本方案旨在利用网络药理学、分子对接和分子动力学模拟，探讨QUF3改善多囊卵巢综合征（PCOS）子宫内膜容受性的机制。
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研究文章
瞿氏方3号改善多囊卵巢综合征子宫内膜容受性的作用机制：网络药理学与分子动力学模拟相结合的研究
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
子宫内膜容受性受损是多囊卵巢综合征（PCOS）不孕的主要原因之一。Qu's Formula 3（QUF3）是一种临床用于改善PCOS患者子宫内膜容受性的中药复方制剂。本研究采用网络药理学、分子对接及分子动力学（MD）模拟等方法，探究其潜在作用机制。通过TCMSP数据库筛选QUF3的活性成分，并从DrugBank等资源中获取与子宫内膜容受性及PCOS相关的潜在靶点。利用Cytoscape构建化合物-靶点相互作用网络及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，以识别关键靶点。对核心靶点进行GO和KEGG富集分析。采用分子对接、MD模拟、主成分分析（PCA）、自由能景观（FEL）及动态交叉相关矩阵（DCCM）评估配体与靶点之间的结合特性。共筛选出91种活性成分和294个潜在药物靶点，从中鉴定出60个与疾病相关的靶点。木犀草素（luteolin）和芝麻素（sesamin）为关键的药效成分。共识别出10个核心靶点：AKT1、EGFR、TNF、TP53、IL6、BCL2、ESR1、IL1B、STAT3和MMP9。KEGG富集分析揭示了132条信号通路，GO分析获得678个条目。MD模拟结果表明，前五种活性成分与其对应靶点之间的结合状态稳定。PCA、FEL和DCCM进一步证实这些复合物具有较高的热力学稳定性与结构刚性。综上所述，QUF3通过多成分、多靶点、多通路的协同作用改善PCOS患者的子宫内膜容受性。本研究从计算模拟的角度为开发针对PCOS相关不孕的靶向中药疗法提供了理论依据，未来可能对改善PCOS女性的妊娠结局具有积极意义。
引言
多囊卵巢综合征（PCOS）是女性中最常见的内分泌紊乱疾病之一1。其主要特征包括慢性持续性排卵功能障碍、临床或生化水平的高雄激素血症以及多囊卵巢形态，临床表现如闭经、不孕、多毛、痤疮和肥胖等。近年来，促排卵技术和辅助生殖技术（ART）的进步显著提高了PCOS患者的妊娠率；然而，其妊娠结局仍差于健康女性2,3。子宫内膜容受性是影响ART结局的关键因素4。子宫内膜容受性是指子宫内膜在特定生理阶段接受胚胎的能力，在胚胎着床及其后续发育过程中起决定性作用5,6。PCOS中常见的病理状态，如肥胖、胰岛素抵抗和慢性炎症，可损害子宫内膜容受性，阻碍受精卵着床和胚胎发育，最终导致不孕和流产7,8。然而，PCOS中子宫内膜容受性的调控机制仍不明确，各种影响因素之间的相互作用网络尚未阐明。Qu氏方3号（QUF3）是一种临床上用于改善PCOS患者子宫内膜容受性的中药复方，其理论依据源于中医妇科学中坚实的古典理论。该方由白芍（Paeoniae Radix Alba）、熟地黄（Rehmanniae Radix Praeparata）、菟丝子（Cuscutae Semen）、女贞子（Fructus Ligustri Lucidi）、桑寄生（Herba Taxilli）、丹参（Radix Salviae）和山茱萸（Cornus Officinalis Sieb. et Zucc.）按2:4:3:4:3:2:2的比例组成，采用乙醇回流提取法制备。QUF3通过多味药材协同作用，具有补肾填精、养血活血的功效9。其在改善PCOS患者子宫内膜容受性方面的临床疗效已得到充分验证，但其核心药理机制仍有待进一步研究。
