适用于患者来源的骨髓和外周血单个核细胞的集落形成单位检测

摘要

本方案概述了一种诱导来源于患者骨髓和外周血单个核细胞的人类造血干细胞和祖细胞分化的实验流程。该检测采用支持红系和髓系谱系定向的半固体培养基，并结合标准化的定量指标，对集落进行可重复的分类，用于临床前药物表征。

摘要

集落形成单位（CFU）检测是研究血液系统疾病（包括骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML））的一项基础性技术。该检测利用添加了特定细胞因子组合的半固体培养基，支持红系和髓系祖细胞的三维生长及谱系特异性分化。然而，来源于患者的外周血和骨髓样本在实验操作中存在技术挑战，表现为细胞活力降低、对操作处理更为敏感，以及集落生长的变异性较大。此外，现有针对集落识别与计数的指导原则在集落大小和谱系类型的定义上存在显著差异，限制了不同研究之间的可重复性。本文所述方案针对来自MDS和AML患者样本的造血干细胞和祖细胞的生长与分化进行了优化，强调轻柔的细胞操作、患者样本的无菌处理、优化的培养条件以及根据患者来源细胞特性调整的培养时间。本方案为使用患者来源样本进行CFU检测提供了实用的操作框架，并建立了统一的标准化指标，以实现血液系统恶性肿瘤研究中集落计数与分析的一致性。

引言

造血是一个受到严密调控的过程，其中定位于骨髓微环境中的造血干细胞（HSCs）可分化产生所有成熟的血细胞谱系。通过一系列层级性的分化事件，HSCs 生成多能祖细胞，这些祖细胞逐步定向分化为红系、髓系和淋巴系谱系，最终成熟为具有功能的循环血细胞。该过程受到骨髓微环境内协调的信号通路以及细胞内在的转录和表观遗传调控机制的共同调控。这些调控通路的异常，尤其是 HSCs 中遗传或体细胞突变的累积，可能破坏正常的分化过程，导致异常祖细胞的克隆性扩增。此类改变最终可能导致以无效造血和血细胞减少为特征的血液系统疾病，包括骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）^{1，2，3，4，5}。

集落形成单位（CFU）实验是一种成熟可靠的 体外 评估造血干细胞和祖细胞（HSPCs）分化潜能的技术。最初开发为一种短期检测方法，用于测量造血祖细胞的增殖能力和分化潜能^6,7,8，CFU实验自此成为临床和实验血液学中广泛使用的一种工具⁹在临床前实验室环境中，该检测常用于评估基因扰动或候选治疗手段对造血分化的影响。在骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）研究中，集落形成单位（CFU）检测可提供功能性读出，用于理解分子和遗传改变如何影响患者来源的骨髓或外周血细胞的分化能力。

CFU 实验包括在添加了特定生长因子的甲基纤维素半固体培养基中培养造血干细胞和祖细胞（HSPCs），这些生长因子可支持谱系特异性的扩增与分化。在此条件下，祖细胞增殖并形成独立的细胞集落，可根据形态学特征按谱系身份进行分类。本实验方案采用一种 commercially available 的、针对红系和髓系分化优化的甲基纤维素半固体培养基。该培养基含有多种细胞因子，包括白细胞介素-3（IL-3）、白细胞介素-6（IL-6）、干细胞因子（SCF）、促红细胞生成素（EPO）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。这些因子共同支持红系祖细胞（如红系集落形成单位 CFU-E 和红系爆式集落形成单位 BFU-E）、髓系粒细胞-巨噬细胞祖细胞（CFU-GM）以及多能祖细胞（如粒细胞、红细胞、单核细胞、巨核细胞祖细胞 CFU-GEMM）的生长^10,11。

尽管上述半固体培养基具有广泛的适用性，但其在分化能力方面存在局限，因为它不能充分支持巨核细胞和血小板的分化。对于这些应用，含有血小板生长因子的更专业化培养基更为合适；然而，这些内容超出了本方案所述的范围。总体而言，通过仔细选择培养基配方，并结合形态学评估以及流式细胞术等后续分析，研究人员可有效通过谱系定向和分化潜能的分析来评估药物敏感性¹²。

