲜配制溶液，使用铝箔避光，不得重复使用剩余溶液。
      ​注意：所有处理组和对照组中保持相同的终DMSO浓度。不得替换其他MTZ配方。
  5. 获取处理前荧光图像
    1. 在4 dpf包埋后，使用配备20×物镜的荧光显微镜获取基线荧光图像（图2）。
    2. 使用mCherry通道（激发波长约587 nm，发射波长约610 nm）对每个孔进行成像。
    3. 实验内所有孔使用相同的成像设置。以溶剂对照幼鱼设定曝光时间、照明强度和探测器增益，使最亮的多巴胺能神经元像素达到探测器动态范围的约70%–80%，且不饱和。记录最终的曝光时间、照明强度、探测器增益、物镜和采集参数，并在所有基线及处理后图像中保持这些设置。
    4. 尽可能在单次成像会话中完成所有图像采集，以最小化不同时间点间光源强度或探测器灵敏度的变异性。对于具有自动载物台控制的系统，使用多点采集功能以在不同成像会话中保持相同坐标。
    5. 保存采集参数，以便在处理后成像（步骤3.7）及后续实验中重复使用。
      ​注意：20×物镜在成像间脑多巴胺能神经元簇时，在视野和分辨率之间提供了良好平衡。
  6. 基线成像后施加MTZ处理
    1. 在4 dpf完成基线成像后，立即向各孔直接加入含MTZ溶液或溶剂溶液，使每孔终体积达到200 µL。
    2. 在化合物筛选实验中，此步骤同时加入候选化合物和MTZ，使幼鱼在相同的24小时处理期内暴露于MTZ ± 化合物。
    3. 将孔板在28.5°C、14小时光照:10小时黑暗循环条件下孵育24小时，从4 dpf至5 dpf。
    4. 孵育期间避免扰动孔板。
      注意：对于剂量反应实验，可评估额外的孵育时间（如12和48小时）以优化处理条件。
      ​暂停点：可在成像前将孔板维持在孵育条件下完成规定的处理时长。
  7. 获取处理后荧光图像
    1. 在5 dpf，使用与4 dpf基线成像相同的显微镜设置（包括曝光时间、照明强度、探测器增益、物镜和采集参数）获取处理后图像（图2）。
    2. 不得在孔之间或处理前与处理后成像会话之间调整曝光时间、探测器增益、照明强度、焦距、物镜或采集设置。
    3. 若两次成像之间显微镜曾关机，成像前需重新加载保存的采集参数，并对照记录的参数验证所有设置。
    4. 尽可能按照基线成像时的相同顺序对孔进行成像，并在同一次成像会话中完成所有处理后图像采集。
    5. 这种配对的处理前与处理后成像设计可控制个体间基线多巴胺能神经元荧光的变异性，确保信号变化归因于处理效应而非采集差异。

不同MTZ剂量对斑马鱼的荧光显微图像，显示不同的细胞反应。
图2：甲硝唑处理后多巴胺能神经元荧光呈剂量依赖性降低。 转基因斑马鱼幼体经不同浓度MTZ处理24小时后，显示间脑多巴胺能神经元的代表性荧光图像（mCherry通道，20倍物镜）。荧光强度随剂量增加而降低，表明NTR表达神经元的化学遗传学消融成功。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 基于微孔板的高通量药物筛选