网络药理学是一种基于系统生物学的分析方法，通过构建多层次的“中药-成分-靶点-疾病”网络，从整体角度揭示药物对疾病网络的干预作用。与传统的“单药-单靶点”模式不同，网络药理学能够全面捕捉药物的协同作用特征 "多组分、多靶点、多通路" TCM方剂作用的特点使其特别适用于研究中医药的复杂作用机制。相比之下，分子动力学（MD）模拟是一种基于牛顿力学的计算技术，可在原子水平上模拟蛋白质-配体复合物随时间推移发生的构象变化和动态行为。与静态的分子对接相比，MD模拟能够评估结合稳定性、自由能景观和结构刚性等动态参数，从而更真实地评价药物分子与靶标蛋白之间的相互作用。网络药理学适用于对TCM方剂潜在靶点和通路进行全局筛选，而MD模拟则可动态评估关键成分与靶标蛋白之间的结合稳定性。结合这两种方法，能够更可靠地分析TCM方剂多成分、多靶点协同作用的机制。基于上述思路，本研究采用网络药理学与MD模拟相结合的方法，系统探讨QUF3改善多囊卵巢综合征（PCOS）患者子宫内膜容受性的潜在药理机制。
该整合的计算工作流程最适合用于探索中药方剂或天然产物的多组分、多靶点作用机制，尤其适用于活性成分和作用靶点尚不明确的复杂体系。使用者应具备基本的生物信息学知识，包括数据库检索和网络分析，以及使用常见软件包进行分子对接和分子动力学模拟等基础计算生物学分析的能力。建议使用基于 Linux 的计算环境，内存至少 16 GB，并能够访问相关公共数据库，如中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、PubChem 和 UniProt。本工作流程中使用的所有软件（例如 Cytoscape、AutoDockTools、GROMACS）均为开源或学术免费使用，读者可从材料表中提供的信息获取这些软件。
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方案
QUF3 活性成分及潜在靶点的筛选
于2025年4月1日，采用TCMSP数据库对QUF3药物中的白芍、熟地黄、菟丝子、女贞子、桑寄生、丹参和山茱萸所含的活性化学成分进行鉴定10。根据口服生物利用度（OB）≥30% 和类药性（DL）≥0.18 的条件，对活性成分进行初步筛选11。选择这些阈值作为标准经验准则，以确保成分具有足够的吸收能力和类药性质。在PubChem数据库中检索各化合物的标准SMILES序列，并利用所得序列在Swiss Target Prediction在线数据库中预测化合物作用靶点，随后从UniProt数据库中收集靶点蛋白对应的基因名称及UniProt ID12,13,14。作为中间质控步骤，记录去重后获得的唯一靶点数量。
多囊卵巢综合征子宫内膜容受性作用靶点的鉴定
使用“多囊卵巢综合征”和“子宫内膜容受性”作为检索词，在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM）、DrugBank、治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database, TTD）和 GeneCards 数据库中进行检索，以鉴定潜在靶点15,16,17,18。对于 GeneCards 数据库，仅保留相关性评分 >5 的靶点；对于其他数据库，则纳入所有检索到的靶点。经合并并去除重复条目后，记录唯一的疾病相关靶点数量作为中间输出结果。
组分与靶点的网络构建
通过将QUF3、多囊卵巢综合征（PCOS）及子宫内膜容受性的潜在靶点输入在线韦恩图工具，获得交集靶点。这些交集靶点被视为QUF3改善PCOS患者子宫内膜容受性作用的关键靶点。随后，利用Cytoscape19将这些交集靶点与QUF3的活性成分-靶点数据进行匹配，构建“药材-成分-靶点”（H-C-T）网络，并使用“Network Analyzer”工具对该网络进行可视化展示。
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建