本研究采用集落形成单位（CFU）实验，评估联合疗法在治疗复发/难治性高危骨髓增生异常综合征（MDS）中的治疗潜力。乙胺嘧啶是一种临床批准的抗叶酸药物，用于治疗 弓形虫病 和寄生性疟疾，近年来也被研究作为抗肿瘤药物^13,14,15。最近的研究表明，乙胺嘧啶的治疗作用可能通过抑制从头嘧啶合成的关键通路实现¹⁶。在本实验方案中，采用CFU实验评估乙胺嘧啶作为单药治疗以及与目前用于MDS和急性髓系白血病（AML）治疗的一线药物维奈托克（Venetoclax）联合治疗的临床疗效^17,18。

尽管CFU实验具有广泛应用性，但仍存在若干技术局限性。菌落的鉴定与分类在很大程度上依赖于形态学标准，这可能导致不同观察者之间以及不同研究中心之间的结果变异^6,19,20,21。此外，来自骨髓增生异常综合征（MDS）或急性髓系白血病（AML）患者的样本通常表现出细胞活力降低、脆性增加以及细胞异质性，这些因素可能影响菌落形成及后续分析⁹。因此，在对菌落进行进一步表征（包括流式细胞术分析）时，可能需要谨慎操作以维持细胞完整性。目前尚缺乏针对菌落识别、计数及下游分析的标准化操作流程，这也进一步导致了不同研究之间的结果差异。上述技术问题凸显了建立专门针对患者来源造血样本的标准化操作流程的必要性。

本方案概述了一种优化的流程，用于对来自血液系统恶性肿瘤患者原代骨髓或外周血标本的单个核细胞进行集落形成单位（CFU）检测。该方法侧重于处理来源于患者的敏感细胞、建立可靠的培养条件，以及实施一致的集落识别与定量标准等实用策略。通过提供详细的实验方法指导，并强调可重复的分析实践，本方案旨在促进在骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）的临床前研究中，对造血分化能力及治疗反应进行更可靠的评估。

方案

本研究使用了来自阿尔伯特·爱因斯坦医学院/蒙特菲奥里医疗中心生物样本库的去标识化人类生物样本，该样本库经机构审查委员会批准的方案“良性与恶性血液系统疾病分子生物学研究”（IRB方案编号#200536）授权。所有操作均遵循机构伦理指南。所有试剂和设备均列于材料表​中。

1. 患者来源的骨髓或外周血单个核细胞的制备

注意：根据常见的患者样本处理指南，建议穿戴全长实验服和耐撕裂的一次性实验室手套，并在生物安全柜中操作，以防止血液传播病原体暴露。所有接触过患者细胞的移液器吸头和血清移液管在丢弃至生物危害废物容器前，应浸泡在10%的漂白剂溶液中至少30分钟。

1. 实验准备
   1. 将 IMDM 培养基、胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素（Pen-strep）抗生素预热至 37 °C，至少 30 分钟。
   2. 在 4 °C 下过夜解冻半固体培养基。在铺板当天，将瓶子置于室温（RT）下至少 30 分钟，使其升温至室温。
   3. 使用紫外线消毒细胞培养操作台 15 分钟，然后用 70% 乙醇（EtOH）喷洒操作台表面、移液器和试管架。
   4. 准备一个足够大的废液杯，内含 10% 次氯酸钠溶液，用于收集受污染的移液器吸头和血清移液管。
   5. 获取通过密度梯度离心法分离的骨髓或外周血单个核细胞。细胞可在采集当天使用，也可来自冷冻保存的生物样本。
2. 若样本为冷冻状态，需在 37 °C 水浴中快速解冻，直至大部分冰块融化，仅剩少量冰晶。解冻后立即置于冰上。
   注意：患者样本对解冻过程极为敏感。应尽可能快速解冻，并分批处理，以最大限度减少细胞死亡。
3. 将细胞重悬于 5 mL 预热的完全生长培养基中（IMDM 培养基添加 4% FBS 和 1% Pen-Strep）。
4. 使用 AO/PI 染色液和自动细胞计数仪测定细胞浓度和活率。
5. 在室温下以 350 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀，弃去上清液。
6. 将细胞重悬于 5 mL 无菌 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）中。重复离心以沉淀细胞，并弃去上清液。
7. 将细胞重悬于完全生长培养基中，调整浓度至每毫升含 200 万个活细胞。准备足够数量的细胞，用于 6 孔板每孔接种 10 万个细胞。

