本方案概述了一种诱导来源于患者骨髓和外周血单个核细胞的人类造血干细胞和祖细胞分化的实验流程。该检测采用支持红系和髓系谱系定向的半固体培养基，并结合标准化的定量指标，对集落进行可重复的分类，用于临床前药物表征。
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本文内容
摘要
摘要
集落形成单位（CFU）检测是研究血液系统疾病（包括骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML））的一项基础性技术。该检测利用添加了特定细胞因子组合的半固体培养基，支持红系和髓系祖细胞的三维生长及谱系特异性分化。然而，来源于患者的外周血和骨髓样本在实验操作中存在技术挑战，表现为细胞活力降低、对操作处理更为敏感，以及集落生长的变异性较大。此外，现有针对集落识别与计数的指导原则在集落大小和谱系类型的定义上存在显著差异，限制了不同研究之间的可重复性。本文所述方案针对来自MDS和AML患者样本的造血干细胞和祖细胞的生长与分化进行了优化，强调轻柔的细胞操作、患者样本的无菌处理、优化的培养条件以及根据患者来源细胞特性调整的培养时间。本方案为使用患者来源样本进行CFU检测提供了实用的操作框架，并建立了统一的标准化指标，以实现血液系统恶性肿瘤研究中集落计数与分析的一致性。
引言
造血是一个受到严密调控的过程，其中定位于骨髓微环境中的造血干细胞（HSCs）可分化产生所有成熟的血细胞谱系。通过一系列层级性的分化事件，HSCs 生成多能祖细胞，这些祖细胞逐步定向分化为红系、髓系和淋巴系谱系，最终成熟为具有功能的循环血细胞。该过程受到骨髓微环境内协调的信号通路以及细胞内在的转录和表观遗传调控机制的共同调控。这些调控通路的异常，尤其是 HSCs 中遗传或体细胞突变的累积，可能破坏正常的分化过程，导致异常祖细胞的克隆性扩增。此类改变最终可能导致以无效造血和血细胞减少为特征的血液系统疾病，包括骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）1，2，3，4，5。
集落形成单位（CFU）实验是一种成熟可靠的 体外 评估造血干细胞和祖细胞（HSPCs）分化潜能的技术。最初开发为一种短期检测方法，用于测量造血祖细胞的增殖能力和分化潜能6,7,8
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方案
本研究使用了来自阿尔伯特·爱因斯坦医学院/蒙特菲奥里医疗中心生物样本库的去标识化人类生物样本，该样本库经机构审查委员会批准的方案“良性与恶性血液系统疾病分子生物学研究”（IRB方案编号#200536）授权。所有操作均遵循机构伦理指南。所有试剂和设备均列于材料表中。
1. 患者来源的骨髓或外周血单个核细胞的制备
注意：根据常见的患者样本处理指南，建议穿戴全长实验服和耐撕裂的一次性实验室手套，并在生物安全柜中操作，以防止血液传播病原体暴露。所有接触过患者细胞的移液器吸头和血清移液管在丢弃至生物危害废物容器前，应浸泡在10%的漂白剂溶液中至少30分钟。
- 实验准备
- 将 IMDM 培养基、胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素（Pen-strep）抗生素预热至 37 °C，至少 30 分钟。
- 在 4 °C 下过夜解冻半固体培养基。在铺板当天，将瓶子置于室温（RT）下至少 30 分钟，使其升温至室温。
- 使用紫外线消毒细胞培养操作台 15 分钟，然后用 70% 乙醇（EtOH）喷洒操作台表面、移液器和试管架。
- 准备一个足够大的废液杯，内含 10% 次氯酸钠溶液，用于收集受污染的移液器吸头和血清移液管。
- 获....
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结果
图1 展示了从患者样本分离到菌落计数与菌落形态分析的克隆形成实验流程。 图2 显示在明场显微镜下成像菌落的关键设置。 图3 和 图4 展示单个患者来源样本在接种后第13天的集落形成代表性图像。在 图3使用自动荧光成像系统对菌落进行成像，随后根据菌落形态通过人工计数进行图像评分。 图3A 显示了对照DMSO处理组与单用乙胺嘧啶、单用维奈托克以及联合用药处理组的比较。图中所示为计数结果 图3B 与单用乙胺嘧啶治疗相比，该患者在乙胺嘧啶单药治疗下总体菌落数量较少，并且与维奈托克联用时表现出协同作用，提示单药治疗或联合治疗可能是抑制该.......