将QUF3在多囊卵巢综合征（PCOS）中改善子宫内膜容受性的潜在靶基因作为输入提交至STRING数据库平台20。物种设定为“Homo sapiens”，置信度阈值设定为“中等置信度（0.4）”，获得一个蛋白质-蛋白质相互作用数据的TSV文件。该文件随后被导入网络分析软件，用于构建和分析PPI网络21。网络中节点的重要性由“Degree”值表示：Degree值越高，表明该节点越重要。随后，根据Degree值对主要活性成分进行排序，并依据Degree排名筛选出前10个核心靶点。
基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书通路富集（KEGG）分析
采用DAVID数据库进行GO和KEGG通路富集分析，以探讨QUF3改善多囊卵巢综合征（PCOS）子宫内膜容受性的生物学通路与作用机制22。物种设定为“Homo sapiens”，显著性阈值设定为 P < 0.05。GO分析涵盖生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）三个方面23。结果按富集靶点数量排序，排除与人类代谢及疾病相关的通路后，选取前20条KEGG通路进行可视化展示。随后，利用网络分析软件构建“组分-疾病-KEGG通路”多维网络。
分子对接分析
采用 AutoDockTools 和 PyMOL 软件对前 10 种关键活性成分和前 10 个核心靶点进行分子对接分析24,25。关键靶点的 PDB 文件从蛋白质结构数据库下载26，主要活性成分的 SDF 文件从化学数据库获取27。随后使用分子对接软件对蛋白分子进行预处理，包括去盐、加氢和电荷计算。采用覆盖整个蛋白结合位点的网格盒进行半柔性对接。当结合能为负值且最佳构象的均方根偏差（RMSD）≤ 2.0 Å 时，判定对接成功。对接完成后，利用分子可视化软件展示 QUF3 主要活性成分与核心靶点的对接结果。
分子动力学（MD）模拟
采用 GROMACS 软件对蛋白-配体复合物进行分子动力学（MD）模拟，以探究受体与配体之间的相互作用28,29。分别使用 amber99sb-ildn 力场和通用 Amber 力场（GAFF）生成蛋白质和配体的参数及拓扑结构。设定模拟盒子的尺寸，使得每个蛋白质原子与盒子边缘的距离均大于 1.0 nm。采用单点电荷模型（SPC216 水分子）在盒子中显式填充溶剂，并用 Na⁺ 和 Cl⁻ 反离子替换部分水分子，使模拟体系呈电中性。通过最陡下降法对整个体系进行优化，以消除不合理的接触或原子重叠。通过分别在 300 K 和 1 bar 条件下进行各 100 ps 的 NVT 和 NPT 系综预平衡，实现模拟体系的充分平衡。随后，在周期性边界条件下进行 100 ns 的 MD 模拟，温度（300 K）和压力（1 bar）分别通过 V-rescale 和 Parrinello-Rahman 方法控制30。使用步长为 2 fs 的蛙跳积分器（leapfrog integrator）求解牛顿运动方程。长程静电相互作用采用粒子网格埃瓦尔德（Particle Mesh Ewald, PME）方法计算，傅里叶间距设为 0.16 nm，所有键长约束采用 LINCS 方法处理。使用 VMD 软件对轨迹进行可视化、分析和动画呈现31。各化合物的结合自由能通过结合自由能计算脚本进行计算。
主成分分析（PCA）、自由能景观（FEL）和动态交叉相关矩阵（DCCM）分析
采用分子动力学模拟软件进行主成分分析（PCA），以解析无配体状态及配体结合状态下复合物的优势构象运动。通过计算Cα原子涨落的协方差矩阵，获得特征向量（集体运动模式）和特征值（运动幅度）。32通过该分析确定了与配体结合相关的关键动态区域和结构柔性。使用 gmx anaeig 工具将分子轨迹投影到前两个主成分（PC1 和 PC2）上，从而捕捉到关键的运动模式33仅使用最后100纳秒的平衡阶段（RMSD稳定相）进行主成分分析（PCA）和自由能景观（FEL）计算。FEL通过gmx sham工具基于PCA数据计算吉布斯自由能得到。34，揭示了反映构象多样性及状态转变的稳定构象和能量极小值。对Cα原子进行动态交叉相关矩阵（DCCM）分析，以评估结构动力学特征及残基间的运动耦合35该分析阐明了蛋白质-配体复合物的稳定性、分子间相互作用以及集体运动行为。残基 i 与残基 j 之间的交叉相关系数 Cij 计算公式如下：