  1. 生成并筛选转基因幼鱼
    1. 生成新的一批纯合转基因幼鱼。
    2. 收集胚胎并在 BEW 中培养。
    3. 在受精后 24–36 小时（hpf）用 200 µM PTU 处理胚胎，操作方法如步骤 2.3 所述。
    4. 在 3 dpf 时，使用固定的显微镜设置通过 mCherry 通道对实验中所有幼鱼进行筛选。使用已知阳性幼鱼设定曝光时间、检测器增益和照明强度，以清晰检测到多巴胺能神经元荧光且不发生饱和，随后在筛选过程中保持这些设置不变。
    5. 若在腹侧间脑预期的多巴胺能神经元簇中，在固定筛选条件下可见清晰的 mCherry 荧光，则将幼鱼归类为阳性。丢弃在该区域无高于背景信号、或荧光微弱、弥散或异位表达的幼鱼。
  2. 包埋幼鱼并获取基线图像
    1. 在 4 dpf 时，按照步骤 3.2–3.3 所述方法，将幼鱼包埋于 96 孔板中，每孔放置一条幼鱼。
    2. 按照步骤 3.5 所述方法获取处理前的基线荧光图像。
  3. 施加 MTZ 和候选化合物
    1. 在 4 dpf 获取基线荧光图像后，根据板图（图 1C）直接向各孔中加入处理溶液。
    2. 对于溶剂对照孔，加入含有与化合物处理孔相同终浓度 DMSO 的 BEW。
    3. 对于仅含 MTZ 的对照孔，加入不含候选化合物的 MTZ 溶液。
    4. 对于化合物筛选孔，同时加入 MTZ 和候选化合物，使幼鱼在相同的 24 小时处理期内同时暴露于两者。
    5. 在初步筛选中，使用单一化合物浓度（例如 10 µM），除非该化合物的溶解度、毒性或已有剂量-反应数据表明应使用其他浓度。
    6. 将每孔调整至终体积为 200 µL。所有孔（包括溶剂对照、仅 MTZ 对照以及 MTZ 加化合物孔）中保持相同的终浓度 DMSO。
    7. 将板置于 28.5°C 下，按照 14 小时光照 : 10 小时黑暗的循环孵育 24 小时，从 4 dpf 至 5 dpf。
      ​注意：本方案在化合物暴露前不包括 MTZ 的去除或洗脱步骤。候选化合物在基线成像后立即与 MTZ 同时施加。
  4. 获取处理后图像并计算荧光保留率
    1. 在 5 dpf 时，使用与 4 dpf 基线成像相同的采集参数获取处理后的荧光图像。
    2. 尽可能按照基线成像时的相同顺序对各孔进行成像。
    3. 计算每条幼鱼的荧光保留率，公式如下：
      荧光保留率方程；IntDen 比值；显微镜数据分析公式。
    4. 将每条幼鱼的荧光保留率数值归一化至同板溶剂对照组的平均值。
    5. 将荧光保留率显著高于仅 MTZ 对照组的化合物识别为候选保护性化合物。
  5. 确定命中化合物
    1. 将荧光保留率显著高于阴性对照（仅 MTZ）的化合物确定为命中化合物。
    2. 使用 Welch’s t 检验进行统计分析，比较仅 MTZ 对照组与 MTZ 加化合物处理组。
    3. 通过独立的生物学重复实验和剂量-反应分析验证命中化合物。确认命中的标准为：相对于仅 MTZ 对照组，能可重复地提高荧光保留率，p < 0.05，且无可见的幼鱼毒性或异常形态。
    4. 将已验证的命中化合物推进至次级检测，如运动行为分析、剂量-反应验证或独立生物学重复测试。
      注意：对于化合物文库筛选，使用阳性和阴性对照计算每块板的 Z 因子。Z 因子 > 0.5 表示该检测具有较高稳健性，适用于命中化合物的识别。