2. 药物制备与给药处理。

注意：乙胺嘧啶以冻干粉末形式获得，由实验室用二甲基亚砜（DMSO）重悬，配制成100 mM浓度；分装后于−80 °C保存。维奈托克购自供应商，已预先溶解于DMSO中，浓度为10 mM，储存于-20 °C。本实验中，维奈托克与乙胺嘧啶以单次给药方式联合使用。 通过 与溶剂对照DMSO处理组平行进行自由摄取实验。
注意：甲氧苄啶、维奈托克和二甲基亚砜具有生物危害性。仅可在通风橱中操作，穿戴个人防护装备，并格外小心使用。

1. 铺板当天，将药物分装液置于冰上解冻，涡旋混匀后，在台式小型离心机中以最大转速离心30秒。
2. 剧烈涡旋混匀一瓶半固体培养基，直至所有组分完全均一。在生物安全柜中室温静置30分钟，使气泡上升至表面。
3. 将半固体培养基以每份3 mL分装至无菌的15 mL锥形管中。静置30分钟，使气泡上升至表面。多余的半固体培养基分装物可重新冷冻并储存在-20 °C，以备后续使用。
4. 向半固体培养基中加入的药物体积不得超过10 µL。本实验中，维奈托克（venetoclax）和乙胺嘧啶（pyrimethamine）的浓度根据经验确定的协同作用条件进行调整。对照组加入等体积的DMSO。每种实验条件准备两份3 mL的分装样品。
   注意：必须确保所加药物体积可忽略不计，以免影响半固体培养基中药物的最终浓度。
5. 以短脉冲方式涡旋4–5次，使药物充分混入培养基。
   注意：避免长时间持续涡旋细胞混合物，以免导致细胞死亡。
6. 向3 mL半固体培养基分装物中加入100 µL细胞悬液或等体积的200,000个细胞。短脉冲涡旋混匀，直至完全混合均匀。
7. 将一根钝头16 G针头连接至3 mL注射器，并将针头和注射器浸入细胞混合物中。静置30分钟，使气泡上升至表面。

3. 药物处理细胞悬液的铺板。

1. 使用浸没的针头和注射器吸取细胞与药物混合物，注意避免吸入气泡。等待3–5分钟后，再吸取聚集在15 mL锥形管壁上的剩余混合物。
2. 在无菌的6孔板中，将细胞混合物逐滴加入，交替地在板外侧一列的两个孔中滴加较大的液滴。通过轻轻倾斜板并做圆周运动，使混合物均匀铺展至孔底的整个表面。这两个孔作为技术重复。
   注意：如果在加样过程中形成气泡或不慎引入气泡，可使用移液器滤芯吸头轻轻戳破或将气泡移至孔板边缘。孔板中残留的大气泡可能影响克隆的生长。
3. 仅将克隆形成实验混合物加入6孔板的外侧列孔中。对于中间列的各孔，每孔加入5 mL无菌水。在孔中加水可确保足够的湿度，防止半固体培养基干燥。
4. 将孔板置于37 °C、含5% CO₂的培养箱中孵育。每周监测两次细胞生长情况和水分水平。细胞通常在接种后约7天形成肉眼可见的克隆，接种后14–21天之间，孔板应达到75%–80%的融合度。