在该公式中，字母 i 和 j 代表两个残基的 Cα 原子。当 Cij 值为正且大于零时，表示这两个原子朝相同方向运动，被视为具有正相关运动；当 Cij 值为负且小于零时，表示这两个原子朝相反方向运动，被视为具有负相关运动。Cij 值为零则表明两个原子的运动之间无关联。此外，Cij 值大于 0.7 被解释为强正相关（正值）或强负相关（负值）运动。为验证收敛性，对 RMSD 和 Rg 变化曲线进行了检查，稳定的曲线表明最后 100 ns 的模拟时间足以用于 DCCM 分析。这些运动模式揭示了配体结合如何调控分子内的信号传递以及结构域的重排。为确保动力学稳定性和收敛性，仅分析了平衡后轨迹的最后 100 ns，并通过可视化相关性图谱来突出显示具有显著动态相互作用的区域。
为了更好地解释蛋白质与配体之间的相互作用能，采用结合自由能计算脚本，计算了所有蛋白质-配体复合物在平衡状态下的结合能。在应用结合自由能计算方法36时，总结合能被分解为四个独立部分：静电相互作用、范德华相互作用、极性溶剂化作用和非极性溶剂化相互作用。非极性溶剂化项通常称为SASA。
靶点与通路筛选的最终程序性终点
在工作流程结束时，根据以下标准筛选最终经过验证的靶点和通路：在蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中 Degree 值排名前 10 的核心靶点，以及在 H-C-T 网络中 Degree 值排名前 10 的关键活性成分。对于 KEGG 通路，在排除与人类代谢和疾病相关的通路后，根据富集靶点的数量对排名前 20 的通路进行排序并予以选择。分子动力学（MD）模拟结果用于确认关键成分与核心靶点之间是否存在稳定的结合。上述步骤共同确定了本方案的最终输出结果。
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结果
QUF3 活性成分及潜在靶点的筛选
以口服生物利用度（OB）≥ 30% 和药物相似性（DL）≥ 0.18 作为筛选标准，通过检索 TCMSP 数据库，共筛选出 QUF3 的 126 个化学成分。其中，白芍（Baishao）含有 13 种活性成分，熟地黄（Shudihuang）含有 2 种，菟丝子（Tusizi）含有 13 种，女贞子（Nvzhenzi）含有 13 种，桑寄生（Sangjisheng）含有 2 种，丹参（Danshen）含有 65 种，山茱萸（Shanzhuyu）含有 20 种（见补充表 1）。将这 126 个化学成分输入 Swiss Target Prediction 在线数据库，经去重后共获得 91 个化学成分和 284 个靶点。
多囊卵巢综合征中子宫内膜容受性的靶点
通过检索 DrugBank、GeneCards、TTD 和 OMIM 数据库，共鉴定出 2847 个疾病相关靶点。其中，多囊卵巢综合征相关靶点 1800 个，子宫内膜容受性相关靶点 ...
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讨论
越来越多的证据表明，多囊卵巢综合征（PCOS）患者的子宫内膜功能存在缺陷，这可能与较高的胚胎着床失败率和不良妊娠结局相关40。PCOS女性在着床窗口期（WOI）的子宫内膜差异主要表现为着床小体、核仁通道系统、雌激素受体和孕激素受体的表达降低41。此外，同源框基因A10（HOXA-10）、同源框基因A11（HOXA-11）、整合素αVβ3（αvβ3）以及白血病抑制因子（LIF）等子宫内膜标志物的表达也有所下降，这可能导致PCOS女性的不孕42,43,44。肌醇（MYO）是一种与PCOS相关的新型子宫内膜标志物。作为一种胰岛素增敏剂，MYO参与胰岛素信号转导，并激活腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK），从而抑制PCOS女性子宫内膜中AMPK水平的下降45,46...