5. 运动行为评估

  1. 将幼鱼分配至处理组
    1. 在受精后第4天（4 dpf），将每种基因型的幼鱼分配到三个处理组中，每组至少10尾幼鱼：仅BEW处理组、DMSO溶剂对照组和MTZ处理组。
    2. 分组方式如下：（1）仅BEW处理（未处理基线组），（2）1% DMSO溶剂对照组，（3）优化浓度的MTZ处理组（4.5 mM MTZ溶于含200 µM PTU的1% DMSO/BEW中）。
    3. 在相同条件下设置AB野生型幼鱼的溶剂对照组和MTZ处理组。若MTZ仅在Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry)幼鱼中引起运动能力下降，而在AB野生型幼鱼中无此效应，则可确认该效应依赖于NTR表达。
  2. 实施处理并接种幼鱼
    1. 在28.5°C条件下处理幼鱼24小时，处理条件依据步骤5.1.2设定：仅BEW、1% DMSO溶剂对照，或含200 µM PTU的1% DMSO/BEW中添加4.5 mM MTZ。
    2. 使用宽口移液管将5尾幼鱼转移至含有2.5 mL新鲜BEW的6孔板各孔中。尽量减少携带液体体积，并轻柔操作以避免幼鱼应激或损伤。
      ​注意：每孔放置5尾幼鱼可在数据产出与避免过度拥挤之间取得平衡。密度过高会增加运动轨迹交叉，导致行为分析中出现追踪误差。
  3. 设置光照条件
    1. 将6孔板置于具有均匀漫射照明的白色LED光源板上，保持温度在25°C–28°C范围内。同一实验中的所有录像应使用相同的光源板、亮度设置和板位（图3A）。
    2. 使用来自下方和上方的漫射光源同时照明，以减少阴影、眩光和反射。
  4. 配置视频录制系统
    1. 使用稳定支架（如三脚架或臂式支架）将高分辨率相机固定于板正上方，保持垂直俯视角度（图3B）。
    2. 在视野范围内将标尺置于板旁，用于空间校准。
    3. 确保相机镜头垂直于板面，以最小化视差畸变。
  5. 记录运动活动
    1. 在14小时光照：10小时黑暗周期的光照阶段进行录像，以减少昼夜节律变异。
    2. 开始记录前让幼鱼适应环境1小时。
    3. 连续记录60分钟的运动活动。
    4. 记录过程中不得扰动实验装置。
      ​注意：为减少昼夜节律变异，各次实验的录像应在每天相同时间段进行。
  6. 配置行为追踪软件
    1. 将录制的视频导入EthoVision XT行为追踪软件（图3C）。
    2. 设置以下参数：6个区域，每个区域5个个体，中心点检测，距离单位为毫米，时间单位为秒。
    3. 利用视频帧中的标尺进行空间尺度校准。
    4. 为每个孔定义区域边界，确保每个区域完全覆盖孔内区域，且不超出孔边缘。
  7. 优化检测参数
    1. 通过软件界面生成参考图像（检测设置 → 参考图像 → 开始学习）。
    2. 调整检测阈值，确保准确追踪所有幼鱼，避免误检。
    3. 运行一次短时测试采集（约2分钟）。
    4. 在进入完整分析前，目视检查追踪路径。确认所有幼鱼均被正确识别，且气泡、碎片、反光或孔边缘未被误判为幼鱼。
      ​注意：常见伪影包括因区域设置过大导致的边缘追踪、由气泡或碎片引起的误检，以及长时间静止导致的追踪丢失。
    5. 若某孔出现持续追踪失败、轨迹交叉严重、可见碎片或气泡、幼鱼死亡、形态异常或幼鱼卡在孔边缘等情况，致使无法可靠量化，则应将其排除在分析之外。
    6. 在统计分析前，对所有处理组应用相同的排除标准。
  8. 执行完整分析并导出数据
    1. 运行完整数据采集。
    2. 生成轨迹可视化图和热图（分析 → 结果 → 轨迹与热图）。
    3. 导出包含每个个体指标的原始数据表格，包括总移动距离（mm）、平均速度（mm/s）和运动事件次数。
    4. 将60分钟内的总移动距离作为主要的运动行为终点指标（图3D）。

斑马鱼幼鱼运动行为记录装置，包含视频采集、行为追踪软件及数据分析。
图3：运动行为记录装置及分析流程。（A）实验装置示意图，显示一个6孔板，其中含有斑马鱼幼鱼，置于光源板上，配有标尺用于空间校准，并配有温控加热装置以维持实验条件。（B）视频采集装置，使用俯视摄像头记录幼鱼运动，并展示代表性追踪轨迹叠加图像。（C）使用EthoVision XT（行为追踪软件）进行行为追踪，显示对幼鱼运动的自动识别与追踪。（D）工作流程概要，概述从视频采集到运动行为定量分析的各个步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 数据分析