4. 菌落成像与计数

注意：本方案描述的参数已验证适用于 EVOS M7000 成像系统。这些设置可能需要针对其他微孔板成像系统进行优化或调整以确保兼容性。

1. 从显微镜平台取下保护性滤光片盖。打开显微镜并启动配套软件程序。
2. 将一个漫射光源插入显微镜装置的顶部镜头中。
3. 将培养板放置于平台上，确保A1孔位于左上角。
4. 在成像软件中输入以下对焦设置：
   1. 选择需要成像的容器。本方案中使用的是6孔板。
   2. 将物镜设置为 4X。
   3. 选择透射光（Trans）作为光源，或将显微镜切换至明场模式。
   4. 打开显微镜光源，并使用粗调滑块手动调节光强。对于本方案所用仪器，成像克隆集落的最佳光强范围约为0.03。
   5. 若仪器具备自动对焦功能，请使用该功能进行对焦。如有需要，可进一步通过手动微调对焦设置进行优化。
5. 输入以下自动图像采集设置：
   1. 选择每个孔中需要成像的整个区域。
   2. 设置自动图像采集从孔中心开始，以螺旋方式向外扩展至孔边缘。
   3. 选择自动对焦设置，使仪器在每个孔中重新对焦。
   4. 选择将每个孔中的原始图像进行拼接/合并。
   5. 选择对图像进行水平和垂直方向的翻转。
   6. 设置数据保存选项，以同时保存“拼接图像”和“合并图像”。
   7. 运行自动板扫描。本方案所用仪器的运行速度为1.5分钟/孔。
   8. 取出培养板，将保护性滤光片盖重新盖回显微镜平台，关闭显微镜并退出软件。
   9. 成像完成后，使用拼接合并后的孔图像，人工计数每个孔中的总克隆数以及髓系和红系亚型克隆数。
6. 根据以下形态学特征定义克隆：
   1. 当一个独立克隆或克隆簇与其他细胞群体之间的距离大于或等于其自身长度时，视为独立存在；若距离小于此阈值，则归为同一克隆计数。
   2. 红系克隆应具有明显色素沉着，呈深红色。这些克隆表现为边缘清晰、密集生长的单一细胞群或细胞簇。由生长缓慢的未成熟细胞群组成的小型红系克隆归类为CFU-E；由更成熟细胞群组成的较大克隆归类为BFU-E。
   3. 髓系克隆中的细胞透明度较高，颜色较浅。髓系克隆分布较为弥散，边缘不清晰。髓系克隆通常以单一细胞群形式生长，较少形成簇状，尽管偶尔也可观察到簇状结构。无论何种情况，均归类为CFU-GM。
   4. 同时包含红系和髓系亚型的混合克隆归类为CFU-GEMM。

5. 细胞收获与冻存以用于后续分析 通过 流式细胞术

1. 开始前请执行以下步骤：
   1. a. 将荧光激活细胞分选缓冲液（FACS缓冲液，由DPBS/4% FBS组成）和冻存培养基（FBS/10% DMSO）置于37 °C水浴中预热至少30分钟。
2. 向每个孔的表面加入5 mL预热的FACS缓冲液。将培养板置于37 °C培养箱中孵育至少30分钟，以溶解半固体培养基。
3. 使用5 mL移液器充分重悬细胞，并转移至无菌的50 mL锥形管中。
4. 用5 mL预热的FACS缓冲液洗涤每个孔3次，并将全部液体转移至50 mL锥形管中。
5. 通过涡旋振荡进行短时间快速振荡4–5次，充分重悬细胞，然后在室温下以400 × g离心10分钟以收集细胞沉淀。若离心后未见明显沉淀，则细胞仍悬浮于半固体培养基中。此时不吸取上清液，向管中额外加入10–15 mL DPBS以进一步稀释半固体培养基，并充分重悬。如有必要，于37 °C孵育10–15分钟以完全溶解培养基，然后再次离心收集细胞沉淀。
6. 吸除上清液，将细胞重悬于10 mL FACS缓冲液中，在室温下以400 × g离心10分钟以收集细胞沉淀。
7. 将细胞重悬于冻存培养基中，按每支冻存管300万个细胞进行分装。将冻存管置于程序降温盒中，在-80 °C保存24小时，以实现1 °C/min的降温速率。
8. 尽快将冻存管转移至液氮中长期保存。
   注意：样品若长时间保存于-20 °C，细胞活力将显著下降。为长期保存，必须及时将细胞转移至液氮中。