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披露
本文稿的提交不存在利益冲突，且所有作者均已批准该文稿发表。
致谢
作者声明本研究无其他致谢事项。
基金支持：中国浙江省自然科学基金（编号 LZ26H270001，授予 F.Q.）；国家自然科学基金（编号 82575119，授予 F.Q.）；中国浙江省卫生健康委员会卫生健康高层次人才培养项目（资助编号 [2021] 40，授予 F.Q.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 传统中药系统药理学数据库与分析平台（版本 2.3） | 系统药理学实验室 | https://www.tcmsp-e.com/load_intro.php?id=43 | 活性成分筛选数据库 |
| Swiss Target Prediction 在线数据库（2019 版本） | 洛桑大学分子建模组 &和SIB瑞士生物信息学研究所 | http://www.swisstargetprediction.ch/ | 在线靶标预测数据库 |
| PubChem数据库 | 美国国立卫生研究院国家医学图书馆 | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ | 用于化合物 SMILES/SDF 检索的化学数据库 |
| UniProt 数据库 | 美国国立卫生研究院 | https://www.uniprot.org/uniprotkb | UniProt ID 和基因名称的蛋白质数据库 |
| 在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM） | 约翰斯·霍普金斯大学 | https://www.omim.org/ | 疾病靶点数据库 |
| DrugBank | 阿尔伯塔大学 | https://www.drugbank.ca/ | 疾病靶点数据库 |
| 治疗靶点数据库（TTD） | 浙江大学 | https://ttd.idrblab.cn/ | 疾病靶点数据库 |
| GeneCards（版本 5.26） | 魏茨曼科学研究所，LifeMap 科学公司 | https://www.genecards.org/ | 疾病靶点数据库（相关性评分） >5) |
| Venny 可视化平台（版本 2.1.0） | 国家生物技术中心í（西班牙国家研究委员会-生物分子与细胞生物学中心） | https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ | 用于交集靶点可视化的在线维恩图工具 |
| Cytoscape（版本 3.10.3） | 国家网络生物学资源中心，美国国家人类基因组研究所 | https://cytoscape.org/ | 用于H-C-T、PPI及通路网络的网络分析与可视化软件 |
| STRING数据库（版本12.0） | STRING 联盟 | https://string-db.org/ | 用于PPI网络构建的蛋白质-蛋白质相互作用数据库 |
| DAVID 数据库（版本 v2025-2） | 美国卫生部 &卫生与公共服务部，美国国立卫生研究院 | https://davidbioinformatics.nih.gov/ | GO与KEGG基因富集分析数据库 |
| AutoDockTools（版本 1.5.7） | 斯克里普斯研究所 | https://autodock.scripps.edu/ | 用于预处理和计算的分子对接软件 |
| PyMOL 软件（版本 3.0.3） | 施ödinger | https://pymol.org/ | 用于对接可视化分析的分子可视化软件 |
| 蛋白质数据库（PDB） | RCSB | https://www.rcsb.org/ | 用于下载目标 PDB 文件的蛋白质结构数据库 |
| GROMACS（版本 2023.2） | GROMACS 开发团队 | https://www.gromacs.org/ | 分子动力学模拟软件 |
| VMD（版本 1.9.3） | 伊利诺伊大学 | https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/ | 分子可视化与轨迹分析软件 |
| gmx_MMPBSA | 开源（GitHub） | https://github.com/Valdes-Tresanco-MS/gmx_MMPBSA | 基于分子动力学轨迹的结合自由能计算工具 |
| 科学数据银行 | 中国科学院计算机网络信息中心 | https://www.scidb.cn/ | 用于数据可用性和存储的科学数据存储库 |