  1. 准备图像以进行分析
    1. 在 Fiji（ImageJ，图像分析软件）中打开治疗前和治疗后的图像配对。
    2. 如果图像是以 Z 轴层叠（Z-stacks）方式获取的，请生成最大强度投影（Image → Stacks → Z Project → Max Intensity）。
    3. 对同一数据集中的所有图像使用相同的固定显示设置调整亮度/对比度。定量测量时不得使用自动缩放，并在原始未调整的图像上进行荧光定量。
  2. 定义感兴趣区域（ROI）
    1. 使用多边形选择工具在治疗前图像中围绕间脑多巴胺能（DA）神经元簇绘制感兴趣区域（ROI）。根据荧光图像中可见的解剖标志定义 ROI 边界，包括眼睛的内侧边缘和间脑的腹侧中线（图 2）。确保 ROI 完全覆盖整个 DA 神经元簇，且不延伸至邻近的荧光结构。为保证不同操作者之间的一致性，保存一个具有代表性的 ROI 模板，并将其分发给所有团队成员作为空间参考。
    2. 按“t”键将 ROI 添加到 ROI 管理器中。
    3. 在应用 ROI 前，使用解剖标志（包括眼睛和腹侧间脑）对治疗前和治疗后图像进行对齐。仅在确认对齐后，将相同的 ROI 应用于匹配的治疗后图像。
    4. 保存每个孔板的所有 ROI，以便实现结果的可重复性和重新分析。
  3. 量化荧光强度
    1. 配置测量设置（Analyze → Set Measurements），并选择“Area”和“Mean gray value”。
    2. 对每幅图像进行测量（Analyze → Measure）。
    3. 从同一图像内的相邻非神经元区域测量背景荧光，并将其从 DA 神经元 ROI 的测量值中扣除。背景校正后的积分密度计算公式为：校正后 IntDen = IntDenROI − (areaROI × 平均背景值)。
    4. 计算每条幼虫的荧光保留率：IntDen(治疗后) / IntDen(治疗前)。
    5. 将荧光保留率归一化至同板溶剂对照组的平均值。在比较处理组之前，需为每块板单独计算溶剂对照组的均值19。
      ​注意：对于更高通量的分析，可使用 CellProfiler（图像分析软件）结合自动 ROI 检测执行相同的定量分析20。
  4. 进行成对统计分析
    1. 在比较一个处理组与一个对照组时，采用非配对双尾 Welch t 检验，该检验不假设组间方差相等。
    2. 当各组间方差不同时，使用此检验方法。
  5. 进行多组统计分析
    1. 对于涉及多个处理组的实验，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。
    2. 使用 GraphPad Prism 或等效统计软件进行 Dunnett 事后检验，以将每个处理组与对照组进行比较。
  6. 报告统计结果
    1. 将显著性阈值设定为 α = 0.05。
    2. 报告精确的 p 值，而非分类阈值。
    3. 使用 GraphPad Prism 或等效绘图软件，以均值 ± 均值标准误（SEM）表示数据，并将单个数据点以散点图形式叠加显示。
    4. 在图注中报告样本量（n）、统计检验方法、检验统计量、自由度和精确 p 值。对于大型数据集，将完整的统计输出结果列入补充表格中。
      注意：对于筛选实验，计算每块板的 Z 因子，公式为 Z = 1 − [3(σp + σn)/|µp − µn|]，其中 σp 和 µp 分别为溶剂对照组的标准差和均值，σn 和 µn 分别为仅含 MTZ 对照组的标准差和均值。Z 因子 > 0.5 被认为适用于筛选实验。

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结果

MTZ 处理导致剂量依赖性的多巴胺能神经元丢失和运动功能障碍

为了确定MTZ介导的多巴胺能（DA）神经元消融的最佳参数，在24小时处理后，评估了3、4.5和9 mM MTZ浓度下DA神经元存活的替代指标——荧光强度以及运动距离。每个处理组包含n = 10条独立的Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry)幼鱼，并设有匹配的溶剂对照组（含1% DMSO的BEW溶液，加入200 µM PTU，n = 10）。所有幼鱼均来自经验证的纯合亲本产生的单次产卵后代。与溶剂处理对照组相比，MTZ处理导致DA神经元荧光强度呈剂量依赖性降低，代表性荧光图像（图2）和荧光定量结果（图4B）均显示了这一趋势。行为学分析表明，MTZ处理后幼鱼总运动距离也呈剂量依赖性减少（图4A）。线性回归分析进一步显示，各处理组中荧光保留水平与运动输出之间具有良好的一致性（

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讨论

本方案提供了一种可扩展的体内流程，利用转基因斑马鱼中的NTR–MTZ化学遗传系统，定量多巴胺能神经元的丢失并筛选神经保护化合物。该标准化的基于孔板的操作流程专为本科生研究团队设计，适用于操作人员流动性高且研究人员经验在不同学期间差异较大的情况。流程的每一步均以可重复性和易于培训为优先考虑，确保多名使用者在操作中保持高度一致性且变异最小。本方案通过将治疗前后的成对多巴胺能神经元成像与基于孔板的行为学分析相结合，构建了标准化的工作流程，从而在同一可扩展筛选平台上实现神经元结构损失测量与功能运动结果的比较，推动了现有斑马鱼神经退行性变研究方法的发展。采用此流程，一个96孔板可在4 dpf时包埋并完成基线成像，经24小时处理后，于5 dpf时再次成像。通常，每块板的包埋耗时约1小时，每次成像会话的荧光成像时间约为每板1小时（具体取决于显微镜设置），图像采集完成后，每板的半自动荧光分析约需3小时。

行为检测每孔使用五条幼虫，以提高通量，同时为每次记录保留相对较大的游泳区域。在此模式下，总移动距离可作为比较不同处理条件的可靠群体水平运动终点指标。由于同一孔中存在多条幼虫，可能会出现短暂的路径交...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