结果

图1 展示了从患者样本分离到菌落计数与菌落形态分析的克隆形成实验流程。 图2 显示在明场显微镜下成像菌落的关键设置。 图3 和 图 4 展示单个患者来源样本在接种后13天的集落形成代表性图像。在 图3，使用自动荧光成像系统对菌落进行成像。根据形态特征，通过人工计数菌落对图像进行评分。 图3A 显示了对照组DMSO处理细胞与单用乙胺嘧啶、单用维奈托克以及联合用药处理条件的比较。图中所示为计数结果 图3B 与单用乙胺嘧啶治疗相比，该患者在乙胺嘧啶单药治疗下总体菌落数量较少，并且与维奈托克联用时表现出协同作用，提示单药治疗或联合治疗...

讨论

本文所述方案概述了一种利用患者原代骨髓和外周血样本进行集落形成单位（CFU）检测的优化工作流程，特别关注维持细胞活力以及确保集落生长的可重复性。在使用患者来源样本时，该方案中的多个步骤对于获得可靠的集落形成至关重要。快速解冻冻存的单个核细胞后立即降温，对保持细胞活力极为关键，因为解冻过程过长会显著增加脆弱的原代样本中的细胞死亡。在洗涤和重悬步骤中轻柔操作同样重要，因为过度的机械应力会降低祖细胞存活率，并对集落形成产生不利影响。

制备甲基纤维素基半固体培养基也需要谨慎操作。必须充分混匀，以使细胞因子和添加剂在培养基中均匀分布；同时，在接种前让混合物静置，有助于消除可能干扰集落生长的气泡。此外，将细胞均匀混入半固体基质中，对于确保技术重复间接种密度的一致性至关重要。细胞在培养基中的均匀分布可最大限度减少集落形成过程中的变异性，并提高不同实验条件之间的可重复性。

当菌落形成不理想时，故障排除策略尤为重要。菌落数量减少可能由初始细胞活力低、细胞计数不准确或细胞在半固体基质中混合不充分所致。在此类情况下，可通过在铺板前验证细胞活力、调整...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
平头16G针头	STEMCELL Technologies	28110	用于分注和铺制甲基纤维素培养基（MethoCult media）
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	细胞计数仪
CHT4 计数室（细胞计数载片）	Revvity	CHT4-SD100-002	细胞计数仪专用载片
二甲基亚砜	Fisher Bioreagents	BP231-100	用于药物重悬及细胞冻存液配制
杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）	Sigma-Aldrich	D8537	用于细胞培养
200度乙醇	Decon Laboratories, Inc.	2701	用于细胞培养表面的消毒灭菌
EVOS M7000 成像系统	ThermoFisher Scientific	AMF7000	用于集落及培养板成像
胎牛血清	BenchMark	100-106	细胞培养与冻存用培养基添加剂
IMDM改良培养基	Cytiva	SH30228.01	适用于患者样本处理的富集型培养基
鲁尔锁头式3 mL注射器	BD	309657	用于分注和铺制甲基纤维素培养基（MethoCult media）
MethoCult H4435 富集型培养基	STEMCELL Technologies	04435	基于甲基纤维素的半固体培养基，用于集落形成实验
多孔6孔板	FALCON	353046	用于集落形成实验的铺板
Nikon Eclipse TS2FL 倒置三目相差荧光显微镜	Coastal Microscopes	51623	用于集落形态学成像与表征
青霉素-链霉素双抗（Pen Strep）	Gibco	15140-122	细胞培养用抗生素添加剂
乙胺嘧啶	Sigma-Aldrich	46706	经FDA批准的抗叶酸药物
UltraPure纯化蒸馏水	Invitrogen	10977-015	用于集落形成实验的铺板
维奈托克	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	经FDA批准的化疗药物
ViaStain AOPI染色液	Revvity	CS2-0106	用于活细胞计数的活力染色剂