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讨论
本文所述方案概述了一种利用患者原代骨髓和外周血样本进行集落形成单位（CFU）检测的优化工作流程，特别关注维持细胞活力以及确保集落生长的可重复性。在使用患者来源样本时，该方案中的多个步骤对于获得可靠的集落形成至关重要。快速解冻冻存的单个核细胞后立即降温，对保持细胞活力极为关键，因为解冻过程过长会显著增加脆弱的原代样本中的细胞死亡。在洗涤和重悬步骤中轻柔操作同样重要，因为过度的机械应力会降低祖细胞存活率，并对集落形成产生不利影响。
制备甲基纤维素基半固体培养基也需要谨慎操作。必须充分混匀，以使细胞因子和添加剂在培养基中均匀分布；同时，在接种前让混合物静置，有助于消除可能干扰集落生长的气泡。此外，将细胞均匀混入半固体基质中，对于确保技术重复间接种密度的一致性至关重要。细胞在培养基中的均匀分布可最大限度减少集落形成过程中的变异性，并提高不同实验条件之间的可重复性。
当菌落形成不理想时，故障排除策略尤为重要。菌落数量减少可能由初始细胞活力低、细胞计数不准确或细胞在半固体基质中混合不充分所致。在此类情况下，可通过在铺板前验证细胞活力、调整.......
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披露
作者无其他利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了由美国国立卫生研究院（NIH）资助的爱因斯坦-洛克菲勒-纽约城市大学艾滋病研究中心（Einstein-Rockefeller-CUNY Center for AIDS Research）提供的试点基金支持，项目编号：P30 AI124414。爱因斯坦 FACS 核心设施及共享仪器的使用获得了以下NIH基金的支持：P30CA013330、S10OD026833 和 S10OD032169。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 平头16G针头 | STEMCELL Technologies | 28110 | 用于分注和铺制甲基纤维素培养基（MethoCult media） |
| Cellometer Auto 2000 | Nexelcom Bioscience | 26407 | 细胞计数仪 |
| CHT4 计数室（细胞计数载片） | Revvity | CHT4-SD100-002 | 细胞计数仪专用载片 |
| 二甲基亚砜 | Fisher Bioreagents | BP231-100 | 用于药物重悬及细胞冻存液配制 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline） | Sigma-Aldrich | D8537 | 用于细胞培养 |
| 200度乙醇 | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | 用于细胞培养表面的消毒灭菌 |
| EVOS M7000 成像系统 | ThermoFisher Scientific | AMF7000 | 用于集落及培养板成像 |
| 胎牛血清 | BenchMark | 100-106 | 细胞培养与冻存用培养基添加剂 |
| IMDM改良培养基 | Cytiva | SH30228.01 | 适用于患者样本处理的富集型培养基 |
| 鲁尔锁头式3 mL注射器 | BD | 309657 | 用于分注和铺制甲基纤维素培养基（MethoCult media） |
| MethoCult H4435 富集型培养基 | STEMCELL Technologies | 04435 | 基于甲基纤维素的半固体培养基，用于集落形成实验 |
| 多孔6孔板 | FALCON | 353046 | 用于集落形成实验的铺板 |
| Nikon Eclipse TS2FL 倒置三目相差荧光显微镜 | Coastal Microscopes | 51623 | 用于集落形态学成像与表征 |
| 青霉素-链霉素双抗（Pen Strep） | Gibco | 15140-122 | 细胞培养用抗生素添加剂 |
| 乙胺嘧啶 | Sigma-Aldrich | 46706 | 经FDA批准的抗叶酸药物 |
| UltraPure纯化蒸馏水 | Invitrogen | 10977-015 | 用于集落形成实验的铺板 |
| 维奈托克 | Selleck Chemical LLC | 50-136-6419 | 经FDA批准的化疗药物 |
| ViaStain AOPI染色液 | Revvity | CS2-0106 | 用于活细胞计数的活力染色剂 |
参考文献
- Papaemmanuil E, Gerstung M, Malcovati L, Tauro S, Gundem G, Van Loo P, et al. Clinical and biological implications of driver mutations in myelodysplastic syndromes. Blood. 2013;122(22):3616-27.
- Desai P, Mencia-Trinchant N, Savenkov O, Simon MS, Cheang G, Lee S, et al. Somatic mutations precede acute myeloid leukemia years before diagnosis. Nat Med. 2018;24(7):1015-23.
- Gaulin C, Kelemen K, Arana Yi C. Molecular pathways in clonal hematopoiesis: from the acquisition of somatic mutations to transformation into hematologic neoplasm. Life (Basel). 2022;12(8):1135.
- Menssen AJ, Walter MJ. Genetics of progression from MDS to secondary leukemia. Blood. 2020;136....
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