感谢加州大学旧金山分校的苏果博士提供转基因斑马鱼，感谢加州大学欧文分校的Daeseok Eom博士、Michael Parsons博士和Eddie Hallo提供野生型胚胎以及在斑马鱼饲养和鱼类设施维护方面的指导。同时感谢加州大学欧文分校Robert A. Mah分子创新中心和Falling Leaves创新大楼的工作人员为水生设施提供的基础设施支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
成年斑马鱼饲料，0.5 mm 颗粒ZeiglerAH271用于常规饲养期间喂养成年斑马鱼
低熔点琼脂糖（LMA）Sigma-AldrichA9414-10G用于将幼鱼包埋于孔板中，以便成像时稳定定位
铝箔ULINES-20197用于在制备和孵育过程中保护对光敏感的试剂（如 MTZ）
CellProfilerBroad InstituteRRID: SCR_007358用于可选的自动化荧光图像分析
锥形管，15 mLCorning352097用于试剂制备和样品处理
锥形管，50 mLCorning352070用于试剂制备和溶液储存
交配缸（1.0 L）AquaneeringZHCT100用于控制斑马鱼繁殖和胚胎收集
Danio rerio（AB 野生型）——非转基因对照品系，用于验证硝基还原酶依赖性效应的特异性
Danio rerio（Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry)）——转基因斑马鱼品系，在多巴胺能神经元中表达硝基还原酶-mCherry，用于靶向化学遗传消融
二甲基亚砜（DMSO），无水（≥99.9%）Sigma-Aldrich472301-500ML用作 PTU、MTZ 和筛选化合物的溶剂
EthoVision XTNoldusRRID: SCR_000441行为追踪软件，用于量化幼鱼运动
Fiji（ImageJ）NIHRRID: SCR_003070图像分析软件，用于荧光定量分析
细尖镊子或 0.25 mm 探针World Precision InstrumentsWPI0118用于琼脂糖包埋过程中调整幼鱼方向
荧光显微镜Zeiss11845460通过 mCherry 荧光成像多巴胺能神经元
Gemma Micro 150 ZF（幼鱼饲料，100–200 μm）Skretting10818945用于喂养幼年斑马鱼
Gemma Micro 75 ZF（幼体饲料，50–100 μm）Skretting10818935用于喂养斑马鱼幼体
GraphPad PrismGraphPadRRID: SCR_002798统计分析软件，用于数据分析和绘图
加热块（可达到 42°C 和 70°C）Thermo Fisher88870001用于熔化并维持琼脂糖在受控温度下
高分辨率相机（支持俯视安装）Basler88-327用于记录幼鱼运动活动
盐酸（HCl），0.1 MFisher ScientificSA48-500用于三卡因溶液制备过程中的 pH 调节
培养箱（28.5°C，14 小时光照:10 小时黑暗光周期）MilliporeZ763314维持斑马鱼发育所需的受控环境条件
Instant Ocean 海盐Instant OceanSS15-10用于制备蓝色养卵水（BEW）
漫射光片（或等效材料）Edmund Optics27-103用于提供均匀照明，并在行为记录期间最小化反光
光源板LightcraftLC2004LED在运动追踪期间提供底部照明
甲硝唑（MTZ）Sigma-AldrichM3761-100G用于多巴胺能神经元的化学遗传消融
亚甲蓝，1% 水溶液Sigma-AldrichM9140添加至 BEW 中以防止胚胎微生物生长
微量离心管，1.5 mLEppendorf22363204用于试剂分装和储存
移液器，P200GilsonFP10005S用于处理幼鱼和配制溶液
培养皿，100 mmCorningCLS430167用于胚胎收集和孵育
移液器吸头，200 μLRAININ30389188与移液器配合使用，用于液体操作和幼鱼转移
氯化钠（NaCl），≥99.0%Sigma-AldrichS9888-500G用于缓冲液和水溶液的配制
氢氧化钠（NaOH），0.1 MFisher ScientificSS256-500用于三卡因溶液制备过程中的 pH 调节
体视显微镜NikonSMZ-745用于包埋过程中幼鱼的操作和定向
温控加热垫（25°C–28°C）VivosunV-SHMDT在行为记录期间维持稳定温度
三卡因甲磺酸盐（MS-222）Sigma-AldrichE10521-10G用作斑马鱼幼体的麻醉剂
Tris 碱Fisher ScientificBP152-1用于配制缓冲型三卡因溶液
水纯化系统MilliporeZIQ7003T0用于生成去离子水以配制溶液
斑马鱼饲养缸AquaneeringZS560用于维持成年斑马鱼种群
1-苯基-2-硫脲（PTU）Sigma-AldrichP7629-10G用于抑制黑色素生成，保持光学透明性
6 孔板，平底Corning07-200-83用于运动行为检测
96 孔板，平底Greiner Bio-One655096用于高通量成像和筛选检测

参考文献

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